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Eine kohärente Raman-Streubildgebungsmethodik zur Visualisierung und Quantifizierung pharmazeutischer Verbindungen in der Haut wird beschrieben. Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung von Hautgewebe (Mensch und Maus) und die topische Formulierungsanwendung, die Bildaufnahme zur Quantifizierung der räumlich-zeitlichen Konzentrationsprofile und die vorläufige pharmakokinetische Analyse zur Beurteilung der topischen Arzneimittelabgabe.
Die kutane Pharmakokinetik (cPK) nach topischer Formulierungsanwendung war ein Forschungsgebiet von besonderem Interesse für Regulierungs- und Arzneimittelentwicklungswissenschaftler, um die topische Bioverfügbarkeit (BA) mechanistisch zu verstehen. Semi-invasive Techniken wie Tape-Stripping, dermale Mikrodialyse oder dermale Open-Flow-Mikroperfusion quantifizieren alle die cPK auf der Makroskala. Während diese Techniken ein umfangreiches cPK-Wissen geliefert haben, fehlt der Gemeinschaft ein mechanistisches Verständnis der Penetration und Permeation von Wirkstoffen (API) auf zellulärer Ebene.
Ein nichtinvasiver Ansatz zur Behandlung von cPK im Mikromaßstab ist die kohärente Raman-Streubildgebung (CRI), die selektiv auf intrinsische molekulare Schwingungen abzielt, ohne dass extrinsische Markierungen oder chemische Modifikationen erforderlich sind. CRI verfügt über zwei Hauptmethoden - kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuung (SRS), die eine empfindliche und selektive Quantifizierung von APIs oder inaktiven Inhaltsstoffen ermöglichen. CARS wird typischerweise verwendet, um strukturelle Hautinformationen abzuleiten oder chemische Kontraste zu visualisieren. Im Gegensatz dazu wird das SRS-Signal, das linear mit der molekularen Konzentration ist, verwendet, um APIs oder inaktive Inhaltsstoffe innerhalb von Hautschichtungen zu quantifizieren.
Obwohl Mausgewebe üblicherweise für cPK mit CRI verwendet wurde, müssen topische BA und Bioäquivalenz (BE) letztendlich in menschlichem Gewebe vor der behördlichen Zulassung beurteilt werden. Dieses Papier stellt eine Methodik zur Vorbereitung und Abbildung von Ex-vivo-Haut vor, die in quantitativen pharmakokinetischen CRI-Studien bei der Bewertung von topischem BA und BE verwendet werden soll. Diese Methodik ermöglicht eine zuverlässige und reproduzierbare API-Quantifizierung in der Haut von Mensch und Maus im Laufe der Zeit. Die Konzentrationen in lipidreichen und lipidarmen Kompartimenten sowie die Gesamt-API-Konzentration im Laufe der Zeit werden quantifiziert; Diese werden für Schätzungen von mikro- und makroskaligen BA und möglicherweise BE verwendet.
Die Methoden zur Bewertung der cPK nach der Anwendung des topischen Arzneimittels haben sich von klassischen In-vitro-Permeationstests (IVPT) Studien 1,2,3,4,5 und Tape-Stripping 6,7,8 auf zusätzliche Methoden wie Open-Flow-Mikroperfusion oder dermale Mikrodialyse 9,10,11 ausgeweitet. 12,13,14. Es gibt potenziell verschiedene lokale Orte therapeutischer Wirkung, abhängig von der interessierenden Krankheit. Daher kann es eine entsprechende Anzahl von Methoden geben, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß zu bewerten, mit der eine API an den beabsichtigten lokalen Ort der Aktion gelangt. Während jede der oben genannten Methoden ihre Vorteile hat, ist der Hauptnachteil der Mangel an cPK-Informationen im Mikromaßstab (dh die Unfähigkeit zu visualisieren, wohin die API geht und wie sie durchdringt).
