Spannungsfreies gewichtstragendes Modell der steroidinduzierten Osteonekrose des Femurkopfes bei Ratten

Das Protokoll zeigt den Aufbau eines einfachen und kostengünstigen Trainingsmodells für die Steroid-induzierte Osteonekrose des Hüftkopfes unter Verwendung eines elastischen therapeutischen Tapes.

Im Gegensatz zum Menschen sind Ratten Tiere, die auf allen Vieren gehen, während Menschen zweibeinige Tiere sind, die stehen und deren Hüften beim Gehen und Stehen einem enormen Druck ausgesetzt sind. In Rattenmodellen, die durch Steroide induzierte Femurkopfnekrose durchgeführt wurden, müssen häufig die biomechanischen Eigenschaften der menschlichen Hüfte unter höherem Druck simuliert werden. Einige Gelehrte versuchen, den Zustand des menschlichen Hüftdrucks nachzuahmen, indem sie Ratten ein bestimmtes Gewicht tragen lassen, aber es ist schwierig, das tragende Objekt an der Ratte zu befestigen. Ratten können sich leicht aus der Immobilisierung befreien, und das Aufkleben des Gewichts mit Klebeband auf die Ratten führt dazu, dass die Ratten ersticken oder an Darmverschluss sterben. Unsere Forschungsgruppe verwendete ein elastisches therapeutisches Tape, um eine spannungsfreie Immobilisierung von gewichtstragenden Objekten bei Ratten durchzuführen, so dass die Ratten frei atmen konnten und sich unter Gewichtsbelastungsbedingungen nicht von der Immobilisierung lösten. Im Vergleich zum üblichen steroidinduzierten Modell der Femurkopfnekrose bei Ratten fanden wir heraus, dass dieser gewichtstragende Eingriff das Fortschreiten der Femurkopfnekrose bei Ratten verschlimmern kann.

Die Gabe von Glukokortikoiden ist der häufigste Risikofaktor für eine nicht-traumatische Osteonekrose des Hüftkopfes (ONFH)¹. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass neben den Glukokortikoiden auch die Druckbelastung des Hüftgelenks bei Patienten mit dem Auftreten von ONFH assoziiert ist. Faktoren wie Körpergewicht und körperliche Arbeitsintensität werden als Risikofaktoren für ONFH² anerkannt. Mehrere klinische Studien haben einen engen Zusammenhang zwischen den Belastungsbedingungen des Hüftgelenks und dem Zeitpunkt und der Häufigkeit von Gelenkersatz gezeigt 3,4,5,6. Daher ist die Etablierung eines Modells, das den Zusammenhang zwischen Belastung und steroidinduzierter Osteonekrose des Hüftkopfes (SONFH) widerspiegelt, wichtig für eine umfassende Untersuchung dieser Erkrankung.

Große zweibeinige Vögel wie Strauße und Emus dienen als gute Modelle, um die Belastung des Hüftgelenks zu simulieren und ähneln den Belastungen menschlicher Beine ^7,8. Die Haltung großer Vogelarten ist jedoch eine Herausforderung, und die damit verbundenen Forschungskosten sind hoch. Spontan hypertensive Rattenmodelle ^9,10 können höhere ONFH-Raten aufweisen, aber die durch spontane Hypertonie erzeugte Kompartimentdruckbelastung im Knochenmark unterscheidet sich signifikant von mechanischem Druck und ist ungeeignet, um den Einfluss des mechanischen Drucks auf SONFH zu untersuchen.

Kleintiermodelle werden häufig in der Forschung zu SONFH eingesetzt. Vierbeinige Reptilien haben jedoch eine geringere Belastung des Hüftgelenks, und ihre Hüftmodelle können die biomechanische Umgebung der menschlichen Hüftgelenke beim zweibeinigen Gehen nicht simulieren. Die Immobilisierung einer einzelnen Gliedmaße¹¹ und die Teilentlastungsmodelle¹² sind üblich, aber beide reduzieren die Belastung der Gliedmaßen. Da der Mensch ein zweibeiniger Organismus mit erheblichen Belastungen der unteren Gliedmaßen beim Stehen und Gehen ist, verringert die Verringerung der Belastung in diesen Modellen den Zusammenhang zwischen Tiermodellen und menschlichen Krankheiten.

Ziel dieser Studie ist es, ein einfaches und kostengünstiges Modell für das Krafttraining zu etablieren, um den Einfluss des Gewichtstrainings auf die steroidinduzierte Osteonekrose des Hüftkopfes bei Ratten zu untersuchen. Gegenwärtig werden Rattenmodelle verwendet, um die steroidinduzierte Osteonekrose des Hüftkopfes zu untersuchen^13,14, aber es gibt immer noch kein Modell, das eine langfristige, sichere Fixierung mit minimaler Störung der Bewegung ermöglichen kann, was auch relativ einfach und kostengünstig ist. In dieser Studie wird ein hochadhäsives Fixierungsmaterial verwendet, das eine spannungsfreie Fixierung annimmt, die die Beweglichkeit der Ratten erhält und das Leiden und sogar den Tod durch unsachgemäße Fixierung reduziert.

