Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.

Die Abbildung biologischer Proben mit Elektronen zur hochauflösenden Strukturbestimmung durch kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) erfordert eine dünne Schicht Glaseis, die die interessierenden Biomoleküle enthält. Trotz zahlreicher technologischer Fortschritte in den letzten Jahren, die die Einzelpartikel-KryoEM an die Spitze der Strukturbiologie gebracht haben, bleiben die Methoden, mit denen Proben für die hochauflösende Bildgebung verglast werden, oft der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt. Obwohl zahlreiche neuere Bemühungen Mittel zur Überwindung von Hürden bereitgestellt haben, die häufig bei der Probenverglasung auftreten, einschließlich der Entwicklung neuartiger Probenträger und innovativer Vitrifikationsinstrumente, bleibt der traditionelle manuell betriebene Kolben aufgrund der niedrigen Anschaffungskosten und der einfachen Bedienung ein Grundnahrungsmittel in der KryoEM-Community. Hier stellen wir detaillierte Methoden für den Einsatz eines standardmäßigen, guillotinenartigen, manuell betriebenen Blot-and-Plunge-Geräts zur Vitrifikation biologischer Proben für die hochauflösende Bildgebung mittels Einzelpartikel-KryoEM zur Verfügung. Darüber hinaus werden häufig auftretende Probleme und Empfehlungen zur Fehlerbehebung für den Fall beschrieben, dass ein Standardpräparat keine geeignete Probe liefert.

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine leistungsstarke Strukturtechnik, mit der Strukturen dynamischer biologischer Proben mit nahezu atomarer Auflösung gelöst werden können1,2,3,4. In der Tat, jüngste Fortschritte in der direkten Elektronendetektortechnologien4,5,6,7,8,9,10, Verbesserungen der Elektronenquellen4,11,12,13,14 und elektromagnetische Linsenstabilität15, gepaart mit der kontinuierlichen Entwicklung der Datenerfassung ^16,17 und Analysesoftwarepakete18,19 haben es den Forschern ermöglicht, strukturen von gut erzogenen Proben mit einer Auflösung von 3 Å oder besser routinemäßig zu bestimmen4,11,13,14,20,21,22,23 . Trotz dieser verbesserten Bildgebungs- und Datenverarbeitungsfunktionen bleibt die KryoEM-Netzvorbereitung das größte Hindernis für eine erfolgreiche hochauflösende Strukturbestimmung und stellt oft einen erheblichen Engpass im EM-Workflow dar24,25,26,27.

CryoEM beruht auf der Bildgebung biologischer Proben in wässrigen Lösungen, die eingefroren werden, um einen dünnen Film aus "glasartigem" Eis zu bilden - ein Prozess, der als Vitrifikation bekannt ist -, der den nativen biochemischen Zustand bewahrt. Die Vitrifikation biologischer Proben für KryoEM reicht über 40 Jahre zurück28,29,30 und viele Techniken und Geräte, die für diesen Prozess entwickelt wurden, beruhen auf der ursprünglich detaillierten Blot-and-Plunge-Methode31,32,33,34,35 , wobei ein kleines Probenvolumen (z. B. 1-5 μL) auf ein spezialisiertes EM-Gitter aufgebracht wird, bevor die überschüssige Lösung durch physikalische Wechselwirkung des Gitters mit Löschpapier entfernt wird. Der Zeitpunkt dieses Prozesses wird in der Regel empirisch für jede Probe bestimmt, da eine kritische Komponente von Gefrierproben die Dicke des Glaskörpereisfilms ist - wenn das Eis zu dick ist, verschlechtert sich die Abbildungsqualität aufgrund der erhöhten Streuung des Elektronenstrahls dramatisch, während zu dünnes Eis die Proteinorientierungen einschränken und / oder Partikel aus der Mitte der Gitterfolienlöcher ausschließen ^kann36 . Diese Abhängigkeit von der perfekten Eisdicke für Einzelpartikel-KryoEM hat zu einer breiten Palette von Techniken und Geräten geführt, die Proben einfrieren können, darunter ^Robotik37,38, Mikrofluidik42 und Ultraschall- oder Sprühgeräte27,39,40,41,42,43,44 . In den letzten Jahren verließen sich einige der beliebtesten Probenvorbereitungsgeräte auf den Einsatz von Robotik zum automatisierten Einfrieren von Proben mit der Blot-and-Plunge-Technik45. Während diese Geräte so konzipiert sind, dass sie reproduzierbar die richtige Eisdicke für die Bildgebung erzeugen, bleiben sie oft zu teuer für den Kauf und Betrieb einzelner Labore und werden im Allgemeinen in KryoEM-Einrichtungen zu Stundensätzen für den Einsatz gefunden. In den letzten Jahren ist die ursprüngliche manuelle Blot-and-Plunge-Technik wieder verstärkt in Gebrauch gekommen3,47,48,49,50,51,52. Tatsächlich kann ein manuell betriebenes Blot-and-Plunge-Gerät qualitativ hochwertige KryoEM-Gitter zu einem Bruchteil der Kosten von Roboter-Gegenstücken erzielen. Darüber hinaus bietet das manuelle Blotting den Benutzern auch mehr Kontrolle über das Blotting, da die Forscher die Art des Blottings (dh Back-Blotting des Gitters, Front-Blotting des Gitters usw.) und die Löschzeit basierend auf jeder einzelnen Probe und Forschungsfragen anpassen können.

