Ultraschall-Extraktion von Lipid-Biomarkern aus Sediment

Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst

Das Material, bestehend aus der lebenden "Bio" Anteil an jedem Ökosystem (Blätter, Pilze, Rinde, Gewebe; Abbildung 1) unterscheidet sich grundlegend von dem Material der unbelebten "anorganischen" Aktie (Felsen und ihre konstituierenden Mineralien, Sauerstoff, Wasser, Metalle). Organisches Material enthält Kohlenstoff verbunden zu einer Reihe anderer Kohlenstoff und Wasserstoff Moleküle (Abbildung 2), die sie von anorganischem Material unterscheidet. Carbon ermöglicht breite Valenz (03:56) es, bis zu vier separate kovalente Bindungen mit benachbarten Atomen, in der Regel C, H, O, N, S und P. bilden Es kann bis zu drei kovalente Bindungen auch teilen, mit einem anderen Atom, wie z. B. die Dreifachbindung in der oft giftige Zyanid oder Nitril, Gruppe. Seit 4,6 Milliarden Jahren führte diese Flexibilität zu einer erstaunlichen Vielfalt an chemischen Strukturen, die sich in Größe, Komplexität, Polarität, Form und Funktion unterscheiden. Der wissenschaftlichen Bereich der organische Geochemie befasst sich mit der Identifizierung und Charakterisierung des Gesamtangebots von nachweisbaren organischen Verbindungen, Biomarker, produziert von Leben auf diesem Planeten, sowie andere, durch geologische Zeit genannt.

Abbildung 1. Organisches Material, wie Bäume, Blätter und Moos, unterscheiden sich chemisch und visuell von anorganischem Material wie Pflaster.

Extraktion durch Anwendung von Ultraschall ist die einfachste und kostengünstigste Methode zur Gewinnung von insgesamt Lipid (TLE) Auszug aus einer Probe, und die Erholung verbunden mit dieser Methode ist auf Augenhöhe mit anderen immer raffinierten Techniken. Ein Ultraschallbad verwendet, um eine Probe in ein Fläschchen in Anwesenheit von organischen Lösungsmittel zu agitieren. Biomarker in der Probe enthaltenen lösen sich in der organischen Phase, basierend auf den Regeln der Löslichkeit, die mit organischen Verbindungen, in erster Linie durch die Polarität von der Biomarker und das Lösungsmittel gesteuert werden. Dies wird durch die sogenannte zusammengefasst, "wie löst" auszuschließen, wobei relativ apolaren Biomarker (solche, die ausschließlich C und H; Isopren) in apolaren Lösungsmitteln auflösen (wie Hexan, Polarität = 0,1) und weitere polare Biomarker (solche mit O, N, S, P, Glycerin-Dialkylcarbonat Glycerin-Tetraethers (GDGT)) in mehr polaren Lösungsmitteln auflösen (wie Methanol oder Dichlormethan, Polarität = 5.1 und 3.1). In der Tat ist dies der erste Schritt in dem die Trennung der verschiedenen Gruppen von Biomarkern über die Einführung einer Reihe von Lösungsmitteln aus apolaren, polar, jede Gewinnung von immer mehr polaren Verbindungen aus der Probe erreicht werden kann. Lösungsmittel aus sequenziellen Auszüge aus einem Ziel Sediment können so einzeln analysiert oder kombiniert, um eine totale Lipid-Extrakt (TLE) bilden, der später gereinigt werden können.

(1) die notwendigen Materialien zu sammeln.

1. Proben (Blätter, Schmutz, Pilzen, Rinde, Gewebe), in der Regel eingefroren, gefriergetrocknet, zerkleinert und homogenisiert vor Extraktion, extrahiert in Gruppen um die Effizienz zu maximieren. Drei Proben zu extrahieren.
2. Abhängig von der Größe der Stichprobe können mit einem Volumen von 4-60 mL Fläschchen verwendet werden. Für dieses Experiment Borosilikat Glasvials (40 mL) und Lösungsmittel sicher Kappen verwendet. Fläschchen, Borosilikatglas Pipetten und mit einem Gewicht von Dosen sollten verbrannt bei 550 ° C 6 h vor der Entfernung der möglichen organischen Verunreinigungen gewährleistet werden.
3. Dichlormethan und Methanol sind häufig in den meisten organischen Geochemie Laboratorien. Sie werden einzeln zur Lab-Tools und Glaswaren vor Gebrauch abspülen. Eine Mischung von Dichlormethan (DCM) in Methanol (MeOH; 9:1) ist in vielen Labors verwendet, um effizient Biomarker mit einer breiten Palette von Polaritäten zu extrahieren. Lösungsmittel sollte frei von organischen Verunreinigungen sein.
4. Verwenden Sie ein Wasserbad Beschallung bei Raumtemperatur. Eine Reihe von Sonikator Größen und Beschallung mit oder ohne Hitze sind wichtige wissenschaftliche Ausrüstung Handel erhältlich.
5. Vial-Racks, die wasserdicht sein sollte, werden in Beschallung Bad platziert werden.
6. Lösungsmittel genehmigte chemische Haube.

2. Vorbereitung der Probe

1. Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf den Labormaßstab und dann Tara verbrannt.
2. Spülen Sie die Labor-Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse der Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen, und zeichnen Sie die Masse.
   1. Die Masse der Probe variiert je nach seinen Gehalt an organischer Substanz. Schlanke Material relativ organischer Substanz (marine Schlamm) erfordern mehrere Gramm, während organische Substanz Reiches Material (Blattgewebe) viel weniger erfordern.
3. Übertragen Sie das gesamte Material in der Waage Dose in einer verbrannt, vorher gewogen und etikettiert Fläschchen. Verschließen Sie das Fläschchen, dann verwerfen Sie mit einem Gewicht von Zinn zu.
4. Führen Sie Schritte 2.1-2.3 für jede Probe extrahiert werden.

