دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

تحدد هذه المخطوطة طريقة النشاف والغطس لتجميد العينات البيولوجية يدويا للفحص المجهري الإلكتروني المبرد بجسيمات واحدة.

تصوير العينات البيولوجية مع الإلكترونات لتحديد هيكل عالية الدقة عن طريق المجهر الإلكتروني المبردة جسيمات واحدة (cryoEM) يتطلب طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي التي تحتوي على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية. على الرغم من التقدم التكنولوجي العديد في السنوات الأخيرة التي دفعت cryoEM جسيم واحد إلى طليعة البيولوجيا الهيكلية، والأساليب التي يتم بها تهتز العينات للتصوير عالية الدقة غالبا ما تبقى الخطوة التي تحد من معدل. على الرغم من أن العديد من الجهود الأخيرة وفرت وسائل للتغلب على العقبات التي كثيرا ما تواجه خلال تزجيج العينة ، بما في ذلك تطوير دعامات عينة جديدة وأجهزة التزجيج المبتكرة ، فإن المكبس التقليدي الذي يتم تشغيله يدويا لا يزال عنصرا أساسيا في مجتمع cryoEM بسبب انخفاض تكلفة الشراء وسهولة التشغيل. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام معيار، على غرار المقصلة تعمل يدويا جهاز لطخة والغطس لتزجيج العينات البيولوجية للتصوير عالية الدقة من قبل cryoEM جسيم واحد. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تواجه مشكلات وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها عندما يفشل إعداد قياسي في إنتاج عينة مناسبة يتم وصفها أيضا.

المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) هو تقنية هيكلية قوية يمكن استخدامها لحل هياكل العينات البيولوجية الديناميكية إلى الدقة شبه ^{الذرية1،2،3،4}. في الواقع ، التطورات الأخيرة في تقنيات كشف الإلكترونات ^{المباشرة4،5،6،7،8،9،10} ، والتحسينات في مصادر ^{الإلكترونات4،11،12،13،14} ، واستقرار العدسة ^{الكهرومغناطيسية15} ، إلى جانب التطوير المستمر للحصول على البيانات ^16,17 وحزم برامج ^{التحليل18,19}, مكنت الباحثين من تحديد هياكل العينات حسنة السلوك بشكل روتيني الآن إلى 3 دقة Å أو أفضل4,11,13,14,20,21,22,23 . على الرغم من هذه القدرات المحسنة للتصوير ومعالجة البيانات ، لا يزال إعداد شبكة cryoEM أكبر عائق أمام تحديد الهيكل عالي الدقة الناجح وغالبا ما يكون بمثابة اختناق كبير في سير عمل ^{EM24،25،26،27}.

تعتمد CryoEM على تصوير العينات البيولوجية في المحاليل المائية المجمدة لتشكيل فيلم رقيق من الجليد "الشبيه بالزجاج" - وهي عملية تعرف باسم التزجيج - تحافظ على الحالة الكيميائية الحيوية الأصلية. يعود تاريخ تزجيج العينات البيولوجية للكريويم إلى أكثر من 40 عاما28,29,30 وتعتمد العديد من التقنيات والمعدات التي تم تطويرها لهذه العملية على طريقة النشاف والغطس المفصلة في الأصل31,32,33,34,35 ، حيث يتم تطبيق حجم صغير من العينة (على سبيل المثال، 1-5 ميكرولتر) على شبكة EM متخصصة قبل إزالة المحلول الزائد باستخدام التفاعل المادي للشبكة مع ورق النشاف. عادة ما يتم تحديد توقيت هذه العملية تجريبيا لكل عينة كمكون حاسم لعينات التجميد هو سمك فيلم الجليد الزجاجي - إذا كان الجليد سميكا جدا ، فإن جودة التصوير تتدهور بشكل كبير بسبب زيادة تشتت شعاع الإلكترون في حين أن الجليد الرقيق جدا يمكن أن يحد من اتجاهات البروتين و / أو يستبعد الجسيمات من وسط ثقوب رقائق ^{الشبكة36} . وقد أدى هذا الاعتماد على سمك الجليد المثالي لالتبريد أحادي الجسيمات إلى مجموعة واسعة من التقنيات والمعدات التي يمكن تجميد العينات، بما في ذلك ^{الروبوتات37،38}، microfluidics42، وأجهزة الموجات فوق الصوتية أو ^{الرش27،39،40،41،42،43،44} . في السنوات الأخيرة ، تعتمد بعض أجهزة إعداد العينات الأكثر شعبية على استخدام الروبوتات للتجميد الآلي للعينات باستخدام تقنية النشاف ^{والغطس45}. في حين تم تصميم هذه الأجهزة لخلق سمك الجليد بشكل مستنسخ مناسب للتصوير ، إلا أنها غالبا ما تظل مكلفة للغاية بالنسبة للمختبرات الفردية للشراء والتشغيل وتوجد بشكل عام داخل مرافق cryoEM بأسعار الساعة للاستخدام. في السنوات الأخيرة، عادت تقنية النشاف والغطس اليدوية الأصلية إلى الاستخدام المتزايد3,47,48,49,50,51,52. في الواقع ، يمكن لجهاز النشاف والغطس الذي يتم تشغيله يدويا تحقيق شبكات cryoEM عالية الجودة بجزء صغير من تكلفة النظراء الروبوتيين. وعلاوة على ذلك ، فإن النشاف اليدوي يوفر أيضا المزيد من المستخدمين التحكم في النشاف حيث يمكن للباحثين ضبط نوع النشاف (أي النشاف الخلفي للشبكة ، والنشاف الأمامي للشبكة ، وما إلى ذلك) ، ووقت النشاف استنادا إلى كل عينة على حدة وأسئلة البحث.