In diesem Artikel erfahren Sie, wie biologische Proben mit einer herkömmlichen manuellen Blot-and-Plunge-Verglasungsvorrichtung in Verbindung mit einer speziell entwickelten Dewar-Plattform ^{effektiv eingefroren werden können53}. Best Practices, einschließlich der Vorbereitung des Kryogens, der Gitterhandhabung, der Probenanwendung und des Blotting, sowie häufige Fallstricke und Empfehlungen zur Überwindung dieser Hürden werden bereitgestellt. Ratschläge zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Eisdicke zwischen den Gittervorbereitungen und zur Modifikation des Probenlöschens basierend auf dem biologischen Probentyp werden diskutiert. Angesichts der geringen Kosten, die mit dem Kauf und Betrieb des in diesem Manuskript beschriebenen manuellen Kolbens verbunden sind, können Labore auf der ganzen Welt biologische Proben kostengünstig und reproduzierbar für KryoEM vorbereiten.

1. Vorbereiten der manuellen Tauchumgebung

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 5-30 Minuten

1. Positionieren Sie den manuellen Kolben in einem 4 °C heißen Kühlraum, in dem ein Luftbefeuchter untergebracht werden kann, um den Raum in der Nähe von 100 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) zu halten (Abbildung 1A).
   ACHTUNG: Bitte konsultieren Sie die Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien der Institution für die sichere Position des manuellen Kolbens und die empfohlenen Operationen.
2. Schalten Sie vor der Netzvorbereitung den Luftbefeuchter im Kühlraum ein, um sicherzustellen, dass die relative Luftfeuchtigkeit des Kühlraums ≥ 95 % beträgt.
   HINWEIS: Die Netzvorbereitung bei niedriger Luftfeuchtigkeit kann zur Austrocknung dünner Schichten, zur Veränderung von Pufferkomponenten aufgrund von Verdunstung und zu einer Abnahme der Reproduzierbarkeit von Gitter zu Gitter ^führen46. Es wird nicht empfohlen, Gitter bei <80 % RH einzufrieren.
3. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Kühlraums bei 4 ° C liegt.
4. Positionieren Sie den manuellen Kolben abseits starker Luftströmungen (d. h. abseits der Lüftungsschlitze der Klimaanlage), da sie zu Turbulenzen in der Nähe von Gittern und / oder prominenter Eisansammlung auf kalten Oberflächen führen können.

2. Bereiten Sie Tauchmaterialien und Zubehör vor

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1-5 Minuten

1. Verwenden Sie eine saubere Schere, um Löschpapierkreise in 1-1,5 cm breite und ~ 9 cm lange Streifen zu schneiden. Vermeiden Sie es, die Mitte des Löschpapiers zu berühren, und entsorgen Sie die kleineren Endstücke. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Löschpapierstreifen trocken, sauber und frei von Verunreinigungen sind. Trennen Sie die Streifen und legen Sie sie in eine 100 mm Petrischale.
2. Legen Sie einen 22x22 mm großen quadratischen Glasdeckstein in eine separate 60 mm Glas petrischale. Diese Deckglas-haltige Glas-Petrischale wird zum Speichern, Übertragen und Entlüften von Gittern verwendet.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Staubschutzdose zu verwenden, um sichtbare Ablagerungen vom Objektträger zu entfernen, bevor Gitter hinzugefügt werden. Eine antistatische Pistole kann auch verwendet werden, um statische Elektrizität zu entfernen, die sich ansammelt.
3. Montieren und beschriften Sie Netzspeicherboxen.
4. Erwerben Sie 4 bis 6 saubere und trockene Klemmpinzetten und lokalisieren Sie sie am manuellen Kolben. Überprüfen Sie jede Pinzette vor dem Eintauchen visuell, um sicherzustellen, dass sie nicht beschädigt und frei von Verunreinigungen ist.

