类固醇诱导大鼠股骨头骨坏死的无张力负重模型

该协议显示了使用弹性治疗胶带为类固醇诱导的股骨头骨坏死构建一个简单且具有成本效益的大鼠负重训练模型。

与人类不同，老鼠是用四肢行走的动物，而人类是站立的两足动物，走路和站着时臀部承受着巨大的压力。在大鼠类固醇诱导的股骨头坏死模型中，通常需要模拟人髋关节在较高压力下的生物力学特性。一些学者试图通过让老鼠承受一定的重量来模拟人类臀部压力的状态，但将负重物体固定在老鼠身上是很困难的。老鼠很容易挣脱固定，用胶带将重物粘在老鼠身上会导致老鼠窒息或死于肠梗阻。我们的研究小组使用弹性治疗胶带对大鼠的负重物体进行无张力固定，使大鼠在负重条件下能够自由呼吸而不会脱离固定。与通常的类固醇诱导的股骨头坏死大鼠模型相比，我们发现这种负重干预可以加重大鼠股骨头坏死的进展。

糖皮质激素的给药是股骨头非创伤性骨坏死 （ONFH） 最常见的危险因素¹。大量证据表明，除了糖皮质激素外，患者髋关节的压力负荷也与 ONFH 的发生有关。体重和体力劳动强度等因素被认为是 ONFH² 的危险因素。多项临床研究表明，髋关节负荷条件与关节置换的时间和发生率之间存在密切关系 3,4,5,6。因此，建立一个反映负重与类固醇诱导的股骨头骨坏死 （SONFH） 之间关系的模型对于全面调查这种情况非常重要。

大型双足鸟类，如鸵鸟和鸸鹋，是模拟髋关节压力的良好模型，类似于人类的腿部负荷 ^7,8。然而，维持大型鸟类具有挑战性，而且相关的研究成本很高。自发性高血压大鼠模型 ^9,10 可表现出较高的 ONFH 发生率，但自发性高血压产生的骨髓隔室压力负荷与机械压力显着不同，不适合研究机械压力对 SONFH 的影响。

小动物模型通常用于 SONFH 的研究。然而，四足爬行动物的髋关节应力较低，它们的髋关节模型无法模拟双足行走时人类髋关节的生物力学环境。单肢固定模型¹¹ 和部分卸载模型¹² 很常见，但都减少了肢体负载。由于人类是两足生物，在站立和行走时具有很大的下肢负荷，因此减少这些模型中的负荷会减少动物模型与人类疾病之间的联系。

本研究旨在建立一个简单且具有成本效益的负重训练模型，以探讨负重训练对类固醇诱导的大鼠股骨头骨坏死的影响。目前，大鼠模型已被用于研究类固醇诱导的股骨头骨坏死^13,14，但仍然没有模型可以提供长期、安全的固定，同时对运动的干扰最小，这也相对简单且便宜。本研究采用高粘接固定材料，采用无张力固定，保持大鼠的活动能力，减少因固定不当造成的痛苦甚至死亡。

该协议遵守北京中医药大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 制定的伦理指南，协议编号 BUCM-4-2022062001-2109。该方案使用 Sprague Dawley （SD） 大鼠 （SCXK（Jing）2019-0008），年龄为 8-10 周，体重为 200 g-250 g。

1. 适应训练

1. 白化大鼠的视野范围一般小于 60 厘米¹⁵。在建模过程中，将大鼠放在不透明的笼子里，并尽可能远离未建模的大鼠（至少，其他大鼠应超出建模大鼠的最大视觉范围），以防止它们遭受创伤性压力。
2. 打开电源，将跑步机设置为 10 m/min，倾斜度为 0°。将大鼠放在跑步机上，确保动作尽可能轻柔，以避免压力。不要使用额外的刺激;老鼠会自然地向前爬行，因为它们不熟悉环境。
3. 培训持续 15 分钟。训练结束后，清理大鼠留下的粪便和尿液，喷洒酒精以消除动物气味。然后，准备下一只大鼠进行训练。
   注意:如果大鼠拒绝在跑步机上行走 5 分钟，请将其从研究中排除。
4. 继续适应性训练，直到^第 1 周结束。