3. Gewinnung

1. Mit einem Pre-verbrannt-Pipette und Birne, ~ 20 mL der DCM:MeOH (9:1) Mischung in jedes Fläschchen zu übertragen (Fläschchen sollte etwa halb voll sein). Rekapitulieren Sie Fläschchen, bevor ich auf nächste Probe, so dass die flüchtige Lösungsmittel nicht verdunsten.
   1. Die Volatilitäten der DCM und MeOH sind unterschiedlich. Verdunstung der Lösungsmittel Extraktion durch entdeckelte Probenfläschchen hat die Fähigkeit, seine Polarität, und somit die Extraktion zu ändern.
2. Legen Sie die Probengefäße in einem wasserdichten Vial Rack.
3. Überprüfen Sie, dass das Niveau des Wassers in der Beschallung Badewanne nur tief genug, um die Probengefäße bis an die Spitze des Lösungsmittels Extraktion zu versenken. Zuviel Wasser kann dazu führen, dass die Fläschchen zu schweben; zu wenig Wasser reagiert die Proben aus wird richtig aufgeregt.
4. Legen Sie das Fläschchen-Rack mit den Proben in es direkt in die Anwendung von Ultraschall-Bad.
5. Beschallen Sie für 30 min bei Raumtemperatur.
6. Entfernen Sie Probenrack aus Sonikator. Wenn Sedimente zu extrahieren, lassen Sie es für 30 min erlauben absetzen auftreten. Wenn eine andere Gruppe von Proben zu extrahieren, geben Sie Sonikator zu diesem Zeitpunkt.
7. Entfernen Sie die DCM:MeOH Mischung aus der Extraktion-Durchstechflasche mit einem Pre-verbrannt-Pipette und Birne, und Einfügen in ein anderes vorab gewogen, Pre-verbrannt, und mit der Bezeichnung 40-mL-Fläschchen.
8. Wiederholen Sie die 3.1-3.7 3 X für alle Proben.
9. Lassen Sie entnommene Proben in ihre Flaschen, Kappen, und in der Kapuze, locker mit Folie bedeckt trocknen. Als "extrahierten Rückstand" beschriften und speichern.
10. Beschriften Sie die kombinierten Extrakte für jede Probe als 'TLE'.

Am Ende der Extraktion zeigt sich ein insgesamt Lipid-Extrakt (TLE) für jede Probe. Jede Durchstechflasche enthält die extrahierbare organische Substanz vom Sediment, Boden oder Pflanzengewebe. Diese TLEs können jetzt analysiert und ihre chemischen Bestandteile identifiziert und quantifiziert.

Verschiedene Klassen von Biomarkern vermitteln Informationen über spezifische Aspekte des Systems Erde. Zum Beispiel in den Kinderschuhen, organische Geochemie befasste sich hauptsächlich mit der Bildung, Migration und Veränderung von Erdöl, und viele der chemischen Werkzeuge verwenden organische Geochemiker heute basieren auf dieser ersten Untersuchungen. Es war durch die Untersuchung einer Klasse von Verbindungen genannt Isoprenoids, nachdem ein sich wiederholendes fünf Kohlenstoff-Muster (Abbildung 2), dass Wissenschaftler entdeckten Erdöl umfasste die chemisch veränderte Überreste der alten Primärproduzenten, wie Plankton im Meer (Umwandlung in Öl, Abbildung 3) oder Torfmoore auf dem Land (Kohle, Abbildung 4). Chemiker der großen Ölgesellschaften verwendet die Verhältnisse von einer Vielzahl von Verbindungen, jedes mit seinen eigenen bekannten Kurs der Veränderung zu schätzen, wie alt Erdöl war, woher es stammt, und ob es Wert auszunutzen war. Heute werden neue Biomarker, identifiziert und charakterisiert in moderne und antike Proben analysiert in organische Geochemie Labors auf der ganzen Welt entdeckt. Viele der heutigen Anwendungen versuchen, Umweltinformationen von Biomarkern in modernen Proben (Blätter, Boden, Mikroben, Wasserproben, etc.), um die Biomarker-Dienstprogramm, um alte Ablagerungen in einer Bemühung, die Klimazonen, die Umgebungen und die Ökosysteme der Vergangenheit rekonstruieren verlängern erhalten zu extrahieren. Beispielsweise die Verteilung von einer Gruppe von Biomarkern genannt Glycerin-Dialkylcarbonat Glycerin-Tetraethers (kurz GDGTs), produziert von einer Suite von Archaeen und Bakterien, fanden sich in modernen Sedimenten in einer vorhersagbaren Weise in Reaktion auf die Luft oder Wasser Temperatur ändern. Die Verteilung dieser Biomarker in alten Sedimenten kann daher verwendet werden, oder durch eine Reihe von Sedimenten des bekannten Alters, um Luft und Wasser zu rekonstruieren Temperatur mehrere Millionen Jahre zurück.

Abbildung 2: Isopren besteht aus fünf Kohlenstoffatomen und zwei Doppelbindungen. Beim addieren in Biosynthese Reaktion können sie komplexe Moleküle, die Diagnose auf das Vorhandensein des Lebens bilden. Z. B. 2, 6,10,15,19-Pentamethyleicosane, häufig in Cyanobakterien Matten gefunden.

Abbildung 3. Beleuchtung von Plankton auf Malediven. Copyright PawelG Foto geteilt.

Abbildung 4. Torfmoor in 4.500 m Höhe in den ecuadorianischen Anden. Copyright Dr. Morley Read