Tests für gentechnisch veränderte Lebensmittel

Quelle: Labors von Margaret Workman und Kimberly Frye - Depaul University

Gentechnische Veränderung von Lebensmitteln wurde ein kontroverses Thema diskutierten Gründen über Umwelt-und Arbeitsschutz. Dieses Experiment zeigt technisches Verständnis der wie Essen DNA genetisch identifiziert wird, zulassend Entscheidung machen über die Sicherheit und potenziellen Gefahren der Verwendung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) in Nahrungsmittel erzogen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um Lebensmittel DNA test für das Vorhandensein von gentechnisch veränderte DNA in Lebensmitteln zu verstärken. Vorhandensein von spezifischen DNA-Bänder detektiert mittels Gelelektrophorese extrahierten Nahrung DNA durch ein 3 % Agarosegel, eine Konzentration dicht genug, um den Bands von DNA mit der gentechnisch veränderten DNA trennen zu ziehen. Mehrere Steuerelemente werden im Elektrophorese-Verfahren verwendet, um DNA Test Lebensmittel (Werk Primer) erfolgreich entzogen und um bekannte Beispiele beider genetisch verändert DNA (gekauft gentechnisch veränderte DNA) zu gewährleisten und nicht gentechnisch veränderte DNA (zertifizierte GVO-Lebensmittelkontrolle gekauft).

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) identifiziert Sequenzen von DNA, die in der GV-Pflanze eingefügt wurden. Im Gegensatz zu Proteinen DNA ist ein relativ stabiles Molekül, so DNA-Fragmente von hoch verarbeiteten waren isoliert werden und sind ausreichend intakt durch PCR verstärkt werden. Gentechniker nur eine kleine Anzahl von regulatorischen Sequenzen (Promotor und Terminator-Sequenzen) verwenden, um die Expression der eingefügten Gene steuern, und so diese Sequenzen sind üblich, die Mehrheit von gv-Pflanzen. Die beiden Sequenzen identifiziert in diesem Verfahren sind zwei der häufigsten regulatorischen Sequenzen, 35 s-Promoter-gen aus Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV) und Nopaline-Synthase (NOS)-Terminator-gen aus Agrobacterium Tumefaciens.

PCR bezieht sich wiederholende Zyklen, jeweils bestehend aus Vorlage Denaturierung, Grundierung Glühen und Erweiterung des geglühten Primers von Taq -DNA-Polymerase. Nachdem DNA aus der Nahrung extrahiert wird, wird ein Thermocycler verwendet, um schnell manipulieren, Temperatur, verursacht die Phasen der PCR-Zyklen.

Die denaturierenden Phase tritt ein, wenn Proben auf 94 ° C, wodurch die DNA-Stränge zu trennen sich schnell erhitzt werden. Schnelle Abkühlung auf 59 ° C ermöglicht Zündkapseln Tempern, die getrennten DNA-Stränge, dann Erhitzen auf 72 ° C für Taq -DNA-Polymerase, die Primer, vollständige Kopien von jeder DNA-Strang und Abschluss einer thermischen Zyklus zu verlängern.

Die amplifizierte DNA kann dann durch eine Agarosegel mit Elektrophorese schieden die DNA in sichtbare Bänder für die Identifizierung des Gens 35 s-Promoter und der Nein-Terminator ausgeführt werden. Verstärkte DNA in Brunnen an einem Ende des Gels, geladen mit einem gekauften laden Farbstoff, der hilft, belasten die Probe Auflösung in den umliegenden Puffer zu verhindern. Der Laden-Farbstoff bietet auch einen visuellen, also die Bewegung der DNA kann gesehen werden, während der Elektrophorese in der Farbstoff "Front." Die Elektrophorese funktioniert mit Hilfe eines elektrischen Stromes in Kathode und Anode enden getrennt. DNA in das Gel am Ende am nächsten an der Kathodenseite der Kammer geladen wird, und die negative Ladung der DNA zieht es in die Anode Ende des Saales und der Agarose durchgezogen ist. Größere Sequenzen von DNA (erhöhte Anzahl der Basenpaare) nicht so leicht durch Agarose bewegen und werden sich trennen früh, während die kleinere Sequenzen weiter unten das Gel in Richtung Anode Ende reisen können.