Das Protokoll hält sich an die ethischen Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Beijing University of Chinese Medicine, Protokollnummer BUCM-4-2022062001-2109. Das Protokoll verwendet Sprague Dawley (SD) Ratten (SCXK(Jing)2019-0008) im Alter von 8-10 Wochen und mit einem Gewicht von 200 g-250 g.

1. Anpassungstraining

1. Albino-Ratten haben in der Regel einen Sichtbereich von weniger als 60 cm¹⁵. Setzen Sie die Ratten während des Modellierungsprozesses in undurchsichtige Käfige und halten Sie sie so weit wie möglich von nicht modellierten Ratten fern (zumindest sollten sich andere Ratten außerhalb des maximalen Sichtbereichs der modellierten Ratten befinden), um zu verhindern, dass sie traumatischen Stress erleben.
2. Schalten Sie das Laufband ein und stellen Sie es auf 10 m/min mit einer Steigung von 0° ein. Setzen Sie die Ratten auf das Laufband und stellen Sie sicher, dass die Bewegungen so sanft wie möglich sind, um Stress zu vermeiden. Verwenden Sie keine zusätzliche Stimulation; Die Ratten kriechen von Natur aus vorwärts, weil sie mit der Umgebung nicht vertraut sind.
3. Das Training dauert 15 min. Reinigen Sie nach dem Training den Kot und Urin, den die Ratten hinterlassen haben, und sprühen Sie Alkohol, um den Tiergeruch zu beseitigen. Bereite dann die nächste Ratte für das Training vor.
   HINWEIS: Wenn sich eine Ratte weigert, 5 Minuten lang auf dem Laufband zu laufen, schließen Sie sie von der Studie aus.
4. Setzen Sie das adaptive Training bis zum Ende der 1^. Woche fort.

2. Messung der maximalen Tragfähigkeit bei Ratten

1. Bereiten Sie zwei Reagenzgläser, einen Haken und einen Schlaufenverschluss von einer Länge von ca. 80 cm vor. Legen Sie die Stahlkugeln in die Reagenzgläser und stellen Sie sicher, dass das anfängliche Gesamtgewicht der Reagenzgläser, des Hakens und des Schlaufenverschlusses 150 g beträgt. Bereiten Sie Reagenzgläser mit unterschiedlichen Gesamtgewichten in Schritten von 10 g vor, wobei das maximale Gewicht 350 g beträgt.
2. Ein Forscher benutzt beide Hände, um Ratten mit Handschuhen zu fesseln (Abbildung 1). Ein anderer Forscher platziert das Reagenzglas auf dem Rücken der Ratte, etwa 1 cm von der Mittellinie des Rückens entfernt. Da dieser Schritt keine Bewegung der Ratte erfordert, führen Sie die Fixierung durch, indem Sie einfach den Klettverschluss um die Ratte wickeln, ohne zusätzliche Maßnahmen zur Sicherung des Schlauchs zu ergreifen.
3. Wechseln Sie den Schlauch, bis das maximale Gewicht der Ratte erreicht ist. Wenn die Ratte die maximale Gewichtsbelastung erreicht, kann sie nicht mehr stehen, wenn sie gestoßen wird oder der Versuchsleiter geht. Reduzieren Sie das Gewicht um 10 g, damit die Ratte stehen kann. Dieses Gewicht stellt die maximale Tragfähigkeit der Ratte dar.

3. Vorbereitung der Gewichtsbelastung

1. Da während des Trainings eine sichere Fixierung erforderlich ist, sichern Sie die Objekte mit einem 1-1,5 m langen elastischen therapeutischen Klebeband basierend auf der Rattengröße, das eine starke Haftung aufweist. Verwenden Sie Ton, um das Gewicht der Reagenzgläser anzupassen, um das Schwingen der Last zu reduzieren.
2. Nachdem Sie das Gewicht der Reagenzgläser und der Fixierungsobjekte gewogen haben, geben Sie eine angemessene Menge Ton in die Reagenzgläser, um sie auf das Zielgewicht einzustellen. Verwende einen Rührstab aus Glas, um den Ton gleichmäßig in den Reagenzgläsern zu verteilen. Tonerde, die an einem Ende des Reagenzglases konzentriert ist, kann dazu führen, dass er sich während des Trainings leicht ablöst.
3. Das Gesamtgewicht der eingestellten Reagenzgläser und des Tons ist auf 50 % der maximalen Tragfähigkeit der Ratte einzustellen (Abbildung 1A). Wenn Sie dieses Gewicht überschreiten, wird es für die Ratte schwierig sein, das Training abzuschließen. Passen Sie das Gewicht der Last bis zum Ende des Versuchs nicht wieder an.