3. Bereiten Sie den Kryogen-Dewar und den manuellen Kolben vor

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 5-15 Minuten

1. Installieren Sie die Plattformbasis am unteren Rand des stürzenden Dewars. Platzieren Sie den Ethanbehälter dewar oben auf der Plattformbasis, fügen Sie den Messing-Ethanbehälter hinzu und installieren Sie dann die Spinngitterspeicherplattform.
   1. Sobald flüssiger Stickstoff (_LN2) in den Tauchdewar gegeben wird, kann die Höhe der Plattformbasis nicht mehr eingestellt werden. Stellen Sie sicher, dass die Gitterbasis ordnungsgemäß installiert und eben ist, um Gitter- und / oder Pinzettenschäden aufgrund einer falschen Kolbenhöhe zu begrenzen.
2. Überprüfen Sie vor dem Einfrieren den manuellen Kolben und alle Zusatzgeräte, um sicherzustellen, dass sie ordnungsgemäß funktionieren, um proben- und/oder netzverluste zu begrenzen.
3. Ersetzen Sie vor jeder Gefriersitzung das Klebeband am manuellen Kolbenarm, der zum Halten der Pinzette verwendet wird. Die hohe Luftfeuchtigkeit des Raumes kann den Klebebandkleber verschlechtern und die Fähigkeit des Bandes, die Pinzette zu halten, verringern, was die Wahrscheinlichkeit von Pinzettenschäden und / oder Netzverlust erhöht.
4. Stellen Sie die Lampe(n) in der Nähe des manuellen Kolbens ein, um sicherzustellen, dass genügend Licht vorhanden ist, um den Probentransport zu überwachen, und stellen Sie sicher, dass der Netztransfer leicht visualisiert wird, um Netzschäden und/oder -verluste zu vermeiden (siehe Schritt 3.7). Verwenden Sie eine Ringlampe direkt hinter dem Kolben, um flüssigkeitsbewegungen zu visualisieren, und eine flexible Armaufgabenleuchte in der Nähe des Dewar, um die gefrorenen Gitter zu beleuchten.
5. Stellen Sie die Fußpedalspannung ein, um sicherzustellen, dass der Dewar-Taucharm in der angehobenen Position sicher an Ort und Stelle gehalten wird und vollständig gelöst wird, wenn das Pedal gedrückt wird. Führen Sie vor der Probenapplikation mehrere "Trockenläufe" durch, um sicherzustellen, dass der Kolben ordnungsgemäß funktioniert.
   HINWEIS: Eine unsachgemäße Einstellung der Fußpedalspannung führt zu einem vorzeitigen Lösen des Taucharms (d. H. Die Spannung ist zu niedrig eingestellt) und zu einem Gitterverlust oder einem unvollständigen Eintauchen des Gitters in das Ethangefäß (dh die Spannung ist zu hoch eingestellt).
6. Platzieren Sie den Tauchstau an der Basis des manuellen Kolbens direkt unter dem Taucharm und befestigen Sie ihn an Ort und Stelle. Befestigen Sie mit dem angebrachten Klebeband eine Pinzette am Taucharm. Während Sie den manuellen Taucharm halten, drücken Sie das Fußpedal, um den Taucharm vorsichtig abzusenken und den Weg des Taucharms einzustellen, um sicherzustellen, dass sich das Gitter in der Mitte des Ethangefäßes befindet.
7. Verwenden Sie den Bump Stop an der Oberseite des Taucharms, um die endgültige Position des Taucharms zu bestimmen, wenn das Fußpedal vollständig gedrückt ist (Abbildung 1B). Stellen Sie die Bump-Stop-Höhe am Taucharm ein, um die Position des Gitters im Ethangefäß einzustellen (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Eine unsachgemäße Einstellung der Eintaucharmhöhe kann zu einem Gitter- und/oder Pinzettenschaden (z. B. wenn die Höhe des Taucharms zu niedrig eingestellt ist) oder zu einer unzureichenden Verglasung (z. B. zu hoch eingestellt) führen.
8. Suchen Sie den Dewar außerhalb des Kühlraums und fahren Sie mit der Vorbereitung von flüssigem Ethan fort (Schritt 4).