2. 测量大鼠的最大负重能力

1. 准备两个试管、一个钩子和一个约 80 厘米长的环紧固件。将钢球放入试管中，确保试管、钩子和环紧固件的初始总重量为 150 克。以 10 g 的增量制备不同总重量的试管，最大重量为 350 g。
2. 研究人员用双手用手套固定大鼠（图 1）。另一位研究人员将试管放在大鼠背部距离背部中线约 1 厘米处。由于此步骤不需要大鼠移动，因此只需将钩环紧固件缠绕在大鼠身上即可进行固定，而无需使用额外的措施来固定管子。
3. 更换试管，直到达到大鼠的最大体重。当老鼠达到最大负重时，它在刺激或实验者离开时无法站立。将重量减轻 10 克，让大鼠站立。这个重量代表大鼠的最大负重能力。

3. 准备重物

1. 由于训练期间需要安全固定，因此根据大鼠大小使用 1-1.5 m 弹性治疗胶带固定物体，具有很强的附着力。使用粘土调整试管的重量，以减少负载的摆动。
2. 称量试管和固定物的重量后，在试管中加入适量的粘土，使其调整到目标重量。使用玻璃搅拌棒将粘土均匀地涂抹在试管内。浓缩在试管一端的粘土可能会导致它在训练过程中容易脱落。
3. 将调整后的试管和粘土的总重量调整为大鼠最大承重能力的 50%（图 1A）。超过这个重量会使大鼠难以完成训练。在实验结束之前，不要再次调整负载的重量。

4. 确定类固醇诱导的股骨头模型骨坏死

1. 使用甲泼尼龙结合脂多糖 （LPS+MPS） 方法建立 SONFH 模型^16,17。使用标准针头在大鼠腹部中线每 24 小时一次腹膜内注射 LPS （20 μg/kg），总共注射 2 次。
2. 最后一次 LPS 注射后，在正常进食后 24 小时将 MPS （40 mg/kg） 注射到单侧臀肌中，每 24 小时继续注射一次，在两个臀部区域之间交替，总共注射 3 次。