4. Etablierung einer steroidinduzierten Osteonekrose des Femurkopfmodells

1. Verwenden Sie die Methylprednisolon-Methode in Kombination mit Lipopolysaccharid (LPS+MPS) für die Etablierung des SONFH-Modells^16,17. Die intraperitoneale Injektion von LPS (20 μg/kg) mit einer Standardnadel an der Mittellinie des Abdomens der Ratte einmal alle 24 Stunden durchführen, also insgesamt 2 Injektionen.
2. Nach der letzten LPS-Injektion injizieren Sie MPS (40 mg/kg) 24 h nach der regulären Fütterung in den einseitigen Gesäßmuskel und setzen Sie die Injektionen alle 24 Stunden abwechselnd zwischen den beiden Gesäßbereichen fort, also insgesamt drei Injektionen.

5. Spannungsfreie Ruhigstellung der Gewichtsbelastung mittels elastischem Therapieband und Laufbandtraining

1. Markieren Sie die hintere Mittellinie der Ratte bei 1-2 cm auf beiden Seiten; Dies ist der Referenzpunkt für die Gewichtsbelastung. Stellen Sie sicher, dass die Markierungen richtig positioniert sind, um zu verhindern, dass die Ratte während des Laufbandtrainings umkippt oder die Bewegung behindert.
2. Während ein Untersucher die Ratte mit Handschuhen fixiert, legen Sie eine Hand unter die Achselhöhle der Ratte, um die Vordergliedmaßen und den Kiefer zu sichern, während die andere Hand die Hintergliedmaßen und den Schwanz sichert. Vermeiden Sie übermäßige Krafteinwirkung, um Stress oder Erstickungsgefahr zu vermeiden (Abbildung 1B).
3. Kleben Sie das elastische therapeutische Klebeband ohne Spannung auf das Reagenzglas, um die Last auf dem Rücken der Ratte zu sichern. Dehnen Sie das elastische therapeutische Band während des Aufwickelns nicht, um eine spannungsfreie Fixierung zu erreichen.
   HINWEIS: Das in diesem Modell verwendete elastische therapeutische Band ist für das Tapen bei intensiven körperlichen Aktivitäten konzipiert und bietet eine hohe Haftung und Elastizität¹⁸. Durch seine hohe Elastizität reduziert es die Auswirkungen auf die Bewegung der Ratte beim Krabbeln erheblich.
4. Bitten Sie den zweiten Untersucher, das Reagenzglas am Rücken der Ratte parallel zur Wirbelsäule der Ratte zu befestigen, wobei die Fixierungsposition auf den gemachten Markierungen basiert, d. h. 1-2 cm von der Mittellinie auf beiden Seiten des Rückens der Ratte entfernt.
5. Um das Leiden der Ratte zu minimieren, die Auswirkungen auf die Bewegung der Ratte zu verringern und die durch Fixierung verursachte Sterblichkeit zu verringern, führen Sie die Fixierung ohne Spannung durch. Kleben Sie das Reagenzglas mit dem angepassten Gewicht auf das elastische therapeutische Klebeband und wickeln Sie das Reagenzglas dann mit einer spannungsfreien Technik um den Körper der Ratte.
6. Sorgen Sie für eine spannungsfreie Immobilisierung und behalten Sie die ursprüngliche Länge des elastischen therapeutischen Tapes ohne Dehnung bei, um negative Auswirkungen auf die Atmung und Bewegung der Ratte zu vermeiden (Abbildung 1C).
7. Nachdem Sie das Reagenzglas um den Körper der Ratte gewickelt haben, setzen Sie die Ratte in einen offenen Raum oder einen einzelnen Käfig und überwachen Sie ihre Atmung und Richtung. Wenn Anzeichen einer schnellen Atmung oder eines schnellen Öffnens des Mundes auftreten, lassen Sie die Ratte sofort los, um ein Ersticken zu verhindern.
   1. Eine ideale Immobilisierung ermöglicht es der Ratte, sich frei zu bewegen und Aktivitäten wie Trinken, Heben der Vordergliedmaßen und Füttern auszuführen (Abbildung 1D). Wenn die Immobilisierung nicht zufriedenstellend ist, lassen Sie sie vorübergehend los und stellen Sie sie nach 20 Minuten wieder ruhig, um die Belastung der Ratte durch wiederholte Immobilisierungsreize zu minimieren.
8. Schalten Sie das Laufband ein und stellen Sie es auf 1 m/min mit einer Steigung von 0° ein. Die Trainingszeit auf dem Laufband beträgt 30 Minuten. Setzen Sie die Ratte vorsichtig auf das Laufband und starten Sie den Timer.
9. Stimulieren Sie die Ratte nicht zusätzlich. Wenn die Ratte das 30-minütige Training nicht abschließen kann, setzen Sie sie für eine 10-minütige Pause in einen Käfig, ohne die Fixierung zu entfernen.
   HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete elastische therapeutische Band hat eine ausgezeichnete Dehnbarkeit und Haftfähigkeit. Bei ordnungsgemäßer Befestigung ohne Spannung führt eine langfristige Fixierung nicht dazu, dass sich das Reagenzglas löst oder zum Ersticken und Tod der Ratte führt.
10. Reinigen Sie nach dem Training den Kot und Urin, den die Ratten hinterlassen haben, und sprühen Sie Alkohol, um den Tiergeruch zu beseitigen.
11. Vermeiden Sie es, dass die oben genannten Schritte von anderen Ratten gesehen werden, und behandeln Sie die Tiere so schonend wie möglich, um zu verhindern, dass die Tiere laut werden und dadurch traumatischen Stress für andere Ratten verursachen.
12. Befreien Sie die Ratte sofort nach Abschluss des Trainings aus der Fixierung (Abbildung 1E). Drücken Sie während der Freisetzung mit den Fingern auf das Fell der Ratte, um es zu schützen und den Fellverlust während der Freisetzung zu minimieren (Abbildung 1F).