Eine nichtinvasive Methodik von Interesse zur Schätzung von topischem BA und BE ist CRI, die in zwei Bildgebungsmodalitäten unterteilt werden kann: CARS und SRS-Mikroskopie. Diese kohärenten Raman-Methoden ermöglichen eine chemisch spezifische Bildgebung von Molekülen über nichtlineare Raman-Effekte. In CRI werden zwei Laserpulszüge fokussiert und innerhalb einer Probe gescannt; Der Energieunterschied zwischen den Laserfrequenzen wird so eingestellt, dass er auf Schwingungsmoden abzielt, die für die interessierenden chemischen Strukturen spezifisch sind. Da CRI-Prozesse nichtlinear sind, wird ein Signal nur am Mikroskopfokus erzeugt, was eine dreidimensionale pharmakokinetische tomographische Abbildung des Gewebes ermöglicht. Im Rahmen von cPK wurde CARS verwendet, um gewebestrukturelle Informationen zu erhalten, wie z.B. die Lage lipidreicher Hautstrukturen15. Im Gegensatz dazu wurde SRS verwendet, um die molekulare Konzentration zu quantifizieren, da sein Signal linear mit der Konzentration ist. Für Ex-vivo-Hautproben ist es vorteilhaft, CARS in der epi-Richtung16 und SRS im Getriebemodus17 durchzuführen. Daher ermöglichen dünne Gewebeproben die Erkennung und Quantifizierung von SRS-Signalen.
Als Modellgewebe bietet das nackte Mausohr mehrere Vorteile mit kleineren Nachteilen. Ein Vorteil ist, dass das Gewebe bereits ~200-300 μm dick ist und keine weitere Probenvorbereitung erfordert. Darüber hinaus werden mehrere Hautschichtungen durch axiale Fokussierung durch ein Sichtfeld (z. B. Stratum corneum, Talgdrüsen (SGs), Adipozyten und subkutanes Fett) beobachtet16,18. Dies ermöglicht eine vorläufige präklinische Abschätzung der kutanen Permeationswege und topische BA-Schätzungen, bevor zu menschlichen Hautproben übergegangen wird. Das Nacktmausmodell weist jedoch Einschränkungen auf, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Extrapolation auf In-vivo-Szenarien aufgrund von Unterschieden in der Hautstruktur19. Während das nackte Mausohr ein ausgezeichnetes Modell ist, um vorläufige Ergebnisse zu erhalten, ist das Modell der menschlichen Haut der Goldstandard. Obwohl es verschiedene Kommentare zur Eignung und Anwendbarkeit gefrorener menschlicher Haut zur genauen Rekapitulation der In-vivo-Permeationskinetik gegeben hat 20,21,22, ist die Verwendung von gefrorener menschlicher Haut eine anerkannte Methode zur Bewertung der In-vitro-API-Permeationskinetik 23,24,25 . Dieses Protokoll visualisiert verschiedene Hautschichten in der Haut von Mäusen und Menschen und quantifiziert die API-Konzentrationen in lipidreichen und lipidarmen Strukturen.
Während CRI in zahlreichen Bereichen eingesetzt wurde, um Verbindungen in Geweben spezifisch sichtbar zu machen, gab es begrenzte Bemühungen, die cPK von topisch applizierten Arzneimitteln zu untersuchen. Um den topischen BA/BE von topischen Produkten mit CRI zu bewerten, ist es notwendig, zunächst ein standardisiertes Protokoll zu haben, um genaue Vergleiche anzustellen. Frühere Bemühungen mit CRI für die Arzneimittelabgabe an die Haut haben eine Variabilität innerhalb der Daten gezeigt. Da es sich um eine relativ neue Anwendung von CRI handelt, ist die Erstellung eines Protokolls von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten 18,26,27. Dieser Ansatz zielt nur auf eine bestimmte Wellenzahl im biologisch stillen Bereich des Raman-Spektrums ab. Die meisten APIs und inaktiven Inhaltsstoffe weisen jedoch Raman-Verschiebungen innerhalb des Fingerabdruckbereichs auf. Dies stellte bisher aufgrund des inhärenten Signals, das vom Gewebe im Fingerabdruckbereich ausgeht, vor Herausforderungen. Jüngste Fortschritte in den Bereichen Laser und Berechnung haben diese Barriere beseitigt, die auch in Kombination mit dem hier vorgestellten Ansatz genutzt werden kann28. Dieser hier vorgestellte Ansatz ermöglicht die Quantifizierung einer API, die eine Raman-Verschiebung in der stillen Region (2.000-2.300 cm-1) aufweist. Dies ist nicht auf die physiochemischen Eigenschaften des Arzneimittels beschränkt, was bei einigen zuvor erwähnten cPK-Überwachungsmethoden der Fall sein könnte29.
