Umwandlung von Fettsäuremethylestern durch Verseifung für die U^k'₃₇-Paläothermometrie

Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst

Das Produkt ein Bio solvent-Extraktion, eine totale Lipid-Extrakt (TLE), ist oft eine komplexe Mischung von Hunderten, wenn nicht Tausende von verschiedenen Verbindungen. Der Forscher ist oft nur eine Handvoll Verbindungen interessiert oder bei Interesse an vielen, müssen möglicherweise unerwünschte Bestandteile zu entfernen, die "im Weg" sind oder Co eluierenden. Beispielsweise werden die Konzentrationen der einzelnen Substanzen in einer Probe oft auf einen Gaschromatographen, gekoppelt an eine Flamme ionisierende Detektor (GC-FID) bestimmt, da die Beziehung zwischen FID Reaktion (in pA) und die Menge der Verbindung in einer Probe (z.B. ng/µL) sowohl lineare als auch empfindlich ist. Der GC-Teil des Instruments trennt verschiedene Verbindungen in einer Probe, basierend auf ihren Siedepunkt, chemische Struktur und Affinität zu einer festen Phase, die je nach Anwendung ändern können. Das Ergebnis ist ein Chromatogramm (Abb.Ure 1) zeigt die Trennung der verschiedenen chemischen Bestandteile in Zeit als auch die relative Konzentration (berechnet als die Fläche unter der Kurve). Aber elutes manchmal mehr als eine Verbindung aus dem GC zu einem Zeitpunkt (Abb.Ure 1). Probereinigung ist in diesem Fall erforderlich, bevor Verbindungen sicher quantifiziert werden können.

Abbildung 1. Ein Chromatogramm zeigt die Trennung der verschiedenen chemischen Bestandteile über Zeit und ihre relative Konzentration (Fläche unter der Kurve). Co Medikamentenfreisetzende und getrennte Peaks werden angezeigt.

FAMEs (Fettsäure-Methylester) sind wichtige Bestandteile der terrestrischen und marinen Mikroben und sind häufig benutzt, in Verbindung mit genetische Techniken, mikrobielle Vielfalt der Ökosysteme in Antike und moderne Systeme beschreiben. Das Vorhandensein von FAMEs in einer Probe ist jedoch nicht immer hilfreich. Aufgrund ihrer ähnlichen Größe und Chemie eluieren Co FAMEs genannt Alkenonatescommonly mit langkettige Alkyl-Ketonen, genannt Alkenone (Abbildung 2). Die Verteilung der Alkenone in einer Probe bezieht sich Informationen zur Temperatur der Meeresoberfläche auf Zeit und/oder den Ort, dass die Probe entnommen wurde, und deren genaue und präzise Charakterisierung ist wichtig.

Verseifung ist eine häufige Reinigung Technik, FAMEs in Fettsäuren, so verändern ihre chemischen Eigenschaften genug zu entfernen aus Co Elution mit Alkenone (Abbildung 3) umgewandelt. Saponificationis eine Form der Hydrolyse. In Hydrolyse wird Wasser verwendet, um Moleküle gespalten. Verseifung ist eine Hydrolyse, die in der Gegenwart eine Basis, wie z. B. Kalilauge (KOH) beschleunigt wird. KOH löst sich in K⁺ und OH^– im Wasser. Die Hydroxid-Anion (OH^-, negativ geladene Ionen) verleiht dem leicht, positiv geladenen tertiären Kohlenstoffatom das Herzstück des Ruhmes (Abbildung 3, oben). Aber diese chemischen Konfiguration ist instabil, (Kohlenstoff hat zu viele andere Atome verbunden) und die Dehydrierung (ROH^–) ist ausgeschlossen. Aber die H Basis konjugiert Vertreibung bildet schnell bewegt sich die Dehydrierung Alkohol Methanol und Fettsäure-Kaliumsalz (Abbildung 3, Mitte) zu bilden. An dieser Stelle wurde die beanstandete FAME (Alkenoate), eine Chemikalie umgewandelt, die nicht mehr mit ihm zusammen elutes. Allerdings will man auch FAME Chemie analysieren, können sie zurückgefordert werden durch die Zugabe von Säure (HCl) zur Lösung, bis pH ~ 2 erreicht. Bei diesem pH-Wert ist das Kaliumsalz der Fettsäure aufgeteilt, um eine Carbonsäure und ionische Salz (KCl; bilden Abbildung 3, unten).