6. Gruppierung von Tieren

1. Um die Auswirkungen von Krafttraining auf SONFH zu untersuchen, teilen Sie 60 Ratten nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen ein.
2. Etablieren Sie in der Kontrollgruppe nicht das übliche Modell der steroidinduzierten Osteonekrose des Femurkopfes (SONFH) und führen Sie kein Krafttraining durch. Führen Sie in der Gruppe Control+Load nur ein Krafttraining durch, ohne die steroidinduzierte Osteonekrose des Femurkopfmodells festzustellen. In der Modellgruppe ist die steroidinduzierte Osteonekrose nur des Femurkopfmodells zu ermitteln. Führen Sie in der Gruppe Modell+Belastung ein Gewichtstraining durch, nachdem Sie die steroidinduzierte Osteonekrose des Femurkopfmodells festgestellt haben.

7. Euthanasie und Probenentnahme

1. Setzen Sie die Ratten in eine Euthanasiekammer für Kleintiere und injizieren Sie so viel Kohlendioxid, dass eine Konzentration von mehr als 5 % erreicht wird. Sobald die Ratten das Bewusstsein verlieren, verabreichen Sie eine Dosis von 0,3 ml/kg Körpergewicht einer 20%igen Kaliumchloridlösung, insgesamt 20 ml, über eine intrakardiale Injektion.
2. Überwachen Sie die Atmung und den Herzschlag der Ratten, um sicherzustellen, dass sie während der Euthanasie keine Schmerzen oder Beschwerden verspüren. Bestätigen Sie den Tod, indem Sie überprüfen, ob keine Atmung und kein Herzschlag vorhanden sind. Sprühen Sie Alkohol, um Gerüche zu entfernen.
3. Präparieren Sie nach der Euthanasie die Hüftregion der Ratte und ziehen Sie den Femurkopf heraus, während der Femur intakt bleibt. Führen Sie nach der Vorbehandlung einen microCT-Scan durch, gefolgt von einer Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung.