Das Protokoll muss die Variabilität der Hautdicke von Probe zu Probe für verschiedene Präparate reduzieren, da dicke menschliche Hautproben nach der Anwendung des Arzneimittels aufgrund der Lichtstreuung durch die dicke Probe ein minimales Signal erzeugen. Ein Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methodik der Gewebepräparation vorzustellen, die reproduzierbare Bildgebungsstandards gewährleistet. Darüber hinaus ist das CRI-System wie beschrieben eingerichtet, um potenzielle Fehlerquellen zu reduzieren und Signal-Rauschen zu minimieren. Dieses Papier wird jedoch nicht die Leitprinzipien und technischen Vorteile des CRI-Mikroskops diskutieren, da dies zuvorbehandelt wurde 30. Schließlich wird das umfangreiche Datenanalyseverfahren untersucht, um eine Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen, um den Erfolg oder Misserfolg eines Experiments zu bestimmen.
Die Verwendung von nacktem Mausohrgewebe wurde vom Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, während die Verwendung von menschlichem Hautgewebe vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB) genehmigt wurde. Gemäß den IACUC-Protokollen wurden frisch eingeschläferte Mäuse von Kollaborateuren mit nackten Mäusekolonien erhalten. Menschliches Gewebe wurde aus elektiven Abdominoplastik-Verfahren am Massachusetts General Hospital über ein genehmigtes Protokoll gewonnen. Darüber hinaus wurden bestimmte andere Gewebetypen als die Bauchhaut über eine Körperspendebehörde erworben, ebenfalls durch ein vom IRB genehmigtes Protokoll.
1. Vorbereitung des Gewebes
Abbildung 1: Bilder mit idealer Dicke für die Abbildung von Maus- und Menschenhaut. (A) Mausohrhaut gegen Licht gehalten, das sichtbar Licht durchlassen kann. (B) Ideale menschliche Haut, die nach der Zubereitung an Licht gehalten wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Laser- und Mikroskopaufbau
Abbildung 2: Schematische Anordnung für einen kohärenten Raman-Laserbildgebungspfad. Die Strahlen werden unabhängig voneinander für die Spotgröße konditioniert und über eine Zeitverzögerungsstufe angepasst, um eine kohärente Raman-Streuung in Samples für die gewünschte Abstimmfrequenz zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Lipid-Bildgebung
Abbildung 3: Beispiel für mit SRS ermittelte Hauttiefen. Die oberen Bilder stammen aus nackter Mausohrhaut, die Folgendes darstellt: (A) stratum corneum, (B) Talgdrüsen, (C) Adipozyten, (D) subkutanes Fett. Der untere Satz von Bildern stammt von menschlicher Haut, die Folgendes darstellen: (E) Stratum corneum, (F) papilläre Dermis und (G) eine Talgdrüse. Maßstabsstäbe = 100 μm. Sowohl Maus- als auch menschliche Hautbilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv bei 1024 Pixeln x 1024 Pixeln aufgenommen; das menschliche SG wurde mit 512 x 512 Pixeln aufgenommen. Abkürzungen: SRS = stimulierte Raman-Streuung; SG = Talgdrüse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Anwendung der topischen Formulierung
5. Versuchsaufbau zur Wirkstoffquantifizierung
Abbildung 4: Gewebebewegung in nackter Mausohrhaut, demonstriert durch die Visualisierung von Talgdrüsen. Ein Beispiel für eine begrenzte Gewebebewegung ist in A und B dargestellt, während eine wesentliche Gewebebewegung in C und D dargestellt ist. (A) zeigt die Talgdrüsen zum Zeitpunkt der Formulierungsanwendung und (B) die gleiche Tiefe bei 120 min nach der Anwendung. (C) Talgdrüsen der Maus zum Zeitpunkt der Formulierungsanwendung und (D) 120 min nach der Anwendung der Formulierung; Die Talgdrüsen sind kaum sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, dass dieses Experiment die Aufnahme in die Talgdrüsen während der gesamten experimentellen Dauer nicht gemessen hat. Maßstabsstäbe = 100 μm. Bilder sind 1024 Pixel x 1024 Pixel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