Ein Färbung Prozess hilft durch die Bindung an die DNA, um Kontrast zwischen dem Hintergrund Gel und den Ufern der DNA zur besseren Visualisierung der Ergebnisse hinzufügen. Zur Verfügung mit bekannter Orten für die verschiedenen Größen von DNA-Sequenzen, die jedes Gel Test für das Vorhandensein oder Fehlen der 35 s-Promoter und Nein-Terminator-Gene analysiert werden kann.

Steuerelemente werden verwendet, um sicherzustellen, dass DNS ordnungsgemäß extrahiert wird und einen Vergleich auf Lebensmittelproben zu ermöglichen. Gekaufte Pflanze Grundierung wird jede Probe zu Nukleinsäuren üblich, alle Pflanzen hinzugefügt. Dies ermöglicht eine Qualitätskontrolle auf die DNA-Extraktion, weil jede Pflanze extrahierte DNA während der PCR mit diesem Primer ausgedehnt werden und auch auf das Gel gesehen werden, sollte nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist. Gekaufte Primer für die 35 s und Nein Gene werden als Positivkontrolle verwendet, um DNA-Bänder auf dem Gel für die genetische Veränderung zur Verfügung zu stellen. Wenn das GVO-positiv-Vorlage-Steuerelement nicht verstärken wird, gibt es ein Problem mit der PCR-Reaktion und ein GVO-negatives Ergebnis aus der Test-Nahrung nicht vertraut werden kann. Auch ist ein zertifizierter GVO-Lebensmittel gekauft und als Negativkontrolle verwendet, um anzuzeigen, wie DNA Trennung aussieht, wenn kein gentechnisch verändertes Material vorhanden ist.

(1) Extraktion von DNA aus Lebensmittelproben

1. 500 µL der gekauften PCR Mischung Matrix hinzu kommt jeweils die 2 Schraubverschluss-Röhrchen mit eine Transferpipette oder 200-1.000 µL einstellbarer Lautstärke Mikropipette. Pipette rauf und runter mit dem Pipettieren zwischen jeder Aliquote gleichmäßig mischen die PCR-Matrix.
2. Beschriften Sie ein Schraubverschluss Röhrchen "GVO-freien" und "Test".
3. 0,5 g zertifizierten GVO-Lebensmittel Abwiegen und steckte es in den Mörtel.
4. 2,5 mL destilliertem Wasser hinzugeben und Schleifen mit Pistill für 2 min um einen Brei zu bilden.
5. Fügen Sie eine weitere 2,5 mL destilliertem Wasser und weiter Schleifen mit Stößel bis Gülle glatt genug zu pipettieren wird.
6. Pipettieren 50 µL Boden Gülle, der Schraubverschluss-Röhrchen mit 500 µL des PCR-Vormischung mit der Bezeichnung "non-GMO" mit 50 µL Mark auf einem abgestuften pipettieren. Rohr zu rekapitulieren.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,6, die Probe Essen vorzubereiten.
8. Pipettieren 50 µL Boden Test Lebensmittel Gülle mit dem Schraubverschluss Rohr mit der Bezeichnung "test". Rohr zu rekapitulieren.
9. Wirbel der GVO-Lebensmittel und Test-Röhren PCR für 1 min und Platz Rohre im Wasserbad 95 ° C für 5 min. Wenn keine Wirbel verfügbar ist, wechseln Sie das Rohr mehrmals um zu mischen vor dem Einlegen in Wasserbad.
10. Rohre in einer Zentrifuge für 5 min zu platzieren. Ein solide Pellet sollten an der Unterseite des Rohres bilden. Wenn die Pellets nicht nach 5 min, Zentrifuge wieder für 2 min Intervalle bis Pellet Formen gebildet wird.
11. Rohre können sofort für die PCR verwendet oder für bis zu 1 Woche im Kühlschrank gelagert.