4. Bereiten Sie das Kryogen vor

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 10-30 Minuten

1. Beurteilen Sie den Ethantank, den Regler, den Schlauch und die Ethanabgabespitze auf Anzeichen von Schäden. Melden und beheben Sie sofort alle Anzeichen von Schäden, bevor Sie fortfahren.
   VORSICHT: Komprimiertes Ethan und Ethan:Propangasgemische sind brennbar und können bei unsachgemäßer Handhabung eine ernsthafte Gefahr für das Leben darstellen und/oder zu Verletzungen führen. Bitte konsultieren Sie einen Experten, wenn Sie sich nicht sicher sind, wie Sie Druckgastanks bedienen oder handhaben sollen. Bitte beachten Sie die Richtlinien der Institution für Umweltgesundheit und Sicherheit beim Umgang mit brennbaren komprimierten Gasen. Darüber hinaus ist verflüssigtes Ethan ein starkes Kryogen, das eine ernsthafte Bedrohung für Leben und / oder Verletzungen darstellen kann, wenn es nicht richtig gehandhabt wird. Bitte beachten Sie beim Umgang mit Kryogenen die Richtlinien der Institution für Umweltgesundheit und -sicherheit.
2. Erwerben Sie ausreichend _LN2 in einem geeigneten LN2-Handling-Dewar (d.h. 3-4 L ist typisch für die Netzvorbereitung und -speicherung).
   VORSICHT: _LN2 ist ein Kryogen, das eine ernsthafte Bedrohung für Leben und / oder Verletzungen darstellen kann, wenn es nicht richtig gehandhabt wird.
   1. Stellen Sie sicher, dass alle persönlichen Schutzausrüstungen verwendet werden, um das Verletzungsrisiko zu minimieren. Der Dampf von _LN2 ist ein Erstickungsmittel und sollte in gut belüfteten Bereichen gehandhabt werden. Bitte konsultieren Sie einen Experten, wenn Sie sich nicht sicher sind, wie Sie kryogene Gefäße und Kryogene bedienen oder handhaben sollen. Bitte beachten Sie beim Umgang mit Kryogenen die Richtlinien der Institution für Umweltgesundheit und -sicherheit. Für Situationen, in denen flüssiger Stickstoff in einem kalten Raum nicht verwendet werden kann, empfehlen wir das Einfrieren in einem kühlen und gut belüfteten Raum.
3. Kühlen Sie außerhalb des Kühlraums den Tauchdewar ab, indem Sie _LN2 direkt in das Messing-Ethangefäß gießen, bis der Flüssigestickstoffgehalt die Oberseite des Ethangefäßes erreicht (d. H. Knapp über der Plattform). Füllen Sie das _LN2 außerhalb des Ethanbehälters nach Bedarf auf. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn der _LN2 aufhört heftig zu sprudeln (ca. 5 Minuten).
   1. Fügen Sie _LN2 direkt in das Messingethangefäß hinzu, um das Gefäß vor dem Kondensieren des Ethangases ausreichend abzukühlen. Wenn das Messing-Ethangefäß nicht richtig gekühlt wird, erhöht sich die Zeit, die zum Kondensieren von Ethan benötigt wird, dramatisch.
   2. Sobald der Dewar die _{LN2-Temperatur} erreicht hat, vermeiden Sie es, den Dewar so zu überfüllen, dass _LN2 in das Ethangefäß gelangt.
4. Ethan kommt als komprimiertes Gas und muss für die Verwendung verflüssigt werden. Der Ethantank verwendet einen hochreinen zweistufigen Regler, um den Gasfluss zu steuern. Schließen Sie den Schlauch an das Reglerauslassventil an und verwenden Sie eine 14-Gauge-Flachmetall-Dosierspitze, die am Ende zum Dosieren von Ethan angeschlossen ist.
5. Stellen Sie vor dem Öffnen des Ethan-Haupttankventils sicher, dass der Druckeinstellknopf und das Auslassventil vollständig geschlossen sind. Öffnen Sie das Haupttankventil vollständig und öffnen Sie dann das Auslassventil auf ~ 50%. Öffnen Sie langsam den Druckeinstellknopf, bis ein langsamer Gasfluss beobachtet wird. Verwenden Sie das Auslassventil, um den Gasfluss fein abzustimmen.
   VORSICHT: Richten Sie die Metalldosierspitze immer von sich weg, wenn Sie Ventile öffnen oder Gasdurchflusseinstellungen vornehmen.
6. Starten Sie langsam den Gasfluss und beurteilen Sie die Durchflussrate, indem Sie die Spitze der Ethangasleitung in ein kleines Becherglas mit entionisiertem Wasser einführen. Stellen Sie den Gasfluss ein, bis der Durchfluss das Wasser mäßig stört.
   1. Stellen Sie die Gasdurchflussrate ein, um sicherzustellen, dass eine ordnungsgemäße Ethankondensation erfolgt - eine zu langsame Durchflussrate führt dazu, dass sich das Ethangas in der Dosierspitze erstarrt, und eine zu schnelle Durchflussrate führt zu intensivem Blubbern und verhindert das Einfrieren.
7. Bevor Sie die Spitze der Ethangasleitung in das Messing-Ethangefäß einführen, reinigen und wischen Sie die Dosierspitze mit feinen Arbeitstüchern ab, um Wasser zu entfernen.
8. Positionieren Sie in einer sanften und schnellen Bewegung die Gasabgabespitze am Boden des Messingethangefäßes und beginnen Sie, die Dosierspitze in einem langsamen Kreis um den Boden des Ethangefäßes zu bewegen. Festes Ethan bildet sich sofort, verflüssigt sich aber schnell, wenn mehr Ethangas hinzugefügt / kondensiert wird.
   1. Bewegen Sie die Metallet ethandosierende Spitze am Boden des Ethangefäßes weiter, um das feste Ethan zu verflüssigen. Füllen Sie das Ethangefäß zu 3/4 Voll mit flüssigem Ethan (2-3 Fäden von oben). Stoppen Sie den Ethangasfluss, indem Sie die Metallethandosierspitze vorsichtig aus dem Messingethangefäß entfernen und das Auslassventil schließen.
9. Füllen Sie den eintauchenden Dewar mit _LN2 ab, das sanft auf die Seite des Dewars gegossen wird, um zu vermeiden, dass _LN2 zum Messing-Ethangefäß hinzugefügt wird, bis der Flüssigkeitsstand das Messingethangefäß berührt. Legen Sie den Schaumdeckel auf den Tauchdewar, um die Ethanerstarrung zu erleichtern.
   1. _LN2 muss direkt mit dem Messing-Ethangefäß in Kontakt treten, um die Erstarrung von Ethan zu unterstützen. Nach etwa 5 Minuten wird das Ethan im Messinggefäß vollständig festgefroren. Fügen Sie mehr _LN2 hinzu, bis es nur noch das Ethangefäß berührt, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
10. Wenn das Ethan nicht fest gefroren ist, ist das Messingethangefäß nicht kalt genug für die verbleibenden Schritte. Fügen Sie mehr _LN2 hinzu, bis es nur noch das Ethangefäß berührt, und warten Sie weitere 5 Minuten. Stellen Sie sicher, dass das Ethan im Messinggefäß vollständig fest gefroren ist.
11. Öffnen Sie das Gasauslassventil, um einen Ethangasstrom mit einer ähnlichen Geschwindigkeit wie in Schritt 4.6 festgelegt zu erzeugen. Legen Sie die Metall-Ethan-Dosierspitze vertikal in das feste Ethan und bewegen Sie die Ethandosierspitze in einer kreisförmigen Bewegung weiter, um das feste Ethan zu schmelzen.
    1. Fügen Sie weiterhin Ethan hinzu, bis es auf Höhe der Oberseite des Messingethangefäßes liegt. Entfernen Sie langsam die Spitze aus dem Ethanbehälter und schließen Sie das Ethantankauslassventil. Bedecken Sie den Dewar mit dem Deckel für ~ 1-4 Minute(n), damit das Ethan an den Rändern des Messing-Ethangefäßes erstarrt.
       HINWEIS: Ein ideales Ethangefäß hat einen symmetrischen Ring aus festem Ethan von 2-3 mm am Umfang des Messingethangefäßes mit flüssigem Ethan in der Mitte (Abbildung 1D und Abbildung 2).
    2. Stellen Sie sicher, dass das Ethan so kalt wie möglich ist, ohne zu erstarren, um eine ordnungsgemäße Vitrifikation der biologischen Probe zu gewährleisten. Das Versäumnis, das flüssige Ethan ordnungsgemäß vorzubereiten, kann zu einer unzureichenden Vitrifizierung der Probe, eisansammlung und/oder zum Verlust der Probe führen, was jeweils zur Verschlechterung der Probenqualität für die Bildgebung beiträgt.
    3. Wenn sich nach 2-3 Minuten kein fester Ethanring bildet, fügen Sie dem Dewar mehr _LN2 hinzu und decken Sie ihn für weitere 2-5 Minuten ab.
    4. Wenn sich das Ethan zu schnell verfestigt, verwenden Sie eine große saubere Pinzette, um das Ethangefäß und/oder festes Ethan vorsichtig zu erwärmen, um eine vollständige Ethanerstarrung zu verhindern. Sobald ethan und _LN2 stabil sind, schließen Sie alle Ethantankventile und lokalisieren Sie den Tauchdewar am manuellen Kolben. Befestigen Sie den Taucher am manuellen Kolben.
       VORSICHT: Seien Sie besonders vorsichtig beim Übertragen des Dewars, da _LN2 in das Ethangefäß gelangen und das flüssige Ethan verfestigen kann. Bei Bedarf kann eine saubere Pinzette verwendet werden, um festes Ethan in der Mitte des Gefäßes zu schmelzen.
12. Testen Sie die Position des Ethan-Dewars mit einer leeren Pinzette, um sicherzustellen, dass sich die Pinzettenspitze in der Mitte des Ethangefäßes befindet und genügend Platz für das Gitter und die Pinzettenspitze im flüssigen Ethan vorhanden ist (Abbildung 1D).
    1. Wenn der feste Ethanring für eine einfache Gitterhandhabung zu dick ist, verwenden Sie ein Paar Raumtemperatur, reinigen Sie eine Pinzette, um das feste Ethan zu schmelzen und mehr Gefrierbereich in der Mitte des Ethanbehälters zu schaffen.