5. 使用弹性治疗胶带和跑步机训练的无张力负重固定

1. 在大鼠的背部中线两侧 1-2 cm 处标记;这是重量负载的参考点。确保标记位置适当，以防止大鼠在跑步机训练期间倾斜或阻碍运动。
2. 一名研究人员使用手套固定大鼠，将一只手放在大鼠的腋下以固定前肢和下巴，而另一只手固定后肢和尾巴。避免过度用力以防止压力或窒息（图 1B）。
3. 将弹性治疗胶带粘在试管上，不要施加张力，以将负载固定在大鼠的背部。在缠绕过程中，请勿拉伸弹性治疗胶带，以实现无张力固定。
   注意:此型号中使用的弹性治疗胶带专为在剧烈体育活动期间贴胶带而设计，提供高粘附力和弹性¹⁸.由于其高弹性，它大大减少了爬行时对大鼠运动的影响。
4. 请第二位研究者将试管固定在大鼠背部，平行于大鼠脊柱，固定位置基于所做的标记，即距离大鼠背部两侧中线 1-2 厘米。
5. 为了尽量减少大鼠的痛苦，减少对大鼠运动的影响，并降低因固定引起的死亡率，请在不施加张力的情况下进行固定。将调整重量的试管粘在弹性治疗胶带上，然后使用无张力技术将试管缠绕在大鼠的身体上。
6. 确保无张力固定并保持弹性治疗胶带的原始长度而不拉伸，以防止对大鼠呼吸和运动产生任何不利影响（图 1C）。
7. 将试管缠绕在大鼠体内后，将大鼠放在空旷空间或单个笼子中，监测其呼吸和方向。如果出现呼吸急促或张口的迹象，请立即释放大鼠以防止窒息。
   1. 理想的固定可以让大鼠自由移动并进行饮水、抬起前肢和进食等活动（图 1D）。如果固定效果不令人满意，则暂时释放并在 20 分钟后重新固定，以尽量减少由于反复固定刺激对大鼠造成的压力。
8. 打开电源并将跑步机设置为 1 m/min，倾斜度为 0°。跑步机训练时间为 30 分钟。轻轻地将大鼠转移到跑步机上并启动计时器。
9. 不要给老鼠提供额外的刺激。如果大鼠无法完成 30 分钟的训练，请将其放在笼子中休息 10 分钟，不要移除固定物。
   注意:本研究中使用的弹性治疗胶带具有出色的拉伸性和粘合性。当正确固定无张力时，长期固定不会导致试管脱落或导致大鼠窒息死亡。
10. 训练结束后，清理大鼠留下的粪便和尿液，喷洒酒精以消除动物气味。
11. 避免上述步骤被其他老鼠看到，并尽可能轻柔地处理动物，以防止动物发声，从而对其他老鼠造成创伤性压力。
12. 完成训练后立即将大鼠从固定中释放出来（图 1E）。在释放过程中，用手指按压大鼠的皮毛以保护它，最大限度地减少释放过程中的皮毛损失（图 1F）。

6. 动物分组

1. 为了研究负重训练对 SONFH 的影响，将 60 只大鼠随机分为四组。
2. 在对照组中，不要建立常见的类固醇诱导的股骨头骨坏死 （SONFH） 模型或进行负重训练。在控制 + 负荷组中，仅进行负重训练，而不建立类固醇诱导的股骨头模型骨坏死。在模型组中，仅建立类固醇诱导的股骨头模型骨坏死。在 Model+Load 组中，在建立类固醇诱导的股骨头模型骨坏死后进行负重训练。

7. 安乐死和标本采集

1. 将大鼠放入小动物安乐死室中，并注入足够的二氧化碳以达到高于 5% 的浓度。一旦大鼠失去知觉，通过心内注射施用 0.3 mL/kg 体重的 20% 氯化钾溶液，总计 20 mL。
2. 监测大鼠的呼吸和心跳，以确保它们在安乐死期间不会感到疼痛或不适。通过检查是否有呼吸和心跳来确认死亡。喷洒酒精以清除任何异味。
3. 安乐死后，解剖大鼠的臀部区域并取出股骨头，同时保持股骨完整。预处理后进行 microCT 扫描，然后进行苏木精-伊红 （HE） 染色。