في هذه المقالة، نقدم تفاصيل حول كيفية تجميد العينات البيولوجية بشكل فعال باستخدام جهاز التزجيج اليدوي التقليدي إلى جانب منصة dewar مصممة ^خصيصا53. وتقدم أفضل الممارسات، بما في ذلك إعداد cryogen، والتعامل مع الشبكة، وتطبيق العينة، والنشاف، فضلا عن المزالق المشتركة والتوصيات حول كيفية التغلب على هذه العقبات. وتناقش المشورة بشأن كيفية زيادة سمك الجليد استنساخ بين الاستعدادات الشبكة وكيفية تعديل النشاف عينة على أساس نوع العينة البيولوجية. نظرا لانخفاض التكلفة المرتبطة بشراء وتشغيل المكبس اليدوي الموصوف في هذه المخطوطة، يمكن للمختبرات في جميع أنحاء العالم إعداد عينات بيولوجية للكريويم بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ.

1. إعداد بيئة الغطس اليدوي

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 5-30 دقيقة

1. حدد موقع المكبس اليدوي في غرفة باردة 4 درجات مئوية حيث يمكن أن يكون مرطب في موقع مشترك للحفاظ على الغرفة بالقرب من الرطوبة النسبية 100٪ (RH) (الشكل 1A).
   تنبيه: يرجى استشارة إرشادات الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة بشأن الموقع الآمن للمغطاس اليدوي والعمليات الموصى بها.
2. قبل إعداد الشبكة، قم بتشغيل المرطب في الغرفة الباردة لضمان أن درجة الحرارة الإنجابية للغرفة الباردة ≥ 95٪.
   ملاحظة: يمكن أن يؤدي إعداد الشبكة في الرطوبة المنخفضة إلى جفاف الأفلام الرقيقة وتغيير مكونات العازلة بسبب التبخر وانخفاض في قابلية النسخ من الشبكة إلى ^{الشبكة46}. لا ينصح بتجميد الشبكات عند <80 ٪ RH.
3. تأكد من درجة حرارة الغرفة الباردة عند 4 °C .
4. حدد موقع المكبس اليدوي بعيدا عن التيارات الهوائية القوية (أي بعيدا عن فتحات وحدة تكييف الهواء) لأنها يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات بالقرب من الشبكات و / أو تراكم الجليد البارز على الأسطح الباردة.