5. Vorbereiten von EM-Grids

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1-5 Minuten

1. Fügen Sie die Netzspeicherbox(en) zum Dewar hinzu, schrauben Sie den/die Deckel der Gitterspeicherbox(en) ab und stellen Sie sicher, dass jeder Deckel frei zu einem neuen Gitterschlitz gedreht werden kann.
2. Übertragen Sie Gitter vorsichtig von der Gitterspeicherbox an den Rand des quadratischen Glasdeckglases mit ~ 30-40% des Gitters von der Schiebekante. Stellen Sie sicher, dass die Gitterfolie nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Gitter abgedeckt sind, wenn sie nicht verwendet werden. Das Platzieren der Gitter über dem Rand des quadratischen Glasdeckglases bietet eine einfache Rasterhandhabung und verringert die Wahrscheinlichkeit, dass das Gitter während des Transfers gebogen oder beschädigt wird.
   HINWEIS: 4-6 Raster werden in der Regel gleichzeitig vorbereitet.
3. Machen Sie Gitter hydrophil mit einem Glühentladungsmesser oder Plasmareiniger.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie die empfohlenen Richtlinien für die Gitterreinigung, die vom Hersteller des Glühentladungs-/Plasmareinigers bereitgestellt werden.
   1. Verwenden Sie die Gitter innerhalb von 10 Minuten nach der Plasmareinigung, da die Gitter an Hydrophilie verlieren und die Reproduzierbarkeit von Gitter zu Gitter nach dieser Zeit abnimmt.

6. CryoEM-Probe durch Einfrieren vorbereiten

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: >10 Minuten (~1-3 min pro Netz)