6. Datenanalyse
Abbildung 5: Intensitäts- und Zeitprofile. (A) Ein Beispiel für Flussprofile, die eine Sättigung und damit nur eine Abnahme der Intensität erreicht haben, ist zu sehen. Jeder ROI hat ein anderes Flussprofil, um die Heterogenität in den Daten zu demonstrieren, die man erfassen könnte. (B) Ein Beispiel für Konzentrationen, die nach Beginn der Bildgebung zunehmen. Jeder ROI ist ein anderes Sichtfeld (angezeigt durch die verschiedenen Farbspuren) innerhalb desselben Gewebes desselben Experiments. Zusätzlich zu den globalen Konzentrationen besteht die Möglichkeit aufzuklären, welche lokale Umgebung ein API / eine Formulierung bevorzugt, wie von lipidreichen und lipidarmen Regionen angegeben. Die in A dargestellten Profile deuten darauf hin, dass es keine Absorption des Arzneimittels in das Gewebe gibt, da der Wirkstoff bereits durchdrungen ist und begonnen hat, das Gewebe zu verlassen, sobald die Bildgebung begonnen hat. In B hat das Gewebe jedoch keine Sättigung erreicht, und es gibt immer noch eine Absorption des API, gefolgt von einer Eliminierung. Die Segmentierung der Bilder in lipidreiche und lipidarme Bilder hilft bei der Aufklärung der Lokalisation des API (oder der Inaktiven) und der Permeationswege in die Haut (d.h. Stratum corneum). Eine höhere Konzentration innerhalb der lipidreichen Regionen weist darauf hin, dass der Wirkstoff in der Lipidstruktur der untersuchten Schicht lokalisiert ist, was zu gezielten Informationen über die Arzneimittelabgabe beiträgt. Abkürzungen: ROI = Region of interest; API = pharmazeutischer Wirkstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Bildgebung gilt als erfolgreich, wenn sich das Gewebe nach Abschluss des Experiments weder axial (<10 μm) noch in lateraler Richtung signifikant bewegt hat (Abbildung 4). Dies ist ein unmittelbarer Hinweis darauf, ob die SRS-Messung für den API of Interest nicht repräsentativ für die Anfangstiefe ist, für die die Quantifizierung schichtspezifisch ist. Dies wird durch die Abbildung von Z-Stacks für jede XY-Position von Interesse gemildert, wobei der Kompromiss die zeitliche Auflösung ist. Wenn in diesen Studien gefrorene Haut verwendet wird, sind die Penetration und Permeation des API im Vergleich zu frischer Haut schnell, und es ist eine minimale Zeit zwischen der Anwendung der Formulierung und dem Beginn der Bildgebung unerlässlich. Eine weitere Überlegung ist das Ziel, das für die Experimente verwendet wird. Bei Verwendung eines 60-fachen Objektivs ist die Auswahl einer flachen Fläche innerhalb eines einzigen Sichtfelds (FOV) relativ einfach. Für ein 20-faches Objektiv ist das betrachtete Feld jedoch viel größer, und daher ist ein wichtiger Schritt in der Gewebepräparation die Gewährleistung eines gleichmäßigen Kontakts der Haut mit der Glasboden-Bildgebungsschale. Ein flaches Sichtfeld und eine ähnliche Tiefe im Vergleich zur ursprünglichen Tiefe innerhalb des Sichtfelds sind zwei Schlüssel zu positiven Ergebnissen.
Die Ausrichtung des Lasers sowie der Dynamikumfang des Bildes müssen mit größter Sorgfalt angegangen werden. Eine Fehlausrichtung der Laserpulszüge in das Mikroskop kann zu einer Vielzahl von Problemen führen, einschließlich niedriger Signalpegel oder ungleichmäßig angeregter FOVs, die zu kontrastarmen Bildern führen können. Eine weitere Überlegung besteht darin, sicherzustellen, dass bei der Bildaufnahme der gesamte Dynamikbereich der Intensitätswerte genutzt wird. Andernfalls werden die Bilddaten komprimiert, und Konzentrationsunterschiede sind möglicherweise schwer zu erkennen.