8. Hämatoxylin-Eosin-Färbung

1. Nachdem die Modellierung abgeschlossen ist, euthanasiere die Ratten. Entfernen Sie die Oberschenkelknochen für die HE-Flecken.
2. Weichen Sie die Oberschenkelknochen der Ratte 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd ein, um biologisches Gewebe als Proben zu erhalten. Weichen Sie die Oberschenkelknochenproben der Ratte 5 Tage lang in 5%iger Ameisensäure zur Entkalkung ein.
3. Die Proben werden für die HE-Färbung in 5 μm-Scheiben geschnitten.
   ANMERKUNG: Leere Lücken beziehen sich auf die Situation im Knochengewebe¹⁹, wo die Lücken, die normalerweise Osteozyten enthalten sollten, keine dieser Zellen enthalten. Es ist ein wichtiger Indikator für die Beurteilung der Gesundheit des Knochengewebes. Im pathologischen Prozess der Knochennekrose kann eine unzureichende Blutversorgung zum Tod der Osteozyten führen, was zu leeren Lücken führt. Bei der Diagnostik und Beurteilung von Knochennekrosen sind die Anzahl und Verteilung der leeren Lücken wichtige Parameter zur Messung des Schweregrads der Erkrankung^20,21.
   1. Legen Sie die Femurproben der Ratte in geschmolzenes Paraffin (56-60 °C), weichen Sie sie bei Bedarf zunächst in Paraffin mit niedrigem Schmelzpunkt ein und überführen Sie sie dann allmählich zu Paraffin mit höherem Schmelzpunkt, jeweils für etwa 1 h, um eine gründliche Infiltration des Gewebes mit Paraffin zu gewährleisten.
   2. Bereiten Sie die Einbettungsformen vor und gießen Sie geschmolzenes Paraffin bis zur entsprechenden Tiefe in die Formen. Entnehmen Sie die Gewebeproben nach dem Einweichen mit einer Pinzette aus dem Paraffin, entfernen Sie überschüssiges Paraffin und legen Sie sie in Formen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen, um das Paraffin zu verfestigen und Paraffinblöcke zu bilden.
   3. Schneiden Sie die eingebetteten Paraffinblöcke mit einem Paraffinmikrotom in 5 μm dicke Abschnitte.
4. Die Oberschenkelproben der Ratte mit den daran befestigten Scheiben in einem Objektträgerwärmer 1 h backen, um die Haftung zwischen den Scheiben und dem Deckglas zu verbessern und das Aufschwimmen bei nachfolgenden Färbevorgängen zu reduzieren.
5. Tauchen Sie die gebackenen Scheiben nacheinander in reines Xylol, um Paraffin zu entfernen, gefolgt von einer Reihe von Dehydratisierungen durch absolutes Ethanol, Gradientenethanol (100 %, 95 %, 80 %, 70 %) und Wasser für jeweils 2 Minuten, um den Entparaffinisierungs- und Rehydratisierungsprozess abzuschließen.
6. Tauchen Sie die entparaffinisierten Scheiben in eine Hämatoxylin-Färbelösung und färben Sie sie 10 Min. lang. Mit fließendem Wasser abspülen, um ungebundenes Hämatoxylin zu entfernen.
7. Tauchen Sie die mit Hämatoxylin gefärbten Abschnitte in Eosin-Färbelösung und färben Sie sie 2 Minuten lang, um das Zytoplasma und das Bindegewebe zu färben. Mit einer 1%igen Essigsäurelösung abspülen, um den Färbeeffekt zu fixieren.
8. Tauchen Sie die Scheiben der Oberschenkelknochenprobe der Ratte nacheinander in 70 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 % Ethanol, wobei jeder Gradient 2 Minuten lang entfernt wird, wobei die Feuchtigkeit allmählich entfernt wird.
9. Tauchen Sie die Scheiben der Oberschenkelknochenproben der Ratte in reines Xylol, um die Transparenz zu gewährleisten, und spülen Sie sie anschließend mit fließendem Wasser ab, um das Xylol zu entfernen. Tragen Sie neutrales Einbettharz auf, bedecken Sie die Objektträger, klopfen Sie vorsichtig ab, um Luftblasen zu entfernen, und lassen Sie das Einbettmedium erstarren, um den Einbettungsprozess abzuschließen.
10. Wählen Sie mit dem randomizr-Paket in R 30 HE-gefärbte Objektträger für jede Gruppe aus und weisen Sie jeweils 15 Objektträger zwei Forschern zu. Bitten Sie die Forscher, ohne sie über die Gruppierungen zu informieren, die Leerlochrate der Folien zu berechnen und die Ergebnisse für die statistische Analyse zu sammeln.

9. MicroCT-Analyse

1. Nachdem die Modellierung abgeschlossen ist, euthanasiere die Ratten. Entfernen Sie die Oberschenkelknochen für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung.
2. Weichen Sie die Oberschenkelknochen der Ratte 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd ein, um biologisches Gewebe als Proben zu erhalten. Legen Sie die Oberschenkelknochen der Ratte in das kleintierspezifische microCT-Gerät.
3. Stellen Sie die microCT-Scanbedingungen wie folgt ein: Röntgenspannung: 80 kV, Strom: 100 μA, Einzelbelichtungszeit: 50 ms, Scanauflösung: 25 μm. Führen Sie Scans in Abständen von 0,5° durch, wobei der Schwerpunkt auf dem Trabekelknochen von unterhalb des Knorpels bis zum oberen Teil der Epiphyse als interessierender Bereich liegt.
4. Definieren Sie den Bereich über dem Oberschenkelhals der Ratte als interessierender Bereich.
5. Führen Sie eine koronale Rekonstruktion der Scanergebnisse mit dem microCT-Gerät durch und sammeln Sie knochenmorphometrische Messungen, die von der integrierten Software des microCT-Geräts generiert werden. Notieren Sie die folgenden beobachteten Indizes: Gesamtvolumen (TV), Prozentuales Knochenvolumen (BV/TV), Verhältnis von Knochenoberfläche zu Volumen (BS/BV), Strukturdicke (Tb.Th), Strukturtrennung (Tb.Sp), Anzahl der Knochen (Tb.N), Knochendichte (BD).

