العمل بدعم من المنح من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCD ومؤسسة شميت لRP.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول وصقلها على أساس معيار المشعة وغير المشعة طرق التهجين في الموقع ، وضعت مسبقا من قبلنا وغيرها للكشف عن الأنواع نص واحد أو اثنين في أنسجة الدماغ 1-7. البروتوكول هو موضح أدناه وبطول إجمالي يبلغ 2 أو 3 أيام ، اعتمادا على عدد من انقطاع الإجرائية التي اختارها المستخدم النهائي. جميع الخطوات المفصلة أدناه هي يجب أن تتم في درجة حرارة الغرفة ، مع استثناء من خطوة riboprobe التهجين ويغسل بعد التهجين. يمكن العثور على حلول والمخازن اللازمة لجميع الخطوات التي ينطوي عليها هذا الأسلوب في نهاية هذا البروتوكول. 1. تحضير الأنسجة وSectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس والدماغ يخضع لاستخراج بسرعة ، ووضعها في قالب من البلاستيك ذات حجم كاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي الدماغ مع الأنسجة تيك المتوسطة التضمين والمكان بسرعة قالب من البلاستيك في حمام dry-ice/alcohol لتجميد السريع. ويمكن تخزين الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ناظم البرد ، وجمع أجزاء الدماغ 2 أو 3 في الشريحة على Superfrost اتهم بلس الشرائح. وينبغي أن سماكة المقاطع تكون 10-12 ميكرومتر. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 2. إعداد أعمدة G50 Sephadex لتنقية دقق &quot;يمكن شراؤها الأعمدة Sephadex من مصادر تجارية ، ومع ذلك ، ونحن نقدم أدناه بديلا منخفض التكلفة لتوليد الأعمدة ، والتي سوف تكون مطلوبة من أجل تنقية التحقيق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كمية كافية من مسحوق هيدرات G50 Sephadex مع ريبونوكلياز خالية من المياه المعالجة DEPC ، (على سبيل المثال ، 2 غرام من مسحوق في 100 مل من المياه المعالجة DEPC) ، مزيج لفترة وجيزة حل وتخزين في درجة حرارة الغرفة لترسيب Sephadex الزائدة G50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف (الطبقة العليا من المياه) في أعقاب هطول الأمطار G50 Sephadex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر العملية أكثر من 3 -- 5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي ، وإعادة تعليق G50 Sephadex الحل في المخزن TE (نسبة 1:1) ، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تعقيمها الصوف الزجاجي في محقنة معقمة 1 مل وضغط عليه مع المكبس لجعل طبقة المدمجة في الجزء السفلي ، ثم ضع الحقنة في أنبوب 15 مل فالكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا في حل G50 Sephadex في TE. ملء الحقنة / عمود مع هذا الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العمود لمدة 30 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء حتى يتم شغلها بالكامل تقريبا العمود مع حبات G50 Sephadex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر من 200 تطبيق عازلة عمود إلى عمود الغسيل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة. التدفق من خلال تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر من 200 تطبيق عازلة تمنع العمود إلى العمود وتدور لمدة 2 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة 4-5 مرات للتوازن العمود. ويمكن تخزين الأعمدة في 4 درجات مئوية حتى مع استخدام إذا أغلقت Parafilm. </li></ol> 3. التوسيم وتنقية Riboprobes التفاصيل أدناه نحن جيل وتنقيتها من riboprobe واحد. لdFISH ، سيتم إعداد كل مسبار تنطوي على المنهجية نفسها ، إلا أنه سوف يكون المسمى واحدا من التحقيقات مع digoxigenin (DIG) الموسومة UTP في حين أن غيرها من البيوتين الموسومة UTP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مركزة (&gt; 150 نانوغرام / ميكرولتر) وتنقيته من حل [كدنا] خطي الفائدة إما لتوليد شعور (مراقبة) أو riboprobes العقاقير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 1.5 مل microfuge ، إضافة 0،5-1 ميكروغرام من المنقى قالب [كدنا] ، 2 ميكرولتر من 5X التحقيق العازلة العلامات ، 1 ميكرولتر من 10X DIG (أو البيوتين) وضع العلامات المزيج ، 0.5 ميكرولتر من RNasin و 1 ميكرولتر من بوليميريز RNA المناسبة ، وجلب الحجم النهائي من الحل إلى 10 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية (DEPC المعالجة) للمياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي النقال (الأسهم ، و 20 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 39 ميكرولتر من العمود حظر العازلة إلى الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد G50 Sephadex العمود لتنقية التحقيق. تحقيقا لهذه الغاية ، إضافة 50 ميكرولتر العازلة حظر على العمود وتدور لمدة 10 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة 2-3 مرات للتوازن العمود (يتم استرداد أي الكامل 50 ميكرولتر تطبيقها على العمود بعد دورة الطرد المركزي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حل التحقيق الى موقف G50 Sephadex ، العمود أنبوب microfuge جديدة في الجزء السفلي من العمود ، وتدور لمدة 3 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة للحصول على تنقية 50 ميكرولتر من محلول riboprobe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم جودة وإنتاجية riboprobe المسمى باستخدام معيار الفورمالديهايد - RNA agarose هلام ، أو معمل ملف. </li></ol> 4. بعد التثبيت ، وتهجين أستلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أجزاء من الفريزر -80 درجة مئوية ، والسماح لدرجة حرارة الغرفة لكي تتوازن. لاحقا ، احتضان المقاطع في البرد ، طازجة من صنع حل بارافورمالدهيد 3 ٪ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لفترة وجيزة في المقاطع عhosphate مخزنة