Eine weitere Überlegung ist, dass die Heterogenität der Haut zu Variationen in den berechneten mikroskaligen Flussprofilen innerhalb desselben Datensatzes führen kann. Die Intensitäten (ein Proxy für Konzentrationen) beginnen hoch und nehmen über die experimentelle Dauer ab (Abbildung 5A), während andere Studien auf eine Zunahme gefolgt von einer Abnahme des Flusses über die experimentelle Dauer hinweisen (Abbildung 5B). Derzeit kann die absolute Konzentrationsquantifizierung aufgrund des Versuchsaufbaus nicht sofort erfolgen. Daher sind Konzentrationen, die nach der Anwendung abnehmen, möglicherweise das Ergebnis einer Sättigung innerhalb der Tiefe des Interesses, und die Quantifizierung stellt nur die API-Eliminierung dar. Wenn der Dynamikumfang nicht groß genug oder die Haut zu dick ist, werden die Konzentrationen bei der visuellen Inspektion stagniert, so dass sich während der Bildgebungsdauer keine Änderung ergibt. Dies ist eine Funktion sowohl eines suboptimalen Dynamikbereichs als auch der Hautdicke, was darauf hindeutet, dass das Experiment wiederholt werden muss.
Die Konzentrations-Zeit-Profile werden dann der NCA jedes Profils unterzogen, um die Exposition, den maximalen Fluss und die Zeit bis zum maximalen Fluss zu schätzen. Die statistische Analyse (Abbildung 6) wird unter experimentellen Bedingungen durchgeführt, um Kovariaten weiter zu untersuchen, die zu potenziellen Unterschieden in den Expositionen beitragen. Vergleiche der globalen cPK-Parameter geben Aufschluss darüber, welche Formulierung einen höheren Fluss oder eine höhere Exposition bietet. Im Gegensatz dazu werden die mikroskaligen cPK-Parameter (d.h . die lipidreichen und lipidarmen Regionen) Aufschluss über die lokalen Bioverteilungs- und Permeationswege geben. Wenn beispielsweise zwei Formulierungen mit der gleichen API-Konzentration verglichen werden und sich in den inaktiven Inhaltsstoffen unterscheiden, kann eine Formulierung dazu neigen, das Stratum corneum über die lipidreiche Region im Vergleich zu der der lipidarmen Region zu durchdringen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass diese spezifische Formulierung die Permeation in Richtung der lipidreichen Regionen "schiebt", um die Penetration und Permeation zu erleichtern.
Abbildung 6: Beispiel für eine NCA-Analyse des Konzentrations-Zeit-Profils aus dem Ohrgewebe der Maus. (A) Ein Beispiel für eine tmax-Analyse (Zeit, in der die maximale Konzentration auftritt) zwischen zwei Formulierungen für denselben API. Diese Analyse zeigt, dass das 2-(2-Ethoxyethoxy)ethanol im Vergleich zur Gelformulierung eine verlängerte API-Permeation bietet, unabhängig von der Hautschicht. Es kann auch gesehen werden, dass das tmax für die SC-Schicht länger ist als das SG, was darauf hindeutet, dass die 2-(2-Ethoxyethoxy) -Ethanolformulierung weiterhin API liefert, selbst wenn die Bildgebungsdauer abgelaufen ist. (B) Ein Beispiel für eine Analyse der Gesamtexposition zwischen derselben Formulierung/API-Kombination in A , aber in Tiefen weiter in die Haut. Diese Zahl wurde von18 geändert. Abkürzungen: SC = stratum corneum; SG = Talgdrüse; AD = Adipozyten; SCF = subkutanes Fett. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle S1: Beispieldatensatz aus manueller Bildanalyse. Die Spalten geben die Informationen an, die aus dem Abschnitt Datenanalyse dieses Manuskripts gewonnen wurden (z. B. Rahmen, Fläche, Mittelwert, min, max, Median), während zusätzliche Spalten für die Verwendung in einer cPK-Analyse hinzugefügt wurden (z. B. Layer, Region, time_minutes). Diese Daten können über NCA analysiert und aufgetragen werden, um das Konzentrationsprofil innerhalb der SG-Hautschicht zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Die Evaluation von topischem BA/BE ist ein Forschungsgebiet, das einen facettenreichen Ansatz erfordert, da keine einzelne Methode in vivo cPK vollständig charakterisieren kann. Dieses Protokoll stellt eine Methodik für die Bewertung des BA/BE eines topischen Arzneimittels auf der Grundlage einer kohärenten Raman-Bildgebung vor. Einer der ersten Punkte, die übersehen werden könnten, ist, wie dünn die Hautproben sein müssen, insbesondere für die quantitative Transmissions-SRS-Bildgebung. Wenn die Haut zu dick ist (d.h. Licht kann nicht ohne weiteres durchdringen), wird vom SRS-Detektor wenig bis gar kein Signal gemessen, und es liefert daher schlechte Konzentrationsdaten. Es muss darauf geachtet werden, diese Gewebeproben richtig vorzubereiten, da dies ein Experiment machen oder brechen kann. In Bezug auf das nackte Mausohr ist abgesehen vom Spülen mit PBS und dem Abtupfen des Flecks, um den verbleibenden Schmutz am Ohr zu entfernen, wenig Vorbereitung erforderlich.