2. إعداد المواد والملحقات يغرق

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 1-5 دقائق

1. استخدام مقص نظيفة لقطع الدوائر ورقة النشاف إلى 1-1.5 سم واسعة و ~ 9 سم شرائط طويلة. تجنب لمس مركز ورقة النشاف وتجاهل القطع الصغيرة. من المهم التأكد من أن شرائط الورق النشاف جافة ونظيفة وخالية من الملوثات. فصل الشرائط ووضعها في طبق بيتري 100 ملم.
2. ضع غطاء زجاجي مربع مقاس 22 ×22 مم في طبق بيتري زجاجي منفصل مقاس 60 ملم. سيتم استخدام هذا الطبق الزجاجي الذي يحتوي على غطاء زجاجي Petri لتخزين شبكات التخزين والنقل وتصريف التوهج.
   ملاحظة: يوصى باستخدام علبة منفضة الهواء لإزالة أي حطام مرئي من الشريحة قبل إضافة الشبكات. ويمكن أيضا أن تستخدم بندقية مضادة للساكنة لإزالة أي الكهرباء الساكنة التي تتراكم.
3. تجميع وتسمية صناديق تخزين الشبكة.
4. الحصول على 4 إلى 6 ملاقط لقط نظيفة وجافة وتحديد موقعها إلى المكبس اليدوي. فحص بصريا كل ملاقط قبل الغطس للتأكد من أنها ليست معطوبة وخالية من الملوثات.

3. إعداد ديوار cryogen ومغطس دليل

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 5-15 دقيقة

1. تثبيت قاعدة منصة في الجزء السفلي من dewar يغرق. ضع سفينة الإيثان ديوار على قمة قاعدة المنصة، وأضف وعاء الإيثان النحاسي، ثم قم بتثبيت منصة تخزين شبكة الغزل.
   1. بمجرد إضافة النيتروجين السائل (_LN2) إلى ديوار يغرق، لم يعد من الممكن تعديل ارتفاع قاعدة المنصة. تأكد من تثبيت قاعدة الشبكة بشكل صحيح ومستوى للحد من تلف الشبكة و /أو ملاقط بسبب ارتفاع المكبس غير صحيح.
2. قبل التجميد، تحقق من المكبس اليدوي وجميع المعدات الإضافية للتأكد من أنها تعمل بشكل صحيح للحد من فقدان العينة و / أو الشبكة.
3. قبل كل جلسة تجميد، استبدل الشريط الموجود على ذراع المكبس اليدوي المستخدم في حمل الملاقط. الرطوبة العالية للغرفة يمكن أن تتدهور لاصق الشريط وتقليل قدرة الشريط لعقد ملاقط، مما يزيد من احتمال تلف ملاقط و / أو فقدان الشبكة.
4. ضبط مصباح (ق) بالقرب من المكبس اليدوي لضمان وجود ضوء كاف لرصد فتل العينة وضمان نقل الشبكة هو تصور بسهولة لمنع تلف الشبكة و / أو الخسارة (انظر الخطوة 3.7). استخدام مصباح حلقة مباشرة وراء المكبس لتصور حركة السائل وضوء مهمة ذراع مرنة بالقرب من ديوار لإلقاء الضوء على الشبكات المجمدة.
5. ضبط التوتر دواسة القدم لضمان يتم الاحتفاظ بشكل آمن الذراع الغطس ديوار في مكان بينما في الموقف أثار وأفرج عنه بالكامل عندما يتم الاكتئاب دواسة. تنفيذ عدة "الجافة" يعمل قبل تطبيق عينة لضمان المكبس يعمل بشكل صحيح.
   ملاحظة: سيؤدي التعديل غير السليم للتوتر دواسة القدم في الإفراج المبكر عن الذراع يغرق (أي، يتم تعيين التوتر منخفضة جدا) وفقدان الشبكة أو يغرق غير مكتملة من الشبكة في السفينة الإيثان (أي، يتم تعيين التوتر عالية جدا).
6. ضع ديوار يغرق في قاعدة المكبس اليدوي مباشرة تحت الذراع يغرق وتأمينه في مكانه. إرفاق زوج من ملاقط إلى الذراع يغرق باستخدام الشريط المرفقة. في حين عقد الذراع الغطس اليدوي، والاكتئاب دواسة القدم لخفض بعناية الذراع يغرق وضبط سفر الذراع يغرق لضمان الشبكة سوف تحدد موقع داخل منتصف سفينة الإيثان.
7. استخدم محطة النتوء في الجزء العلوي من الذراع المنغمس لتحديد الموضع النهائي للذراع المنغمسة عندما تكون دواسة القدم مكتئبة تماما (الشكل 1B). ضبط ارتفاع وقف عثرة على الذراع يغرق لضبط موقع الشبكة في سفينة الإيثان (الشكل 1C).
   ملاحظة: يمكن أن يؤدي ضبط ارتفاع الذراع المغرق بشكل غير صحيح إلى تلف الشبكة و / أو ملاقط (على سبيل المثال ، يتم تعيين ارتفاع الذراع المغرق منخفضا جدا) أو التزجيج غير الكافي (على سبيل المثال ، يتم تعيين ارتفاع الذراع المغرق مرتفعا جدا).
8. حدد موقع dewar خارج الغرفة الباردة والشروع في إعداد الإيثان السائل (الخطوة 4).