10. Statistische Auswertung

1. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Führen Sie statistische Analysen für Mikro-CT und quantitative histologische Auswertungen mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test durch. Betrachten Sie einen p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant.

Histopathologische Analyse
Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen zeigten, dass in der Kontrollgruppe und der Control+Load-Gruppe die Knochentrabekel intakt und regelmäßig angeordnet waren. In den Knochengrübchen waren Endothelzellen der Blutgefäße vorhanden, und die Zellmorphologie schien prall zu sein. Im Gegensatz dazu zeigten die Modellgruppen und Modell+Load frakturierte und ungeordnete Knochentrabekel sowie eine signifikant höhere Anzahl leerer Lücken. Die Gruppe Modell+Last wies im Vergleich zur Modellgruppe mehr leere Lücken auf. In der Modellgruppe zeigten einige Zellen im Knochenmark eine Lipidakkumulation, während die Knochenmarkhöhle in der Model+Load-Gruppe vergleichsweise leer erschien (Abbildung 2A). Die Raten leerer Lücken in der Kontrollgruppe, der Kontroll+Belastungsgruppe, der Modellgruppe und der Modell+Belastungsgruppe betrugen 6,0 ± 2,5, 6,4 ± 3,8, 57,6 ± 29,6 bzw. 78,2 ± 15,5 (Abbildung 2B).

MicroCT-Analyse
Die Ergebnisse der Mikro-CT zeigen deutlich die mikroskopische Struktur der Knochentrabekel und spiegeln die Integrität der Gewebestruktur und Veränderungen der Knochenmasse wider. In dieser Studie waren die Trabekel in der Kontrollgruppe und der Control+Load-Gruppe dicht, übersichtlich und deutlich sichtbar. In der Modellgruppe waren die Trabekel spärlich und wiesen ungeordnete und unregelmäßige Anordnungen auf. Oberhalb der Epiphysenlinie in der Modell+Belastungsgruppe war die Morphologie der Trabekel unvollständig. Die Femurköpfe erschienen in allen vier Gruppen glatt ohne signifikanten Kollaps (Abbildung 3A).

Die Quantifizierung der Skelettstruktur, Morphologie und Abmessungen wurde durchgeführt. TV stellt das Gesamtvolumen der interessierenden Region dar, was indirekt widerspiegeln kann, ob es eine signifikante Veränderung in der Knochenmorphologie gegeben hat¹⁹. TV zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier Gruppen, was darauf hindeutet, dass sowohl die Konstruktion des Glukokortikoid-induzierten Schadensmodells als auch das Eingreifen mechanischer Druckbelastung möglicherweise nicht zu einem Kollaps in den Femurköpfen von Ratten führen. BV/TV kann die Knochenmasse^{widerspiegeln 22}. Die Gruppe Strg+Laden hatte ein signifikant höheres Knochenvolumen als die Kontrollgruppe, und sowohl die Kontrollgruppe als auch die Strg+Ladengruppe wiesen ein viel höheres Knochenvolumen auf als die Modellgruppe und die Modell+Belastungsgruppe. Im Vergleich zur Modellgruppe war der BV/TV in der Gruppe Model+Load am niedrigsten. Gleichzeitig bestätigten sich die BD-Ergebnisse mit BV/TV²³, was darauf hindeutet, dass eine mechanische Druckbelastung die Knochenbildung in den Hüftköpfen ohne hormonelle Intervention fördern kann, während sie die Knochenbildung in den Hüftköpfen hemmt, die einer Glukokortikoid-Intervention unterzogen werden.

BS/BV kann indirekt die Störung der Trabekel^{widerspiegeln 24}. Die Störung der Trabekel nahm sequentiell in der Kontrollgruppe, der Kontroll+Belastungsgruppe, der Modellgruppe und der Modell+Belastungsgruppe zu, was darauf hindeutet, dass ein mechanischer Druckbelastungseingriff die trabekuläre Störung im normalen Knochengewebe und im durch Glukokortikoide geschädigten Knochengewebe verschlimmern kann. Tb.Th steht für die Trabekeldicke¹⁹ und Tb.N für die Anzahl der Trabekel²⁰. Beide Indikatoren korrelieren positiv mit der Knochenbildung. In dieser Studie waren Tb.N und Tb.Th in der Kontrollgruppe signifikant niedriger als in der Kontroll+Last-Gruppe. Tb.N und Tb.Th in der Modellgruppe und der Modell+Lastgruppe waren signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe und der Kontroll+Lastgruppe, mit einer signifikanten Verringerung in der Modell+Lastgruppe im Vergleich zur Modellgruppe. Dies deutet darauf hin, dass die mechanische Druckbelastung die Anzahl und Dicke der Trabekel erhöhen kann, während die mechanische Druckbelastung nach einer Glukokortikoid-Intervention den gegenteiligen Effekt auf die Knochen haben kann.