2. Einrichten von PCR-Reaktionen

1. PCR-Röhrchen 1 – 6 Nummer und sie initial. Die Zahlen sollten folgende Rohr-Inhalte, die in Tabelle 1aufgeführten entsprechen.
2. Legen Sie jedes beschriftete PCR-Röhrchen in eine Reaktionscup Halterung mit Kappen offen.
3. Fügen Sie mithilfe einen frischesten Tipp für jede zusätzlich 20 µL des Primers an jedem PCR-Röhrchen auf Tabelle 1 angegeben. GAP-Röhren.
4. Fügen Sie mithilfe einen frischen Tipp für jedes Rohr 20 µL DNA-Probe auf Tabelle 1 angegeben, um jedes PCR-Röhrchen, dass auf jeden Fall nur aus der Überstand pipette und das solide Pellet am unteren Rand der Rohre zu vermeiden.
5. Nachdem jede DNA-Probe in das entsprechende PCR-Röhrchen pipettiert, verwenden Sie Pipette, um DNA und Grundierung mischen, indem Sie sanft auf und ab pipettieren; rekapitulieren Sie Röhren.
6. PCR-Röhrchen in Thermocycler und programmieren Sie der Cycler für:
   Anfängliche denaturieren: 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min.
   Verstärkung: 40 Zyklen bei 94 ° C für 1 min (denaturieren), 59 ° C für 1 min (Tempern) und 72 ° C für 2 min (Erweiterung).
   Letzte Erweiterung: 1 Zyklus bei 72 ° C für 10 Minuten.
   Halten: 4 ° C auf unbestimmte Zeit.

3. 3 % Agarose-Gel-Vorbereitung

1. Verwendung von Lab oder Klebeband, sicher Klebeband von der offenen Enden der Gel-Tiefziehschiene. Stellen Sie sicher, dass Klebeband an den Rändern des Fachs zu verhindern, dass flüssige Agarose Austritt verschlossen ist.
2. 3 g Agarose in einen Erlenmeyerkolben 250 mL oder größeren abwiegen.
3. Hinzugeben Sie 100 mL 1 X TAE-Puffer (aus Konzentrat hergestellt oder gekauft).
4. Mit einer magnetischen Heizplatte mit Stir Bar, erhitzen Sie das Becherglas bis Agarose im Puffer vollständig aufgelöst und die Lösung kocht und Wendungen deutlich. Alternativ kann eine Mikrowelle verwendet werden, indem man Becher in Ofen und Heizung für 30 s Abständen, mit einem rühren Stab mischen alle 10 s, wiederholen, bis die Mischung kocht und Wendungen deutlich.
5. Kehren Sie ein 50-mL-Erlenmeyerkolben in die Öffnung des 250-mL-Flasche als ein Reflux, verhindert das Verdampfen Agarose-Lösung handeln.
6. Agarose-Lösung auf 60 ° C abkühlen lassen, und 30-50 mL in jede versiegelte Gel-Tiefziehschiene gießen.
7. Legen Sie einen Gel-Kamm in das erste paar der Kerben Gel Brunnen zu erstellen.
8. Lassen Sie das Gel vollständig abkühlen, bevor Sie die Band und Kamm entfernen. Gel wird zu festigen und drehen von klar zu trüben, wenn fertig, ca. 10-20 min.