8. 苏木精-伊红染色

1. 建模完成后，对大鼠实施安乐死。去除股骨进行 HE 染色。
2. 将大鼠股骨浸泡在 4% 多聚甲醛中 24 小时，以保存生物组织作为标本。将大鼠股骨标本浸泡在 5% 甲酸中脱钙 5 天。
3. 将标本分成 5 μm 切片用于 HE 染色。
   注意:空腔隙是指骨组织¹⁹ 中通常应包含骨细胞的腔隙中没有这些细胞的情况。它是评估骨组织健康状况的重要指标。在骨坏死的病理过程中，供血不足可能导致骨细胞死亡，导致空腔隙。在骨坏死的诊断和评估中，空腔的数量和分布是衡量疾病严重程度的重要参数^20,21。
   1. 将大鼠股骨标本放入熔融的石蜡（56-60°C）中，首先浸泡在低熔点石蜡中，如有必要，然后逐渐转移到高熔点石蜡中，每次约1小时，以确保石蜡彻底浸润组织。
   2. 准备包埋模具，将熔化的石蜡倒入模具中至适当的深度。浸泡后用镊子从石蜡中取出组织样本，去除多余的石蜡，然后放入模具中。冷却至室温以使石蜡固化，形成石蜡块。
   3. 使用石蜡切片机，将包埋的石蜡块切成 5 μm 厚的切片。
4. 将带有附着切片的大鼠股骨标本在载玻片加热器中烘烤 1 小时，以增强切片与盖玻片之间的粘附力，并减少后续染色过程中的漂浮。
5. 将烤好的切片依次浸入纯二甲苯中以去除石蜡，然后通过无水乙醇、梯度乙醇（100%、95%、80%、70%）和水进行一系列脱水，每次 2 分钟，完成脱蜡和再水化过程。
6. 将脱蜡切片浸入苏木精染色溶液中并染色 10 分钟。用流水冲洗以去除未结合的苏木精。
7. 将苏木精染色的切片浸入伊红染色溶液中并染色 2 分钟以使细胞质和结缔组织着色。用 1% 乙酸溶液冲洗以固定染色效果。
8. 将大鼠股骨标本切片依次浸入 70%、80%、90%、95% 和 100% 乙醇中，每个梯度 2 分钟，逐渐去除水分。
9. 将大鼠股骨标本切片浸入纯二甲苯中以获得透明度，然后用流水冲洗以去除二甲苯。涂上中性封片树脂，覆盖载玻片，轻轻敲击以去除气泡，并让封片剂凝固以完成封片过程。
10. 使用 R 中的 randomizr 包，为每组选择 30 张 HE 染色载玻片，并将每组 15 张载玻片分配给两名研究人员。在不告知他们分组的情况下，让研究人员计算载玻片的空隙率，并收集结果进行统计分析。

9. MicroCT 分析

1. 建模完成后，对大鼠实施安乐死。去除股骨进行苏木精-伊红染色。
2. 将大鼠股骨浸泡在 4% 多聚甲醛中 24 小时，以保存生物组织作为标本。将大鼠股骨放入小动物专用 microCT 设备中。
3. 将 microCT 扫描条件设置如下:X 射线电压:80 kV，电流:100 μA，单次曝光时间:50 ms，扫描分辨率:25 μm。以 0.5° 的间隔进行扫描，重点关注从软骨下方到骨骺上部的小梁作为感兴趣区域。
4. 将大鼠股骨颈上方的区域定义为感兴趣区域。
5. 使用 microCT 设备对扫描结果进行冠状面重建，并收集由 microCT 设备内置软件生成的骨形态测量数据。记录以下观察指标:总体积 （TV）、骨体积百分比 （BV/TV）、骨表面积/体积比 （BS/BV）、结构厚度 （Tb.Th）、结构分离 （Tb.Sp）、骨数量 （Tb.N）、骨密度 （BD）。

10. 统计分析

1. 将数据表示为平均值±标准差 （SD）。使用独立样本 t 检验进行显微 CT 和定量组织学评估的统计分析。将 p 值< 0.05 视为统计显著性。

组织病理学分析
苏木精和伊红染色显示，对照组和对照组 + 负荷组骨小梁完整且排列规则。血管内皮细胞存在于骨凹坑中，细胞形态显得丰满。相比之下，模型组和模型 + 负荷组表现出骨折和无序的骨小梁，以及空腔隙的数量显着增加。与 Model 组相比，Model+Load 组有更多的空隙。在模型组中，骨髓内的一些细胞表现出脂质积累，而模型+负荷组中的骨髓腔似乎相对空置（图 2A）。对照组、控制+负荷组、模型组和模型+负荷组的空隙率分别为 6.0 ± 2.5、6.4 ± 3.8、57.6 ± 29.6 和 78.2 ± 15.5（图 2B）。