Mausohren haben typischerweise eine Dicke von mehreren hundert μm, was für die Übertragung von SRS optimal ist. Menschliche Hautproben sind typischerweise mehrere mm dick, einschließlich Unterhautfett, obwohl die Dicke je nach anatomischer Quelle des Hautgewebes und Alter des Spenders sehr unterschiedlich ist. Daher muss so viel überschüssiges Gewebe wie möglich entfernt werden, um Lipidstrukturen und API-Konzentrationen in der Epidermis und Dermis im Laufe der Zeit genau zu quantifizieren. Wird der Schritt der Gewebepräparation übersehen, dann sind die restlichen Schritte des Versuchsaufbaus weitgehend ungeeignet, da die Ausgangsbedingungen nicht optimal sind.
Das Laser-/Mikroskop-Setup ist die nächste Herausforderung oder der nächste potenzielle Stolperstein. Eine Fehlausrichtung des Lasers im Strahlengang und schließlich im Mikroskop führt zu einem schlechten Kontrast und damit zu schlechten Bildgebungsergebnissen. Es wird empfohlen, zuerst den CARS-Kanal einzurichten, da sein Signal leichter zu finden ist. Die Pumpen- und Stokes-Impulszüge müssen sich sowohl zeitlich als auch räumlich überlappen. Die Ausrichtung des Pumpenlasers wird mit dem Transmissionsdetektor innerhalb der MC-Software des Mikroskops überprüft, wenn der SRS-Detektor aus dem Weg geräumt wird. Beim Anzeigen des CARS-Kanals (ALG1) in der MC-Software wird der Stokes-Strahl entsperrt. Wenn jedoch kein Signal von der Ölprobe vorhanden ist, ist es zunächst notwendig, den Stokes-Strahl auszurichten und dann die Zeitüberlappung anzupassen. Es kann notwendig sein, diese beiden Anpassungen zu iterieren, bis das Signal optimiert ist. Die räumliche Überlappung der beiden Strahlen wird durch einen IR-Viewer auf der Blende betrachtet, während die Zeitverzögerungsstufe (Abbildung 2) so eingestellt ist, dass sich die Strahlen zeitlich überlappen. Diese beiden Ausrichtungsschritte sind entscheidend, um die CARS-Signalerzeugung sicherzustellen.
Sobald ein Signal im CARS-Kanal sichtbar ist, ist der SRS-Kanal (ALG2) der nächste, der eingerichtet werden muss. Mögliche Probleme bei fehlendem Signal sind, dass die Lock-in-Phase oder die Verstärkungseinstellungen zu niedrig sind oder dass der Offset in der Lock-in-Software zu hoch eingestellt ist. Darüber hinaus kann die Kondensatorposition so eingestellt werden, dass das durchgelassene Licht auf die Fotodiode fokussiert und somit das SRS-Signal optimiert wird. Die unsachgemäße Einrichtung des Lasers / Mikroskops führt zu einem Mangel an Signal, wodurch die Konzentrationsschätzungen abgenommen werden und die Permeationsinformationen fehlen. Die Laserleistung der Pumpe und der Stokes-Strahlen kann für individuelle Studien optimiert werden. Es ist jedoch wichtig, dass die Potenzen der Strahlen für jedes Experiment gleich sind. Unterschiedliche Laserleistungen zwischen Replikaten führen zu falschen Konzentrationsunterschieden, die eher auf das Setup als auf die API / Formulierung zurückzuführen sind.