المالحة (PBS) مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى المقاطع الكحول من خلال سلسلة قياسية (70 ، 95 ، و 100 ٪ ، 2 دقيقة لكل منهما) ، والسماح لهم الجو الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في حل أستلة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع 3 مرات في SSPE 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى المقاطع مرة أخرى من خلال سلسلة الكحول القياسية المذكورة أعلاه ، والسماح لهم الجو الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حجم كاف من حل التهجين وإضافة كل riboprobes إلى الحل (تركيز التحقيق : 1 نغ / لكل ميكرولتر التحقيق). يتم تحديد الحجم الكلي للتهجين الحل استنادا إلى عدد من الفروع لتكون المهجنة (16 ميكرولتر من محلول التهجين في المقطع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حجم كاف من الحل التهجين إلى شرائح الأنسجة وساترة ضمان عدم تراكب فقاعات الهواء الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في حامل الشرائح المعدنية. حامل تزج في حمام الزيت المعدنية التي وضعت في 65 درجة مئوية خلال الليل. ضمان coverslips تواجه التصاعدي (أي الجانب الوحشي من صاحب الشريحة يجب أن تكون على اتصال مع الجزء السفلي من الحاويات المعدنية النفط). </li></ol> 5. بعد التهجين الغسلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، وإزالة بعناية حامل الشرائح المعدنية من حمام الزيت وشطف لفترة وجيزة في الكلوروفورم لإزالة فائض المعروض النفطي من الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في إيجاد حل لSSPE 2X 5-10 دقيقة. ينبغي Coverslips فصل من الشرائح في حين حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى حل جديد SSPE 2X ، والاحتفاظ بها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع في محلول يحتوي على 2X SSPE formamide زائد 50 ٪. وينبغي أن درجة حرارة هذا الحل يتطابق مع درجة الحرارة المستخدمة في إجراء التهجين بين عشية وضحاها. تبقي الشرائح في هذا الحل لمدة 1.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع إلى حل SSPE 0.1X قبل تحسنت إلى درجة الحرارة نفسها من الخطوة التهجين. المقاطع في احتضان هذا الحل لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة ل30 دقيقة إضافية. </li></ol> 6. كشف والتخيل من Riboprobes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى TNT العازلة التي تمت إضافة 0.3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين ، لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في غسل العازلة TNT ، و 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قلم داكو ، رسم جيدا في جميع أنحاء المنطقة التي تحتوي على أقسام الدماغ. الأهم من ذلك ، ينبغي توخي الحذر لضمان أن المقاطع لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر من 150 تطبيق عازلة TNB إلى كل الشرائح ، واحتضان المقاطع في هذا الحل لمدة 30 دقيقة ، في غرفة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة حل TNB الشرائح التي تميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على TNB البيروكسيداز - DIG مترافق المضادة للأجسام المضادة ، والشرائح تخزينها في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة. وينبغي تحديد تركيز الأجسام المضادة بشكل فردي لكل نص الفائدة قبل القيام dFISH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر من 150 تطبيق اليكسا 594 - مترافق tyramide تعمل على حل كل شريحة ، وتخزينها في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة. وينبغي إعداد هذا الحل وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في احتضان TNT العازلة التي تمت إضافة 0.3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 -- 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر من 150 تطبيق عازلة TNB لكل شريحة ، والاحتفاظ بها في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة حل TNB الشرائح التي تميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على TNB البيروكسيداز - مترافق المضادة للأجسام المضادة البيوتين ، والشرائح تخزينها في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 150 ميكرولتر من اليكسا 488 - مترافق حل tyramide العمل إلى شرائح وقطاعات احتضان لمدة 1 ساعة. وينبغي إعداد هذا الحل وفقا لتوصيات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من محلول هويشت (1:1000 العازلة في مادة تي ان تي) إلى أقسام والاحتفاظ بها في غرفة رطبة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المقاطع في المخزن TNT ؛ 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام ساترة مع مضان المتوسطة المتوافقة مع تركيب (على سبيل المثال ، أو إطالة Vectashield antifade). </li></ol> 7. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 ، ونحن هنا تظهر النتائج التي تم الحصول عليها dFISH ممثل في الدماغ فينش حمار وحشي. وأظهرت photomicrographs الحصول عليها من nidopallium caudomedial (NCM) ، والتماثلية الطائر المغرد من القشرة السمعية الثدييات. والمهجنة أقسام الدماغ مع riboprobe biotinylated الموجهة ضد parvalbumin (A) ، وهو علامة لسكان شبه الخلايا العصبية المثبطة ، والتي تحمل علامات DIG ريبوالمسبار الموجهة ضد zenk نشاط الجينات التي تعتمد على (B) ، وهي علامة موثوق بها لأغنية يحركها الخلايا العصبية. C) تراكب من (أ) و (ب) يبين عدد السكان من الخلايا العصبية المثبطة التي يتم تفعيلها من خلال التجربة السمعية. السهام والنصال تشير الخلايا المسمى حصرا مع كل من riboprobes اثنين ، وتظهر الخلايا العصبية النجمية ممثل شارك في التعبير عن كل من المحاضر في المصالح. مقياس بار = 25 ميكرومتر.