4. die Elektrophorese der PCR-Produkte

1. Legen Sie eine vorgefertigte 3 % Agarosegel auf ein Gel-Tablett oder verwenden ein Gel-Tablett, das verwendet wurde, um eine gegossene 3 % Agarose-Gel gegossen.
2. Schieben Sie Gel-Tiefziehschiene in der Elektrophorese-Kammer mit dem Brunnen am nächsten an der Kathode (schwarz) Ende.
3. Gießen Sie 1 X TAE-Puffer in der Kammer genug Puffer über die Oberkante des Gel-Tiefziehschiene 2 mm haben.
4. Erhalten Sie PCR-Röhrchen aus dem Thermocycler und in Reaktionscup Halter.
5. Mit einem frischen Pipettenspitze jeweils, 10 µL des gekauften Orange G laden Farbstoff (LD), jede Probe hinzufügen und gut verrühren.
6. Last 20 µl des Herrschers Molekulargewicht und 20 µL jeder Probe in das Gel in der Reihenfolge angegeben (Tabelle 2).
7. Laufen Sie Gelelektrophorese für 30 min bei 100 V.
8. Entfernen Sie Gel-Tiefziehschiene aus Kammer und Dia-Gel aus Taskleiste entfernen. Legen Sie Gel in eine Färbung Fach.
9. Tauchen Sie Gel in gekauften DNA-Gel Fleck für 5 min, sorgfältig schütteln Tablett um den Fleck in das Gel verteilen.
10. Übertragen Sie das Gel in einen Behälter waschen und spülen Sie mit Wasser aus dem Wasserhahn (40-55 ° C) für ca. 10 s.
11. Destain durch Waschen 3 X in warmem Leitungswasser für 6 min mit sanft schütteln für optimale Ergebnisse zu erzielen. Falls erforderlich, weiter entfärben in warmem Wasser, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist.

Tabelle 1. Liste der entsprechenden Röhre zahlen, Primer und DNA-Proben.

Tabelle 2. Der richtigen Reihenfolge, 20 µL des Herrschers Molekulargewicht und 20 µL jeder Probe in das Gel zu laden.

Nach Entfärben, können Gele analysiert werden, indem man Test Essen Bahnen (Tabelle 3) um festzustellen, ob die DNA-Bänder für die 35 s-Promoter und Nein-Terminator-Gene in den bekannten Orten auf dem Gel vorhanden sind. Platzieren das Gel auf ein UV-Licht-Box kann helfen, erhöhter Kontrast (Abbildung 1). Alternativ können Gele auf weißem oder gelbem Papier zu einem kontrastierenden Hintergrund markieren DNA-Bänder (Abbildung 2) platziert werden.

Abbildung 1: Ein destained Gel zeigt Bands der DNA getrennt. Agarose-Gel nach Agarose-Gelelektrophorese auf UV-Licht-Box.

Abbildung 2: Diagramm der bekannten Orten für die 35 s-Promoter und Nein Terminator DNA-. Das Vorhandensein oder Fehlen einer 200 bp-Bande in Spur 5 gibt an, ob der Test Lebensmittel GVO enthält.

Tabelle 3. PCR-Band Stichprobengrößen (Basenpaare (bp)).

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um DNA, so dass für eine breite Palette von DNA-Labortests zu verstärken. Ein Bereich des Testens jetzt möglich mit PCR ist, GVO zu identifizieren, durch die Prüfung auf Vorhandensein oder Fehlen der DNA-Sequenzen verwendet in die gentechnische Veränderung von Nahrungsmitteln. In der Regel wird eine Ernte genetisch geändert, um einen Vorteil gegen natürliche Abschreckung für optimale Erträge, z.B. Schädlinge (Abbildung 3), Krankheiten, Trockenheit (Abbildung 4). Denn der Vorteil gewonnen wird, indem man genetisches Material aus einer anderen Spezies in der Ernte pflanzeneigenen DNA, wurden mögliche Gesundheits- und Umweltrisiken mit der Verwendung von GVO festgestellt. Ein Umweltbewusstsein ist die Fähigkeit der genetisch veränderten DNA unbeabsichtigt durch Bestäubung Prozesse führen zu gentechnisch veränderten DNA-Eintritt in das Genom von Pflanzen als non-GVO verkauft werden soll ausgetauscht werden.

Abbildung 3. Larven der Colorado-Käfer, fressen Blätter einer Kartoffel.

Abbildung 4. Mais durch Dürre zerstört.