MicroCT 分析
microCT 结果清楚地显示了骨小梁的微观结构，反映了组织结构的完整性和骨量的变化。在本研究中，对照组和 Control+Load 组的小梁致密、排列整齐且清晰可见。在模型组中，小梁稀疏，表现出无序和不规则的排列。在 Model+Load 组中的骨骺线以上，小梁形态不完整。所有四组的股骨头都显得光滑，没有明显的塌陷（图3A）。

对骨骼结构、形态和尺寸进行了量化。TV 表示感兴趣区域的总体积，它可以间接反映骨形态是否发生了显着变化¹⁹。TV 显示 4 组间差异无统计学意义，表明糖皮质激素诱导损伤模型的构建和机械压力负荷的干预均不会导致大鼠股骨头塌陷。BV/TV 可以反映骨量²²。Control+Load 组的骨量显著高于 Control 组，Control 组和 Control+Load 组的骨量均远高于 Model 组和 Model+Load 组。与模型组相比，模型 + 负载组中的 BV/TV 最低。同时，BD 结果与 BV/TV²³ 相印证，表明机械压力负荷干预可以在没有激素干预的情况下促进股骨头的骨形成，同时抑制接受糖皮质激素干预的股骨头骨形成。

BS/BV 可以间接反映小梁疾病²⁴。对照组、对照组+负荷组、模型组、模型+负荷组小梁疾病依次增加，提示机械压力负荷干预可能加剧正常骨组织和糖皮质激素损伤骨组织的骨小梁疾病。Tb.Th 代表小梁厚度^19，Tb.N 代表小梁数量²⁰。这两个指标都与骨骼形成呈正相关。在本研究中，对照组的 Tb.N 和 Tb.Th 显著低于对照组 + 负荷组。模型组和模型+载荷组中的 Tb.N 和 Tb.Th 显著低于对照组和控制+载荷组，与模型组相比，模型 + 载荷组显著降低。这表明机械压力负荷可能会增加小梁的数量和厚度，而机械压力负荷可能会对糖皮质激素干预后骨骼产生相反的影响。

Tb.Sp 代表小梁之间的间隙，与骨量呈负相关²²。在这项研究中，Tb.Sp 表现出与 Tb.N 和 Tb.Th 相反的趋势，证实了 Tb.N 和 Tb.Th 的结果（图 3B）。microCT 结果表明，有或没有糖皮质激素干预的机械压力负荷可能对股骨头产生相反的影响。对于没有糖皮质激素干预的股骨头，机械压力负荷可能会促进骨形成。然而，当骨骼受到糖皮质激素损伤时，机械压力负荷干预可能会加剧类固醇诱导的股骨头骨坏死。

图 1:无张力负重固定。 （A） 测量负载的重量。（B） 研究人员保护大鼠。（C） 无张力固定。（D） 固定完成。（E） 两人合作释放注视点。（F） 在固定接触时保护大鼠的皮毛。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:苏木精和伊红染色。 （A） 苏木精和伊红染色。 （B） 空腔隙的百分比 （n =15）。使用独立样本 t 检验进行统计分析。误差线显示平均值±标准差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:MicroCT 分析。 （A） 来自 microCT 的二维重建图像。（B） 骨形态测量结果 （n = 15）。使用独立样本 t 检验进行统计分析。误差线显示平均值±标准差。 请单击此处查看此图的较大版本。

目前，兔子²⁵、大鼠²⁶、小鼠²⁷、猪²⁸、肉鸡²⁹、鸵鸟⁸ 、鸸鹋³⁰ 等各种动物可用于建立股骨头坏死模型。其中，大鼠、小鼠和兔子是最常用的物种。大鼠作为股骨头坏死的模型，具有许多优点。大鼠易于喂养和繁殖，生长迅速，具有与人类相似的生理和代谢特性。它们的股骨头大小适中，适合进行放射学和病理学研究²⁶。然而，作为较小的四足动物，大鼠在运动过程中后肢承受的负荷较低，这使得使用常规大鼠模型研究机械压力负荷与股骨头坏死发展之间的关系具有挑战性。