<ol>
	<li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+methods+and+applications.">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li><li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization.">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li><li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+and+signal+amplification:+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization.">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li><li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digoxigenin:anti-digoxigenin+(DIG)+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system.">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li><li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes:+facts+and+artifacts.">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li><li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization.">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li><li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds.">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li><li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+participate+in+the+brain's+response+to+birdsong+auditory+stimulation.">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li><li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds.">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li><li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression.">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol.">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة كيفية تنظيم neurochemically وظيفيا في المخ الفقاريات ، وتحديد كيفية تأثير سلوكيا ذات الصلة المحفزات الحسية من آلات الجيني للخلايا العصبية في الدماغ البالغ 80-10. وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح في أنسجة المخ من الجرذان والفئران والطيور المغردة ، ولكن نتوقع أن هذا البروتوكول سوف تكون قابلة للتكيف بسهولة إلى أجزاء الدماغ التي تم الحصول عليها من مجموعة واسعة من الأنواع الفقارية ، وربما غير الأنسجة العصبية. وقد وردت تفاصيل الضوابط الرئيسية المطلوبة للحصول على نتائج موثوقة والأمثل إشارة نطاق واسع في أماكن أخرى في مجموعتنا 11 ، 12.

الحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة العمود الغسيل : 10 مم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 0.15 M كلوريد الصوديوم ، EDTA 0.05 ملم ، و 50 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال ، 0.1 ٪ SDS في 50 DEPC المياه المعالجة مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة حجب العمود : 10 مم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، EDTA 0.1 ملم في 50 DEPC المياه المعالجة مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TNT العازلة : 60 مل من 1 M - تريس حمض الهيدروكلوريك ، و 18 مل من كلوريد الصوديوم M 5 و 1.8 مل من تريتون X - 100 في 600 مل من المياه المعالجة DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TNB العازلة : 100 مم تريس حمض الهيدروكلوريك ، و 8.3 ميكروغرام / BSA ميكرولتر ، 0.15 M كلوريد الصوديوم وتريتون 3 ٪ X - 100 في DEPC معاملة المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE العازلة : 10 مم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ملي EDTA زائد 1 ، ودرجة الحموضة 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل أستلة : 2.7 مل من ثلاثي إلإيثانولامين زائد 0.5 مل من أنهيدريد الخل في 200 مل من المياه المعالجة DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل التهجين : formamide 50 ٪ ، 2X SSPE و 2 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال ، 1 ميكروغرام / ميكرولتر BSA و 1 ميكروغرام / ميكرولتر بولي (أ) في المياه DEPC المعاملة. انها تحتاج الى 16 لتر لكل قسم. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