4. إعداد cryogen

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 10-30 دقيقة

1. تقييم خزان الإيثان، المنظم، أنابيب، والإيثان الاستغناء تلميح عن أي علامات على الضرر. الإبلاغ فورا عن أي علامات على حدوث ضرر وتصحيحها قبل المتابعة.
   تنبيه: غاز الإيثان المضغوط والإيثان: خلطات غاز البروبان قابلة للاشتعال ويمكن أن تشكل تهديدا خطيرا للحياة و / أو تؤدي إلى إصابة إذا تم التعامل معها بشكل غير صحيح. يرجى استشارة خبير إذا لم تكن متأكدا من كيفية تشغيل أو التعامل مع خزانات الغاز المضغوط. يرجى الرجوع إلى إرشادات الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة عند التعامل مع الغازات المضغوطة القابلة للاشتعال. بالإضافة إلى ذلك، الإيثان المهزى هو cryogen قوية التي يمكن أن تشكل تهديدا خطيرا للحياة و / أو إصابة إذا لم يتم التعامل معها بشكل صحيح. يرجى الرجوع إلى إرشادات الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة عند التعامل مع cryogens.
2. الحصول على _LN2 كافية في مناسبة _LN2 التعامل مع dewar (أي، 3-4 لتر هو نموذجي لإعداد الشبكة وتخزين).
   تنبيه: _LN2 هو cryogen التي يمكن أن تشكل تهديدا خطيرا للحياة و / أو الإصابة إذا لم يتم التعامل معها بشكل صحيح.
   1. ضمان استخدام جميع معدات الحماية الشخصية لتقليل خطر الإصابة. بخار _LN2 هو اختناق وينبغي التعامل معه في المناطق جيدة التهوية. يرجى استشارة خبير إذا لم تكن متأكدا من كيفية تشغيل أو التعامل مع الأوعية المبردة و cryogens. يرجى الرجوع إلى إرشادات الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة عند التعامل مع cryogens. بالنسبة للحالات التي لا يمكن فيها استخدام النيتروجين السائل في غرفة باردة ، نوصي بإغراق التجميد في مساحة باردة وجيدة التهوية.
3. خارج الغرفة الباردة، تهدئة ديوار يغرق عن طريق صب _LN2 مباشرة في وعاء الإيثان النحاس حتى يصل مستوى النيتروجين السائل إلى الجزء العلوي من وعاء الإيثان (أي، فقط فوق المنصة). أعلى قبالة _LN2 خارج سفينة الإيثان حسب الحاجة. انتقل إلى الخطوة التالية عندما يتوقف _LN2 محتدما بعنف (حوالي 5 دقائق).
   1. إضافة _LN2 مباشرة إلى السفينة الإيثان النحاس لتبريد كافية السفينة قبل تكثيف غاز الإيثان. الفشل في تبريد سفينة الإيثان النحاسية بشكل صحيح سيزيد بشكل كبير من الوقت الذي يستغرقه تكثيف الإيثان.
   2. بمجرد أن تصل درجة حرارة dewar _LN2 ، تجنب ملء dewar بحيث ينسكب _LN2 في وعاء الإيثان.
4. إيثان يأتي كغاز مضغوط ويحتاج إلى أن يكون المسال للاستخدام. يستخدم خزان الإيثان منظما ثنائي المرحلة عالي النقاوة للتحكم في تدفق الغاز. قم بتوصيل الأنابيب بصمام المنفذ التنظيمي واستخدم طرف توزيع معدني مسطح عيار 14 متصلا في النهاية للاستغناء عن الإيثان.
5. قبل فتح صمام الخزان الرئيسي الإيثان، تأكد من الضغط ضبط مقبض الباب ومنفذ صمام مغلقة على طول الطريق. فتح صمام الخزان الرئيسي بالكامل ثم فتح صمام منفذ إلى ~ 50٪. فتح مقبض ضبط الضغط ببطء حتى يتم ملاحظة تدفق الغاز البطيء. استخدم صمام المأخذ لضبط تدفق الغاز.
   تنبيه: دائما نقطة تلميح الاستغناء المعدني بعيدا عن النفس عند فتح الصمامات أو إجراء تعديلات تدفق الغاز.