Abbildung 2 . Die chemischen Strukturen von einer Alkenone mit 37 Kohlenstoffatomen und 2 Doppelbindungen (oben) und die damit verbundenen alkenoate Ruhm (unten).

Abbildung 3 . Eine schematische Darstellung der Verseifung von Palmitinsäure mit Kalilauge (KOH) zu einer erhöhten Rate von Hydrolyse (http://www.mpbio.com/).

1. Setup und Vorbereitung der Materialien

1. Erhalten Sie eine totale Lipid Extrakt (TLE) Lösemittelextraktion Verfahren (Ultraschall, Soxhlet oder beschleunigte Lösungsmittel Extraktion (ASE)).
2. Bereiten Sie eine Lösung von 2 N KOH in 5 % H₂O in Methanol.
   1. KOH und Methanol können chemische Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalien sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
      1. Die molare Masse von KOH ist ~ 56 amu 1 Mol Oh^– für jedes Mol KOH nachgeben. Also, um eine 2 N-Konzentration zu erreichen, lösen Sie 112 g KOH in 0,95 L reines Wasser und 0,05 L Methanol auf.
      2. Beachten Sie, dass die Auflösung der KOH in Wasser exotherm ist und eine große Menge an Wärme schafft. Achten Sie darauf, die KOH-Pellets hinzufügen, das Wasser langsam um eine heftige Reaktion zu vermeiden.
   2. 112 g KOH Pellets in 0,95 L reines Wasser auf der Platte eine automatische Rühren auflösen.
   3. Fügen Sie 0,05 L Methanol, sobald alle die KOH wird aufgelöst, um die Auflösung der organischen Biomarker in der wässrigen Lösung zu unterstützen.
3. Bereiten Sie eine Lösung von 6 N Salzsäure (HCl) in H₂O.
   1. HCl kann chemischen Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalie sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
   2. HCl kommt in der Regel konzentriert als 13 N. So erzeugt eine 1:1 Mischung von HCl und reines Wasser eine 6,5 N Mischung von HCl, das ist nahe genug, um 6 N für die Zwecke dieses Experiments.
      1. Achten Sie darauf, das Wasser der HCl hinzu und nicht anders herum, als Zugabe von Wasser zu konzentrierter HCl ist exotherm und erzeugt Wärme. Dadurch kann HCl zu spritzen.
   3. Gießen Sie langsam und vorsichtig 100 mL HCl in ein Becherglas mit 100 mL reines Wasser, wirbeln die Mischung zwischen Ergänzungen von HCl.
4. Bereiten Sie eine Lösung von 5 % NaCl (Kochsalz) in H₂O.
   1. NaCl kann chemische Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalie sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
   2. Berechnen Sie und wiegen Sie die Masse des Salzes ~ 1 L 5 % Lösung (w/w) machen musste. 1 L Wasser wiegt ~ 1 kg oder 1000 g. 50 g NaCl in 950 mL aufgelöst gibt somit eine 5 % ige Lösung (50 g + 950 g = 1000 g, 50 g / 1000 g = 0,05 oder 5 %).
   3. Sanft Reinwasser auf eine automatische rühren Platte 50 g NaCl hinzu und warten Sie, bis es aufzulösen.
5. Erhalten Sie die folgenden Materialien: 2 sauber und verbrannt (550 ° c für 6 h) 40 mL Borosilikatglas Fläschchen mit PTFE-Gefütterte Mütze; einem wärmenden Ofen oder Heizung Blöcke; verbrannt (550 ° c für 6 h) Borosilikatglas Pipetten und Birnen; pH-Band (saurer Bereich); Hexan (Hexan chemische Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalie sollte Optima Grade oder gleichwertig sein).