نحن هنا تصف نسخة معدلة من مضان مزدوجة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (dFISH) الأسلوب الأمثل للكشف عن two mRNAs الفائدة في أقسام المخ الطازجة المجمدة. وقد استخدمت بنجاح مجموعتنا هذا النهج لدراسة الجينات المشتركة والقوانين. بشكل أكثر تحديدا ، وقد استخدمنا هذا الأسلوب dFISH لاستكشاف منظمة التشريحية والخصائص الكيميائية العصبية ، وتأثير التجربة الحسية في الدوائر المركزية الحسية ، في قرار خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول في أنسجة المخ من الجرذان والفئران والطيور المغردة لكن من المتوقع أن تكون قابلة للتكيف بسهولة إلى الأنواع الفقارية الأخرى ، فضلا عن مجموعة من الأنسجة غير العصبية. في هذا الفيلم يقدم لنا دليلا مفصلا للخطوات الرئيسية لهذا الإجراء.

Watch this Scientific Journal Video about Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections at JoVE.com

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

هذا البروتوكول ينطوي على غير المشعة<em&gt; في الموضع</em&gt; إجراء التهجين التي تمكن من تحديد وقت واحد من الأنواع النص الثاني ، في قرار خلية واحدة ، في أقسام المخ رقيقة من الفقاريات.

نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

double-fluorescence-in-situ-hybridization-in-fresh-brain-sections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

16.0K Views.  University of Rochester. هذا البروتوكول ينطوي على غير المشعة في الموضع إجراء التهجين التي تمكن من تحديد وقت واحد من الأنواع النص الثاني ، في قرار خلية واحدة ، في أقسام المخ رقيقة من الفقاريات.

Video: Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

تصميم و تركيب وميكرودريفي الترا ضوء الميكانيكية للتسجيلات العصبية المزمنة في الحيوانات الصغيرة

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

إصابة الحبل الشوكي الكامل وبروتوكول تشريح الدماغ لاحقا Wholemount<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في اليرقات البحر الجلكى

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

سريع<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين باستخدام قليل النوكليوتيد تحقيقات على مسبوقة لامتصاص العرق دماغ الفئران مع السيروتونين متلازمة

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

الجمع بين نقرا الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

عزل من الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة المخ البشري الطازج

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

مزدوجة الحقن المباشر للدم في ماغنا سيستيرنا كنموذج للنزف تحت العنكبوتية

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

الجمع بين التهجين الفلوري المتعدد في الموقع مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية على أقسام دماغ الفأر الطازجة المجمدة أو الثابتة

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

تصميم و تركيب وميكرودريفي الترا ضوء الميكانيكية للتسجيلات العصبية المزمنة في الحيوانات الصغيرة

إصابة الحبل الشوكي الكامل وبروتوكول تشريح الدماغ لاحقا Wholemount

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة

سريع

الجمع بين نقرا الإسفار

توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي

عزل من الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة المخ البشري الطازج

مزدوجة الحقن المباشر للدم في ماغنا سيستيرنا كنموذج للنزف تحت العنكبوتية

الجمع بين التهجين الفلوري المتعدد في الموقع مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية على أقسام دماغ الفأر الطازجة المجمدة أو الثابتة