Jede Studie erfordert eine einzigartige Dosisdauer (d. h. die Zeitdauer , in der die Formulierung auf der Haut verbleibt) und muss unabhängig untersucht werden, um die kutane API-Penetration / Permeation zu quantifizieren, da dies formulierungsabhängig ist. Eine weitere Überlegung bei der Entwicklung eines Protokolls ist der okklusive Charakter der Formulierungsanwendung. Es ist wichtig zu wissen, ob die Formulierung so konzipiert wurde, dass sie unter okklusiven oder nichtokklusiven Bedingungen verabreicht werden kann. Die hier vorgestellte CRI-Methodik verwendet ein inverses Mikroskop; Dies bedeutet, dass die Hautoberfläche mit dem Gesicht nach unten und unter okklusiven Einstellungen ist. Ein aufrechtes Mikroskop kann die Möglichkeit bieten, nicht-okklusive Bedingungen zu haben; Die Hautoberfläche ist jedoch möglicherweise nicht flach, was diese Art von Experimenten zu einer Herausforderung machen würde.
Es muss anerkannt werden, dass der okklusive Charakter dieser Experimente nicht die typische klinische Verwendung ist; Nichtsdestotrotz werden Permeationswege in diesen Studien analysiert. Die hier vorgestellte CRI-Methode bietet die Möglichkeit, mikroskalige Veränderungen zu visualisieren und zu quantifizieren, die sonst mit Methoden wie dermaler Mikrodialyse, dermaler Open-Flow-Mikroperfusion, Bandstripping oder IVPT-Studien nicht zu unterscheiden sind. Jüngste Entwicklungen der schnellen Wellenzahlabstimmung haben den Weg für die gleichzeitige Quantifizierung der Hautstruktur und mehrerer Schwingungsbindungen außerhalb der stillen Region geebnet. Weitere Berechnungsmethoden, um den Beitrag spezifischer Analyten von dem der Haut zu analysieren, befinden sich jedoch noch in der Entwicklung28. Dies ist auch für In-vivo-CRI-Studien von besonderer Relevanz, obwohl die Leistungen, die in diesem Setup auf der Tischplatte verwendet werden (ca. 50 mW im Fokus), für den klinischen Einsatz möglicherweise nicht zulässig sind. Das Potenzial dieser Methodik, von einem Labortisch in die Klinik übersetzt zu werden, kann es den Forschern ermöglichen, die Permeation des Arzneimittels sowohl in vivo als auch ex vivo im selben Umfeld zu quantifizieren, um In-vitro-in-vivo-Beziehungen zu entwickeln, die für den Fortschritt in der topischen Arzneimittelentwicklung entscheidend sind.
Die schiere Menge an Daten, die aus einem Versuchslauf gewonnen werden, kann zwischen 10 Bildern pro Standort und 70 Bildern pro Standort liegen. Wenn es mehrere Stellen pro Gewebestück gibt, führt dies zu Gigabyte an Informationen. Die Bilder selbst liefern globale Konzentrationszeitdaten und werden so quantifiziert, wie sie sind, ohne Vorverarbeitung. Dies maximiert jedoch nicht den Nutzen von CRI, da lokale Bioverteilungsdaten zusätzlich zu Permeationspfaddaten extrahiert werden können. Die Bildsegmentierung ist zeitaufwendig, liefert aber detaillierte Informationen, die mit anderen Methoden nicht möglich sind. Beispielsweise ist es möglich, den bevorzugten Penetrationsweg durch das Stratum corneum (lipidreich oder lipidarm) abzuschätzen, was Aufschluss darüber geben kann, welche inaktiven Inhaltsstoffe zu einem bestimmten Weg beitragen könnten oder ob er arzneimittelabhängig ist. Die Analyse eines Experiments kann mehrere Stunden bis Tage dauern, abhängig von der Anzahl der Bilder und der experimentellen Dauer. Daher wird ein automatisierter Ansatz die Datenanalyse unterstützen und eine konsistente Annotation von lipidreichen und lipidarmen Regionen über Hautschichtungen hinweg ermöglichen18.
CLE ist Erfinder von Patenten für die CARS-Mikroskopie, die an mehrere Mikroskophersteller lizenziert wurden. Alle anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Die Autoren danken Dr. Fotis Iliopoulos und Daniel Greenfield von der Evans' Group für ihre Diskussion und das Korrekturlesen dieses Manuskripts. Darüber hinaus möchten sich die Autoren für die Unterstützung von LEO Pharma bedanken. Abbildung 2 wurde mit BioRender.com erstellt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Preparation | |||
Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
Laser/microscope | |||
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
Lipid/Drug Imaging | |||
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
Data Analysis | |||
FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ | |
Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
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