1. Verwenden Sie eine saubere und trockene Klemmpinzette, um ein gereinigtes Gitter aufzunehmen, schieben Sie die Kunststoffklemme nach unten, um das Gitter an Ort und Stelle zu fixieren, und klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, um sicherzustellen, dass das Gitter ordnungsgemäß gesichert ist.
   1. Behandeln Sie Gitter am Außenring, um Schäden an der Gitterfolie zu vermeiden.
2. Tragen Sie 1 bis 5 μL Probe auf die vorbereitete Seite (z. B. Vorderseite oder Folienseite) des Gitters auf.
   HINWEIS: Das optimale Volumen und die optimale Löschzeit hängen von der Probe ab und müssen für jede Probe optimiert werden. Größere Volumina und viskosere Proben erfordern längere Löschzeiten.
3. Befestigen Sie die Pinzetten-Gitter-Probenbaugruppe am manuellen Taucharm, indem Sie Klebeband um den Pinzettengriff wickeln.
   1. Richten Sie die Probe in Richtung des Benutzers für das herkömmliche Front-Blotting. Wenn die Probe eine Rücklöschung erfordert, suchen Sie die Probe außerhalb des Benutzers.
4. Halten Sie ein sauberes, trockenes, geschnittenes Stück Löschpapier zwischen Daumen und Zeigefinger jeder Hand.
   1. Behandeln Sie nur die Löschpapiere von den Rändern und berühren Sie niemals die Mitte, da Öle und andere Verunreinigungen von Händen / Handschuhen die Gitterqualität verändern können.
5. Legen Sie die Hände auf den Rand des tiefen Dewars, um eine stabile Position einzunehmen. Platzieren Sie das Löschpapier parallel zur Gitteroberfläche, die etwa 1 cm von der Gitteroberfläche entfernt ist.
   1. Verwenden Sie den mittleren Abschnitt des Löschpapiers, um eine vollständige Flüssigkeitsbeweglichkeit und sogar einen Feuchtigkeitstransport über die Gitteroberfläche zu ermöglichen.
6. Schieben und drehen Sie den Daumen und die Ringfinger vorsichtig zueinander, um das Löschpapier in Richtung des Rasters zu biegen und das Blotting einzuleiten. Halten Sie den Kontakt zwischen dem Löschpapier und der Gitteroberfläche während des gesamten Löschvorgangs aufrecht.
   1. Berühren Sie das Löschpapier direkt mit der Gitteroberfläche und halten Sie einen konsistenten Kontakt über die Gitteroberfläche aufrecht.
   2. Durch vorsichtiges Biegen des Löschpapiers wird das Biegen des Gitters und/oder die Beschädigung der Gitteroberfläche verringert und es führt zu gleichmäßigerem Eis über das Gitter (Abbildung 3A).
7. Beobachten Sie die mobile Flüssigkeitsfront und sobald sie aufhört, in das Löschpapier vorzudringen, beginnen Sie für 4 bis 6 Sekunden zu zählen.
   HINWEIS: Das Zählen kann auftreten, sobald das Löschpapier die Gitteroberfläche berührt, aber eine geringere Reproduzierbarkeit von Gitter zu Gitter kann auftreten. Die Gesamtfleckenzeit hängt vom Gittertyp, Folientyp, Probenkonzentration und Probentyp ab (z. B. löslich versus Membran versus fadenförmige Proteine). Für viskosere Proben sind längere Blot-Zeiten (z. B. 5 bis 7 Sekunden) erforderlich.
   1. Wichtig: Entwickeln Sie ein zuverlässiges und konsistentes Zählschema, um die Reproduzierbarkeit während des Gefrierprozesses erheblich zu verbessern.
8. Bewegen Sie den linken, rechten Daumen und Zeigefinger in entgegengesetzte Richtungen, um das Löschpapier in einer "Schnappbewegung" von der Rasteroberfläche weg zu entfernen. Drücken Sie sofort das Fußpedal, um den Taucharm freizugeben und das Gitter in flüssiges Ethan zu tauchen.
   1. Entfernen Sie gleichzeitig das Löschpapier und drücken Sie das Fußpedal, um das Gitter so schnell wie möglich in das Ethan zu tauchen, um beste Gefrierergebnisse zu erzielen. Je länger die Zeit zwischen dem Entfernen von Löschpapier und dem Eintauchen ist, desto mehr Verdunstung dünner Filme tritt auf und verringert die Reproduzierbarkeit von Gitter zu Gitter.
9. Verwenden Sie eine Hand, um die Klemmpinzette zu stabilisieren, ziehen Sie das Klebeband vorsichtig um die Pinzette und den manuellen Taucharm ab.
   1. Halten Sie immer Kontakt mit der Pinzette, um eine Bewegung des Pinzettengitters zu verhindern und Gitterschäden zu begrenzen, die durch das Schlagen des Gitters gegen das feste Ethan entstehen.
10. Sobald die Klemmpinzette vom manuellen Taucharm befreit ist, halten Sie die Pinzette in einer Hand auf der Oberseite des tauchenden Dewars und stellen Sie sicher, dass das Gitter im flüssigen Ethan verbleibt. Schieben Sie die Kunststoffklemme vorsichtig vom Gitter weg, damit das Gitter übertragen werden kann. Halten Sie den Druck auf die Pinzette aufrecht, um das Netz zu halten.
    1. Übertragen Sie mit einer schnellen Bewegung das Gitter schnell aus dem Ethangefäß in das _{LN2-Reservoir} . Legen Sie das Netz vorsichtig in die Netzspeicherbox.
       HINWEIS: Etwas Ethan kann sich auf der Gitteroberfläche verfestigen. Wenn Sie die Pinzette leicht öffnen, wird das Ethan gebrochen und das Gitter in die Gitterbox fallen gelassen.
11. Wickeln Sie die Spitze der Pinzette in ein zartes Aufgabentuch, um Frostansammlungen zu vermeiden. Beiseite stellen, bis die Pinzette wieder Raumtemperatur erreicht hat.
    1. Halten Sie 4 bis 6 Pinzetten zur Hand, um die Bedienung zu erleichtern. Jede Pinzette wird zum Einfrieren der Probe verwendet und vor dem späteren Gebrauch erwärmt.
12. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.11 für jedes Raster.
13. Sobald das Einfrieren seinen Höhepunkt erreicht hat, schließen Sie die Gitterbox sicher und bringen Sie sie an einen geeigneten Lagerort.
14. Entsorgen Sie das flüssige Ethan und _LN2 sorgfältig und lagern Sie alle Materialien an einem trockenen Ort.