Tb.Sp stellt die Lücke zwischen den Trabekeln dar und ist negativ mit der Knochenmasse^{korreliert 22}. In dieser Studie zeigte Tb.Sp einen entgegengesetzten Trend zu Tb.N und Tb.Th, was die Ergebnisse von Tb.N und Tb.Th bestätigt (Abbildung 3B). Die microCT-Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mechanische Druckbelastung mit oder ohne Glukokortikoid-Intervention gegensätzliche Auswirkungen auf die Femurköpfe haben kann. Bei Hüftköpfen ohne Glukokortikoid-Eingriff kann eine mechanische Druckbelastung die Knochenbildung begünstigen. Wenn die Knochen jedoch einer Glukokortikoidschädigung ausgesetzt sind, kann ein mechanischer Druckbelastungseingriff die steroidinduzierte Osteonekrose des Hüftkopfes verschlimmern.

Abbildung 1: Spannungsfreie Ruhigstellung des Lastlagers. (A) Messen Sie das Gewicht der Last. (B) Forscher sichern die Ratte. (C) Fixierung ohne Spannung. (D) Fixierung abgeschlossen. (E) Zusammenarbeit zu zweit zur Freigabe der Fixierung. (F) Schützen Sie das Fell der Ratte während des Fixierungskontakts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. (A) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. (B) Prozentsatz leerer Lücken (n = 15). Die statistischen Analysen wurden mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test durchgeführt. Fehlerbalken zeigen die mittlere ± Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: MicroCT-Analyse. (A) Zweidimensional rekonstruiertes Bild aus der microCT. (B) Knochenmorphometrische Ergebnisse (n = 15). Die statistischen Analysen wurden mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test durchgeführt. Fehlerbalken zeigen die mittlere ± Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Derzeit können verschiedene Tiere, wie z. B. Kaninchen²⁵, Ratten²⁶, Mäuse²⁷, Schweine²⁸, Masthähnchen²⁹, Strauße⁸ und Emus³⁰ verwendet werden, um Modelle der Femurkopfnekrose zu erstellen. Unter ihnen sind Ratten, Mäuse und Kaninchen die am häufigsten verwendeten Arten. Die Ratte als Modell für die Hüftkopfnekrose bietet zahlreiche Vorteile. Ratten sind leicht zu füttern und zu züchten, wachsen schnell und haben ähnliche physiologische und metabolische Eigenschaften wie Menschen. Ihre Hüftköpfe sind von mäßiger Größe, so dass sie für röntgenologische und pathologische Untersuchungen geeignet^{sind 26}. Als kleinere vierbeinige Tiere tragen Ratten jedoch während der Fortbewegung geringere Lasten auf ihren Hintergliedmaßen, so dass es schwierig ist, den Zusammenhang zwischen mechanischer Druckbelastung und der Entwicklung von Femurkopfnekrosen mit herkömmlichen Rattenmodellen zu untersuchen.

Die Ratte hat einen spindelförmigen Körper mit glattem Fell, was es schwierig macht, Gewichte mit herkömmlichen Fixierungsmethoden zu sichern, was die Mobilität der Ratte erheblich beeinträchtigen kann. In den frühen Stadien unserer Forschung versuchten wir, Methoden wie Klebeband, Nylonbänder und Zugseile zu verwenden, um die Ratten ruhig zu stellen, aber keine führte zu zufriedenstellenden Ergebnissen. Durch kontinuierliche Experimente setzten wir erfolgreich elastisches therapeutisches Klebeband und spannungsfreie Techniken ein, um es Ratten zu ermöglichen, eine bestimmte Last während des gewichtstragenden Gehtrainings mit minimaler Einschränkung zu tragen. Dieses Modell, das einfach und kostengünstig ist, hat sich als erfolgreich erwiesen. Es erfüllt die experimentellen Anforderungen und ermöglicht die Erforschung der Auswirkungen mechanischer Druckbelastung auf die steroidinduzierte Femurkopfnekrose.

