Conversión de ésteres metílicos de ácidos grasos por saponificación para U^k'Paleothermometry₃₇

Fuente: Laboratorio de Jeff Salacup - Universidad de Massachusetts Amherst

El producto de una extracción con disolvente orgánico, un extracto total de lípidos (TLE), es a menudo una mezcla compleja de cientos, si no miles, de diferentes compuestos. El investigador a menudo sólo está interesado en un puñado de compuestos o, si está interesado en muchos, puede necesitar eliminar a componentes no deseados que se encuentran "en el camino" o co liberador. Por ejemplo, las concentraciones de compuestos individuales en una muestra se determinan a menudo en un cromatógrafo de gases acoplado a un detector de ionización de llama (GC-FID), porque la relación entre la respuesta de la FID (en pA) y la cantidad de compuesto en una muestra (p. ej., ng/μL) es lineal y sensible. La porción de GC del instrumento separa diferentes compuestos en una muestra basada en su punto de ebullición, estructura química y afinidad con una fase sólida que puede cambiar según la aplicación. El resultado es un cromatograma (Figure 1), mostrando la separación de componentes químicos diferentes en tiempo, así como su concentración relativa (calculado como el área bajo la curva). Sin embargo, a veces más de uno compuesto elutes de la GC en un tiempo (Figure 1). En este caso, purificación de las muestras es necesario antes de compuestos pueden ser cuantificados con confianza.

Figura 1. Un cromatograma que muestra la separación de componentes químicos diferentes en el tiempo y su concentración relativa (área bajo la curva). Se muestran picos de co liberador y separados.

Famas (ésteres metílicos de ácidos grasos) son importantes componentes de los microbios marinos y terrestres y son de uso frecuente, conjuntamente con técnicas genéticas, para describir la diversidad microbiana del ecosistema en sistemas modernos y antiguos. Sin embargo, la presencia de famas en una muestra no siempre es útil. Debido a su tamaño y química similar, FAMAS llamados alkenonatescommonly Co fin de eluir con cetonas de alquilo de cadena larga, llamadas alkenones (figura 2). La distribución de alkenones en una muestra relaciona información sobre temperatura superficial del mar en el tiempo y el lugar fue tomada la muestra, y así su caracterización exacta y precisa es importante.

Saponificación es una técnica de purificación común utilizada para convertir famas en ácidos grasos, cambiando así sus características químicas lo suficiente para eliminarlos de la elución con alkenones (figura 3). Saponificationis una forma de hidrólisis. En hidrólisis, el agua se utiliza para dividir moléculas. Saponificación es una hidrólisis que se acelera en presencia de una base como hidróxido de potasio (KOH). KOH se disuelve en K⁺ y OH^– en el agua. El anión hidróxido (OH^-, ion con carga negativa) se agrega al átomo de carbón terciario un poco, positivamente cargado en el corazón de la fama (figura 3, arriba). Sin embargo, esta configuración química es inestable, (carbono se enlaza a muchos otros átomos) y el alcóxido (ROH^–) es expulsado. Pero el H del conjugado base esta forma de expulsión rápidamente se traslada al alcóxido para formar el alcohol metanol y sal de potasio de ácidos grasos (figura 3, medio). En este punto, el ofender la fama (alkenoate) ha sido transformada en un producto químico que ya no elutes conjuntamente con él. Sin embargo, si se desea también analizar la química de la fama, ellos pueden ser reclamados por la adición de ácido (HCl) a la solución, hasta que llegue a pH ~ 2. A este pH, la sal de potasio del ácido graso se divide para formar un ácido carboxílico y una sal iónica (KCl; En la figura 3, abajo).

Figura 2 . Las estructuras químicas de un Alkenone con 37 átomos de carbono y 2 enlaces dobles (parte superior) y sus asociados alkenoate Fama (parte inferior).

Figura 3 . Un esquema de la saponificación del ácido palmítico con hidróxido de potasio (KOH) para aumentar la tasa de hidrólisis (http://www.mpbio.com/).