(2) Methoden

1. Beginnen Sie mit den getrockneten TLE (mit Ester) in einem der 40 mL-Borosilikat-Glas-Fläschchen.
2. Fügen Sie ca. 10 mL 2 N KOH TLE und Cap.
3. Hitze im Ofen oder auf einem Heizblock zu 60 ˚C für 2,5 h, Spalten die Esterbindung (Abbildung 3).
4. Die Probe vom Herd nehmen und auf Zimmertemperatur abkühlen lassen.
5. Die TLE (Abbildung 3) ca. 10 mL 5 % NaCl-Lösung hinzufügen. Dies hilft, die Schnittstelle zwischen der wässrige und organische Phase (um hinzugefügt werden) von Schäumen. Deckel und schütteln Sie kurz.
6. Fügen Sie 6 N HCl zu den gesalzenen TLE tropfenweise hinzu, bis pH 2 O^– zum Protonate erreicht ist und bilden Sie das Endprodukt eine stabile Carbonsäure (Abbildung 3; Verwendung pH-Papier zum Testen) zu. Wenn die TLE gefärbt wurde, möglicherweise eine Verschiebung in der Farbe, die zeitgleich mit pH 2.
7. Die gesäuerte Lösung, die jetzt frei von Ester ist fügen Sie etwa 20 mL Hexan hinzu. Verschließen und kräftig schütteln, für 5 s, organische Verbindungen aus dem Wasser zu extrahieren.
8. Dürfen Sie bis wässrige und organische Phasen völlig getrennt einstellen. Salze, Ionen, Wasser und nicht umgesetztes HCl bleiben in der wässrigen Phase. Organische Verbindungen sind jetzt in das Hexan.
9. Ungefähr 75 % von den Überstand Hexan mit einer Pipette zu entfernen und in die anderen 40 mL Borosilikatglas Durchstechflasche zu verzichten.
10. 2.7-2.9 zweimal, Hinzufügen von etwa 10 mL Hexan jedes Mal zu wiederholen.
11. Entsorgen Sie übrig gebliebene wässrige Mischung in einem richtigen Abfallbehälter.
12. Beschriften Sie das Fläschchen mit Hexan und Ester-freie Organics "TLE - verseift."

Diese Reinigung produziert eine TLE Ester, die gemeinsam mit der Alkenone Medikamentenfreisetzende möglicherweise kostenlos. Allerdings erzeugt die Reinigung Karboxylhaltige Säuren, die auf Instrumente zur häufig Alkenone Konzentrationen aufgrund ihrer geringen Volatilität Proben injiziert werden kann nicht. Beispielsweise der Siedepunkt von Hexan, ein 6-Carbon Kohlenwasserstoff ist 68 ° c, aber der Siedepunkt von seiner Säure (Hexanoic Säure) ist 205 ˚C. Die meisten GC zugänglich Biomarker haben von 20 bis 35 c-Atomen (Siedepunkt nimmt in der Regel mit einer wachsenden Zahl von Atomen) aus, bis die meisten GC Temperaturprogrammen rund 300 ˚C. Carbonsäuren injiziert eine GC schnell ansammeln und Buchten, Inlet Liner und dem vorderen Ende der Spalten zu ruinieren. Um diese Säuren zu entfernen, muss die Probe zuerst eine andere Reinigung Technik Trennung durch Säulenchromatographie unterziehen.

Wie bereits erwähnt, ist Verseifung in organische Geochemie Labs verbreitet, um Fettsäure-Methylester (Kamera) von Alkenone, genannt Alkenoates, die zusammen mit Alkenone am Gaschromatographen (Abb.Ure 1) eluieren zu entfernen. Verseifung dient auch zur "freien" Fettsäuren "verpflichtet", Sediment oder Makromoleküle. Den Abbau und die Erhaltung von organischen Stoffen und Biomarker in Sedimenten umfasst die Beseitigung von funktionellen Gruppen (N, O und S) und die eventuelle Polymerisation von einzelnen Biomarker in Makromoleküle und/oder die Adsorption von Biomarkern und Makromoleküle auf mineralischen Untergründen. Nicht alle Biomarker in einer Einstellung werden gebunden und das Verhältnis von gebundenen freien Biomarker wechselt nach Einstellung und Sediment Alter Gründen noch nicht vollständig geklärt. Verseifung, manchmal bei Temperaturen höher als die hier diskutierten (> 200 ° c), wird verwendet, um diese gebundenen Biomarker in dem Bestreben, ihnen, ihrer Quelle und die Mechanismen, die für ihre gebundenen Natur beschreiben frei.