Hier werden einige Überlegungen zur Problembehandlung für das Rattenmodell erläutert. Hautläsionen: Das wiederholte Auftragen von elastischem therapeutischem Klebeband kann zu Fellabspaltungen und Hautläsionen am Körper der Ratte führen. Führen Sie keine spezielle Behandlung durch, wenn das Fell nur Abszission aufweist und nicht ulzeriert. Das elastische therapeutische Tape kann 4 Tage lang ohne Nebenwirkungen auf die nackte Haut aufgetragen werden. Im Falle eines Hautabbaus desinfizieren Sie die Ratten mit Jodophor und verwenden Sie das Pflaster weiter, nachdem die Läsion verheilt ist. Elastisches therapeutisches Klebeband ist sicher und Allergien wurden in unserer Forschung nicht beobachtet. Das spannungsfreie Taping zieht nicht an der Haut und verursacht keine Blasen; Das elastische therapeutische Tape kann direkt auf die nackte Haut aufgetragen werden. Tod durch Ersticken: Wenn die Fixierung zu fest ist, kann die Ratte an Erstickung sterben. Beobachten Sie nach Abschluss die Atmung der Ratte. Wenn die Ratte zum Beispiel mit offenem Maul atmet oder sich heftig wehrt, kann dies auf eine schlechte Fixierung hinweisen. Lösen Sie das Klebeband sofort; Andernfalls kann die Ratte innerhalb von 5 bis 10 Minuten sterben. Reflux des Mageninhalts: Wenn nach der Fixation dunkler Mageninhalt am Maul der Ratte beobachtet wird, deutet dies auf ein ernsthaftes Problem mit der Fixierung hin. Diese Situation sollte umgehend korrigiert und die Fixationstechnik überprüft werden. Zu diesem Zeitpunkt hat die Ratte starke Schmerzen und sollte sofort eingeschläfert werden.

Bisher waren die vorherrschenden Modelle für den mechanischen Druck diejenigen, die sich auf die Entlastung¹² konzentrierten und hauptsächlich zur Simulation von Osteoporose oder Osteoporose unter Bedingungen mit geringer Schwerkraft verwendet wurden. Unser Modell unterscheidet sich von den Entlademodellen in Bezug auf die Intervention; Wir legten eine höhere Last auf Ratten an, was eine weniger verbreitete Interventionsmethode ist. Durch diese Intervention stellen wir jedoch ein Forschungsmodell zur Verfügung, um die frühen Stadien der Femurkopfnekrose zu untersuchen und zu untersuchen, wie das Gewichtstraining in den frühen Stadien der steroidinduzierten Osteonekrose des Femurkopfes durchgeführt werden sollte. Diese Studie ergab, dass Femurköpfe, die nicht von Kortikosteroiden beeinflusst werden, aufgrund des Gewichtstrainings keine Knochenmasse verlieren. Bei steroidbeeinflussten Hüftköpfen kann ein Training mit großen Gewichten die Entwicklung von SONFH fördern.

Spontan hypertensive Ratten zeigen auch hohe Druckbedingungen im Femurkopf, und ähnlich wie bei mechanischen Druckinterventionen sind hypertensive Ratten anfälliger für Femurkopfnekrosen^31,32. Obwohl beide Modelle zu ähnlichen Schlussfolgerungen kommen, kommt es bei spontan hypertensiven Ratten neben Symptomen einer Femurkopfnekrose auch zu einer Schädigung der Endothelzellen und einer Adipogenese der Knochenmarkhöhle⁹. Es gibt jedoch signifikante Unterschiede in den Mechanismen der Femurkopfnekrose, die durch den mechanischen Druck der Gefäße und Hüftgelenke verursacht wird. Spontane Hypertoniemodelle haben eine längere Modellierungszeit und eine geringere Erfolgsquote.

Darüber hinaus wird in dieser Studie eine spannungsfreie Fixationstechnik eingesetzt. Neben der Minimierung der Auswirkungen auf die Bewegung der Tiere reduziert diese Technik den traumatischen Stress und führt bei richtiger Anwendung nicht zum Ersticken oder Tod bei Ratten. Diese beiden Schritte sind in dieser Studie entscheidend.

Diese Technik ist nicht nur auf die Untersuchung der Hüftkopfnekrose anwendbar, sondern kann auch als Referenzmodell für die Forschung im Zusammenhang mit Sportmedizin, Krafttraining und Ausdauertraining dienen. Bestehende Modelle zur gewichtstragenden Fixierung können tragende Objekte nicht über längere Zeiträume sichern. Daher stellt dieses Modell eine praktikable Option für Studien dar, die eine längere Gewichtsbelastung bei Ratten erfordern.

Diese Studie hat einige Einschränkungen. Aus Kostengründen und aus anderen Gründen haben wir die Veränderungen am Femurkopf in verschiedenen Stadien nicht gemessen, und die Anzahl der Baseline-Messungen war relativ gering. Die Steroiddosierung in dieser Studie wurde auch aus anderen Modellen referenziert, und die Auswirkungen extrem hoher Dosen von Steroiden auf dieses Modell wurden nicht diskutiert.

Der Autor erklärt, dass es keine Interessenkonflikte, Zugehörigkeiten oder Kooperationen gibt, die die Objektivität oder die Ergebnisse dieser Forschung beeinflussen könnten.

Diese Studie ist eine unabhängige Studie und wurde nicht gefördert.