1. configuración y preparación de materiales

1. Obtener un total de lípidos extracto (TLE) utilizando un método de extracción por solvente (sonicación, Soxhlet o extracción acelerada de disolvente (ASE)).
2. Preparar una solución de KOH 2 N 5% H₂O metanol.
   1. KOH y metanol pueden adquirirse en tiendas de productos químicos. Estos productos químicos deben ser puro y libre de hidrocarburos.
      1. La masa molar de KOH es 56 uma produciendo 1 mol de OH^– por cada mol de KOH. Por lo tanto, para lograr una concentración de N 2, disolver 112 g de KOH en 0,95 L de agua pura y 0,05 L de metanol.
      2. Tenga en cuenta que la disolución de KOH en agua es exotérmica y genera una gran cantidad de calor. Tenga cuidado de agregar a los pellets KOH en el agua lentamente para evitar una reacción violenta.
   2. Se disuelven 112 g de pellets KOH en 0,95 litros de agua pura en una placa de agitación automática.
   3. Añadir 0,05 L de metanol una vez todo el KOH se disuelve para ayudar en la disolución de los biomarcadores orgánicos en la solución acuosa.
3. Preparar una solución de ácido de clorhídrico 6 N (HCl) en H₂O.
   1. Ácido clorhídrico puede adquirirse en tiendas de productos químicos. Este producto químico debe ser puro y libre de hidrocarburos.
   2. Viene generalmente ácido clorhídrico concentrado como 13 N. Así, una mezcla 1:1 de HCl y agua pura produce una mezcla de N 6.5 de HCl, que es cerca de 6 N para los propósitos de este experimento.
      1. Asegúrese de agregar el ácido clorhídrico al agua y no al revés, como añadir agua al ácido clorhídrico concentrado es exotérmico y genera calor. Esto puede causar ácido clorhídrico para chapotear.
   3. Suavemente y lentamente vierta 100 mL de ácido clorhídrico en un vaso de precipitados con 100 mL agua pura, la mezcla entre las adiciones de ácido clorhídrico se arremolinan.
4. Preparar una solución de 5% NaCl (sal de mesa) en H₂O.
   1. NaCl se puede comprar en tiendas de productos químicos. Este producto químico debe ser puro y libre de hidrocarburos.
   2. Calcular y pesar la masa de sal para hacer ~ 1 L de solución al 5% (w/w). 1 L de agua pesa ~ 1 kg o 1.000 g. Así, 50 g de NaCl disuelto en 950 mL da una solución al 5% (50 g + 950 g = 1.000 g, 1.000 g/50 g = 0.05 o 5%).
   3. Añadir 50 g de NaCl en agua pura en una placa de agitación automática y esperar a que se disuelva.
5. Obtener los siguientes materiales: 2 limpio y quemado (550 ° c por 6 h) viales de vidrio borosilicato de 40 mL con tapa forrada de PTFE; un horno de calentamiento o calentamiento bloques; pipetas de vidrio de borosilicato de combustión (550 ° c por 6 h) y bulbos; cinta de pH (rango ácido); Hexano (hexano puede adquirirse en tiendas de productos químicos. Este producto químico debe Optima grado o equivalente).

2. métodos

1. Comience con el TLE seco (que contienen ésteres) en uno de los viales de borosilicato vidrio 40 mL.
2. Añadir aproximadamente 10 mL de KOH N 2 a la TLE y la tapa.
3. Calentar en el horno o en un bloque de calentamiento a 60 ° c por 2,5 h para hender el enlace éster (figura 3).
4. Retirar la muestra del fuego y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
5. Añadir aproximadamente 10 mL de la solución de NaCl al 5% a la TLE (figura 3). Esto ayuda a mantener la interfase entre la fase acuosa y orgánica (a) de formación de espuma. La tapa y agítela brevemente.
6. Añadir 6 N HCl a la TLE salada gota a gota hasta alcanzar pH 2 al protonate O^– y formar el producto final, un ácido carboxílico estable (figura 3; uso papel de pH para probar). Si el TLE fue coloreado, puede haber un cambio de color coincidiendo con pH 2.
7. Añadir aproximadamente 20 mL de hexano a la solución acidificada, que es ahora libre de ester. La tapa y agitar vigorosamente durante 5 s para extraer compuestos orgánicos del agua.
8. Permite establecer hasta las fases acuosas y orgánicas completamente separada. Sales, iones, agua y HCl permanecen en la fase acuosa. Los compuestos orgánicos son ahora en el hexano.
9. Eliminar aproximadamente el 75% del hexano sobrenadante con una pipeta y dispensar en el otro frasco de vidrio de borosilicato de 40 mL.
10. Repetición de 2.7-2.9 dos veces, agregar aproximadamente 10 mL de hexano cada vez.
11. Deseche la mezcla acuosa sobrante en un recipiente de residuos adecuado.
12. Etiqueta el frasco que contiene hexane y materia orgánica libre de ester «TLE - saponificado.»

Esta purificación produce un ELT de ésteres que pueden ser co liberador con el alkenones. Sin embargo, la purificación produce ácidos carboxílicos, que no puede ser inyectados en instrumentos comúnmente utilizados para analizar las muestras para las concentraciones de alkenone debido a su baja volatilidad. Por ejemplo, el punto de ebullición del hexano, un hidrocarburo de 6 carbonos, es 68 ° c, pero el punto de ebullición de su ácido hexanoico es 205 ° c. Más marcadores biológicos susceptibles de GC tienen de 20 a 35 átomos de carbono (punto de ebullición aumenta generalmente con un número creciente de átomos), y programas de temperatura GC mayoría parada alrededor de 300 ° c. Ácidos carboxílicos inyectados rápidamente un GC se acumulan y arruinar las entradas, trazadores de líneas de entrada y la parte delantera de las columnas. Para eliminar estos ácidos, la muestra debe primero someterse a otra separación técnica de purificación mediante cromatografía en columna.

Como se mencionó anteriormente, saponificación se utiliza comúnmente en los laboratorios de geoquímica orgánica para eliminar ésteres metílicos del ácido graso (famas) de alkenones, llamado alkenoates, que co fin de eluir con alkenones en Cromatógrafos de gases (Figure 1). Saponificación se utiliza también para ácidos grasos "libres" "obligados" a los sedimentos o macromoléculas. La degradación y la preservación de materia orgánica en los sedimentos y consiste en la remoción de grupos funcionales (N, O y S) y la polimerización final de biomarcadores individuales en macromoléculas o la adsorción de macromoléculas en superficies minerales y. Biomarcadores no todos en un límite de ajuste que se convierten y la relación entre biomarcadores bound gratis pueden cambiar al ajuste y la edad de sedimentos por razones aún no totalmente explicado. Saponificación, a veces a temperaturas superiores a los aquí expuestos (> 200 ° c), se utiliza para liberar a estos biomarcadores consolidados en el esfuerzo para describir a ellos, su origen y los mecanismos responsables de su naturaleza consolidado.