Die erfolgreiche Ausführung des hier beschriebenen Blot-and-Plunge-Protokolls führt zu einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aus Glaseis, die frei von hexagonalem Eis, Verunreinigungen und großen Gradienten von unbrauchbarem Eis ist, die unter dem Elektronenmikroskop beobachtet werden können (Abbildung 3). Ein inkonsistenter Kontakt des Löschpapiers mit der Gitteroberfläche, das vorzeitige Entfernen des Löschpapiers oder das Bewegen des Löschpapiers während des Gitterkontakts kann die Qualität des Glaseises verringern und zu einer inkonsistenten Eisdicke über das EM-Gitter führen (Abbildung 4).

Abbildung 1: Probentauchraum und erforderliche Ausrüstung. A) Inszenierter Kühlraum für das manuelle Einfrieren biologischer Proben mit einem traditionellen Blot-and-Plunge-Gerät, das in diesem Artikel beschrieben wird. Notwendige Ausrüstung wird angezeigt und entsprechend gekennzeichnet. B) Um die Arbeitshöhe des manuellen Kolbens einzustellen, stellen Sie den Anschlag ein, indem Sie ihn am manuellen Taucharm auf und ab schieben und durch Anziehen der Schraube sichern. C) Vergrößerte Ansicht des Ethanbehälters und der Spinngitterspeicherplattform, um die richtige Höhe und Position der Klemmpinzette und des Gitters im leeren Messing-Ethanbehälter anzuzeigen. Die Pinzette und das Gitter sollten nicht mit den Seiten oder dem Boden des Messingethans in Berührung kommen, um Beschädigungen zu vermeiden. D) Richtige Höhe und Lage der Klemmpinzette und des Gitters in flüssigem Ethan. Die Pinzette und das Gitter sollten in das flüssige Ethan in der Mitte gelangen und den Kontakt mit dem festen Ethan am Umfang vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Vorbereitetes flüssiges Ethan. Vergrößerte Ansicht des eintauchenden Dewars, der den Zustand des flüssigen Ethans im Messing-Ethangefäß vor dem Einfrieren der Probe zeigt. Der 2-3 mm ring aus massivem Ethan innerhalb des Messingethangefäßes ist deutlich sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Apoferritinbilder, die mit der manuellen Blot-and-Plunge-Technik erhalten wurden. (A) Repräsentativer Atlas eines KryoEM-Gitters, der die Eisdicke und Qualität der Gitterquadrate zeigt, die mit der manuellen Blot-and-Plunge-Technik erhalten werden können. (B) Bewegungskorrigierte Mikroaufnahme von vitrifiziertem Maus-Apoferritin, aufgenommen mit einem 200-kV-Transmissionselektronenmikroskop, das mit einem direkten Elektronendetektor an der CryoEM-Einrichtung der University of California, San Diego, ausgestattet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentativer Atlas eines suboptimalen KryoEM-Gitters mit inkonsistenter Eisdicke über das Gitter, zahlreiche gebrochene Quadrate und Bereiche, in denen das Eis zu dick ist, um das Exemplar abzubilden.

Die Vitrifikation biologischer Proben für die Bildgebung mittels Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) bleibt ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Strukturbestimmung. Die in diesem Protokoll beschriebene manuelle Blot-and-Plunge-Methode stellt eine kostengünstige, zuverlässige und robuste Methode zum schnellen Einfrieren biologischer Proben in dünnen Glaskörpereisschichten für die KryoEM-Bildgebung dar. Mit den im Manuskript beschriebenen Methoden werden die Forscher in der Lage sein, den manuellen Kolben zusammenzubauen und zu bedienen, Kryogen vorzubereiten, das für das Schockgefrieren biologischer Proben geeignet ist, und manuell EM-Gitter mit biologischen Proben zu löschen und zu tauchen. Obwohl diese Methode recht robust ist, sollte bei kritischen Schritten in diesem Verfahren darauf geachtet werden, eine optimale Eisdicke und -qualität für eine hochauflösende Bildgebung zu erhalten. Im Folgenden haben wir einige dieser wichtigen Schritte beschrieben und geben Empfehlungen zur Problembehandlung bei diesen Schritten.

Es ist unerlässlich, den manuellen Taucharm richtig zu positionieren, um sicherzustellen, dass sich das Gitter nach dem Eintauchen in der Mitte des flüssigen Ethans im Messinggefäß befindet. Eine unsachgemäße Höhe oder Position des Taucharms und/ oder die nicht ordnungsgemäße Sicherung der Pinzette führen zu Schäden an der Klemmpinzette, dem EM-Gitter und möglicherweise dem manuellen Kolben. Wie oben beschrieben, führen wir vor der Vorbereitung biologischer Proben immer mindestens einen Testlauf durch, um zu überprüfen, ob sich das EM-Gitter nach erfolgreichem Eintauchen in der Mitte des Messingethangefäßes befindet (Abbildung 1C). Darüber hinaus nehmen wir nach jedem Einfrieren des Gitters auch geringfügige Anpassungen an der Position des Tauchdewars vor, um die Gitterplatzierung innerhalb des Ethanbehälters zu optimieren (Abbildung 1D).