这只老鼠有一个纺锤形的身体和光滑的皮毛，这使得使用传统的固定方法固定重物具有挑战性，这会显着影响老鼠的活动能力。在我们研究的早期阶段，我们尝试使用胶带、尼龙带和牵引绳等方法固定大鼠，但没有一个产生令人满意的结果。通过不断的实验，我们成功地采用了弹性治疗胶带和无张力技术，使大鼠在负重行走训练中能够以最小的限制承受一定的负荷。事实证明，这种简单且具有成本效益的模型是成功的。它满足实验要求，能够探索机械压力负荷对类固醇诱导的股骨头坏死的影响。

这里讨论了 rat 模型的一些故障排除注意事项。皮肤病变:反复使用弹性治疗胶带可能导致大鼠身体出现皮毛脱落和皮肤损伤。如果毛皮只有脱落且没有溃疡，请勿进行任何特殊处理。弹性治疗胶带可以贴在裸露的皮肤上 4 天而不会产生不良反应。如果皮肤破损，用碘伏对大鼠进行消毒，并在病变愈合后继续使用贴剂。弹性治疗胶带是安全的，在我们的研究中尚未观察到过敏。无张力胶带不会拉扯皮肤，也不会引起水泡;弹性治疗胶带可以直接贴在裸露的皮肤上。窒息死亡:如果固定太紧，大鼠可能会因窒息而死亡。完成后，观察大鼠的呼吸。例如，如果老鼠张开嘴呼吸或剧烈挣扎，则可能表明注视不良。立即松开胶带;否则，大鼠可能会在 5 到 10 分钟内死亡。胃内容物反流:如果在固定后在大鼠的嘴部观察到深色胃内容物，则表明固定存在严重问题。应及时纠正这种情况，并应审查固定技术。此时，大鼠剧烈疼痛，应立即实施安乐死。

到目前为止，关于机械压力的主要模型是那些专注于卸载¹² 的模型，主要用于模拟废弃性骨质疏松症或低重力条件下的骨质疏松症。我们的模型在干预方面与卸载模型不同;我们对大鼠施加了更高的负荷，这是一种不太常见的干预方法。然而，通过这种干预，我们提供了一个研究模型，用于研究股骨头坏死的早期阶段以及在类固醇诱导的股骨头骨坏死的早期阶段应该如何进行负重训练。这项研究发现，不受皮质类固醇影响的股骨头不会因负重训练而失去骨量。在受类固醇影响的股骨头中，大型负重训练可能会促进 SONFH 的发展。

自发性高血压大鼠在股骨头也表现出高压状态，与机械压力干预类似，高血压大鼠更容易发生股骨头坏死^31,32。尽管两种模型得出的结论相似，但除了出现股骨头坏死的症状外，自发性高血压大鼠还会出现内皮细胞损伤和骨髓腔脂肪生成⁹。然而，血管和髋关节机械压力引起的股骨头坏死的机制存在显着差异。自发性高血压模型的建模时间较长，成功率较低。

此外，本研究采用无张力固定技术。除了最大限度地减少对动物运动的影响外，该技术还可以减少创伤性压力，并且如果操作得当，不会导致大鼠窒息或死亡。这两个步骤在本研究中至关重要。

该技术不仅适用于股骨头坏死的研究，还可以作为运动医学、负重训练和耐力训练相关研究的参考模型。现有的负重固定模型无法长时间固定负重物体。因此，该模型为需要长时间负重的研究提供了一种可行的选择。

这项研究有一些局限性。由于成本限制和其他原因，我们没有测量不同阶段股骨头的变化，基线测量的数量相对较少。本研究中的类固醇剂量也参考了其他模型，没有讨论极高剂量的类固醇对该模型的影响。

作者声明不存在可能影响本研究客观性或结果的利益冲突、从属关系或合作。

这项研究是一项独立研究，没有获得任何资助。