Die richtige Herstellung des Ethan-Kryogens ist entscheidend für die Gewinnung dünner Filme biologischer Proben in Glaseis. Wir haben beobachtet, dass das Vorhandensein eines 2-3 mm langen Rings aus festem Ethan um den inneren Rand des Messingetangefäßes sicherstellt, dass die Temperatur des flüssigen Ethans für die Probenvitrifikation optimal ist (Abbildung 2). In der Tat, nachdem jedes Gitter eingefroren wurde, überwachen wir die Qualität des Ethans und nehmen kleinere Anpassungen vor - das Gefäß leicht zu erwärmen, wenn zu viel Ethan erstarrt ist, oder das Ethan abkühlen, wenn sich das System erwärmt hat - je nach Bedarf. Wir haben festgestellt, dass der Rand einer Pinzette bei Raumtemperatur ausreicht, um festes Ethan zu verflüssigen, während das Abdecken des Dewar mit dem Schaumdeckel für 1-5 min ausreicht, um das Ethan abkühlen zu lassen. Wichtig ist, dass wir diese Anpassungen vornehmen, bevor wir die Gitteroberfläche vorbereiten (d. H. Plasmareinigung) und die Probe auf das Gitter auftragen, da dies eine weitere Variable in die Gittervorbereitung einführen kann, die nicht reproduzierbar ist.

Schließlich empfehlen wir die Entwicklung einer standardisierten Blot-and-Plunge-Routine - Probenapplikation, Probenlöschung und Blotting-Zeit -, um die Reproduzierbarkeit von Gitter zu Gitter zu erhöhen. Das Biegen des Löschpapiers in Richtung des EM-Gitters ermöglicht einen gleichmäßigen Kontakt des Papiers mit dem Gitter und erzeugt eine gleichmäßigere Eisdicke über das gesamte Gitter, was zu einer gleichmäßigen Partikelverteilung innerhalb der Gitterlöcher führt (Abbildung 3A bzw. Abbildung B). Diese Methode des Blottings steht im Gegensatz zu robotergestützten Blotting-Geräten, die mit der Probe in einem Winkel interagieren, der zu einem Gradienten der Eisdicke über das Gitter führen kann. Darüber hinaus verringert diese Biegung des Löschpapiers auch die Wahrscheinlichkeit, dass das EM-Gitter bei Kontakt mit dem Löschpapier beschädigt wird, indem die vom Benutzer ausgeübte Kraft gepuffert wird. Richten Sie das Löschpapier nach der gewünschten Löschzeit schnell aus, indem Sie eine Schnappbewegung ausführen, um das Löschpapier schnell von der Gitteroberfläche wegzubewegen, bevor Sie eintauchen, um eine Beschädigung des Gitters beim Lösen des manuellen Taucharms zu vermeiden. Wir haben festgestellt, dass diese Blotting-Methode und die Schnappbewegung des Löschpapiers, wenn sie mit dem gleichzeitigen Lösen des manuellen Taucharms über das Fußpedal getimt wird, die Verdunstung des dünnen Films vor der Vitrifikation begrenzt und die Grid-to-Grid-Reproduzierbarkeit erhöht.

Die hier beschriebene manuelle Blot-and-Plunge-Methode ist eine robuste und zuverlässige Methode, die dazu beiträgt, einen Teil der finanziellen Belastung zu verringern, die CryoEM für aufstrebende Labore bedeuten kann. Während diese Methode reproduzierbar ist, hängt die Herstellung von hochwertigem Glaseis, das für KryoEM geeignet ist, von der Erfahrung und dem Können des einzelnen Forschers ab. Obwohl Roboterkolben und andere aufkommende Technologien mehrere Aspekte des Gefrierprozesses automatisieren, sind sie im Allgemeinen durch die Menge an Kontrolle begrenzt, die sie den Forschern bieten, und verursachen oft einen hohen Preis für Kauf und Betrieb. Mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode werden die Forscher in der Lage sein, eine erschwingliche und vielseitige EM-Grid-Vorbereitungsplattform zu nutzen, die Flexibilität bietet, um die Tauchbedingungen (d. H. Löschpapiertypen, Löschwinkel, Löschdauer, Löschrichtungen usw.) basierend auf Probentypen und -eigenschaften zu optimieren.

Wir haben nichts offenzulegen.

Wir danken den Mitgliedern des Herzik-Labors für kritisches Nachdenken und Feedback zu diesem Manuskript und dem Videoinhalt. M.A.H.Jr. wird von NIH R35 GM138206 und als Searle Scholar unterstützt. H.P.M.N wird durch das Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326) unterstützt. Wir möchten uns auch bei Bill Anderson, Charles Bowman und Dr. Gabriel Lander vom Scripps Research Institute für die Hilfe beim Entwerfen, Zusammenbauen und Testen des im Video gezeigten manuellen Kolbens bedanken.