6. بدء تدفق الغاز ببطء وتقييم معدل التدفق عن طريق إدراج غيض من خط غاز الإيثان في كوب صغير من المياه deionized. ضبط تدفق الغاز حتى معدل التدفق يزعج معتدل المياه.
   1. ضبط معدل تدفق الغاز لضمان حدوث تكثيف الإيثان السليم - بطيء جدا من معدل التدفق سوف يسبب غاز الإيثان لترسيخ في طرف الاستغناء وسريع جدا من معدل التدفق سيؤدي إلى محتدما مكثفة ومنع التجمد.
7. قبل إدخال طرف خط غاز الإيثان في وعاء الإيثان النحاسي، قم بتنظيف ومسح طرف الاستغناء بمناديل مهمة حساسة لإزالة أي ماء.
8. في حركة سلسة وسريعة، حدد موقع طرف توزيع الغاز في الجزء السفلي من وعاء الإيثان النحاسي وابدأ في تحريك طرف الاستغناء في دائرة بطيئة حول الجزء السفلي من وعاء الإيثان. سوف يتشكل الإيثان الصلب على الفور ولكن سرعان ما يسيل مع إضافة المزيد من غاز الإيثان / تكثيفه.
   1. الاستمرار في تحريك طرف الايثان الاستغناء المعدنية حولها في الجزء السفلي من سفينة الإيثان لتسييل الإيثان الصلبة. ملء وعاء الإيثان إلى 3/4 كامل من الإيثان السائل (2-3 المواضيع من أعلى). وقف تدفق غاز الإيثان عن طريق إزالة بعناية تلميح الايثان المعدنية الاستغناء من وعاء الإيثان النحاس وإغلاق صمام منفذ.
9. أعلى قبالة ديوار يغرق مع _LN2 صب بلطف على جانب ديوار لتجنب _LN2 بالإضافة إلى سفينة الإيثان النحاس، حتى مستوى السائل يمس فقط سفينة الإيثان النحاس. ضع غطاء الرغوة على ديوار يغرق لتسهيل التصلب الإيثان.
   1. يجب على _LN2 الاتصال مباشرة بسفينة الإيثان النحاسية للمساعدة في تجسيد الإيثان. بعد حوالي 5 دقائق، سوف يصبح الإيثان داخل السفينة النحاسية صلبا مجمدا تماما. أضف المزيد من _LN2 حتى يلمس فقط سفينة الإيثان والمضي قدما إلى الخطوة التالية.
10. إذا لم يتجمد الإيثان الصلبة، ثم سفينة الإيثان النحاس ليست باردة بما فيه الكفاية للخطوات المتبقية. أضف المزيد من _LN2 حتى يلمس سفينة الإيثان وانتظر 5 دقائق إضافية. تأكد من أن الإيثان داخل السفينة النحاسية مجمد تماما الصلبة.
11. افتح صمام منفذ الغاز لإنتاج تدفق غاز الإيثان بمعدل مماثل كما هو محدد في الخطوة 4.6. ضع عموديا طرف الايثان المعدني في الإيثان الصلب ومواصلة تحريك طرف الاستغناء عن الإيثان في حركة دائرية لإذابة الإيثان الصلب.
    1. الاستمرار في إضافة الإيثان حتى يتم مستوى مع الجزء العلوي من السفينة الإيثان النحاس. إزالة ببطء غيض من وعاء الإيثان وإغلاق صمام منفذ خزان الإيثان. تغطية ديوار مع غطاء ل ~ 1-4 دقيقة (ق) للسماح للإيثان ترسيخ حول حواف السفينة الإيثان النحاس.
       ملاحظة: سيكون لسفينة الإيثان المثالية حلقة متماثلة من الإيثان الصلب مقاس 2-3 مم في محيط وعاء الإيثان النحاسي مع الإيثان السائل في المركز (الشكل 1D والشكل 2).
    2. تأكد من أن الإيثان يكون باردا قدر الإمكان دون ترسيخ لضمان التزجيج السليم للعينة البيولوجية. يمكن أن يؤدي الفشل في إعداد الإيثان السائل بشكل صحيح إلى عدم كفاية تزجيج العينة ، وتراكم الجليد ، و / أو فقدان العينة ، كل منها يساهم في تدهور جودة العينة للتصوير.
    3. إذا لم تتشكل حلقة صلبة من الإيثان بعد 2-3 دقائق، أضف المزيد من _LN2 إلى ديوار وغطيه لمدة 2-5 دقائق أخرى.
    4. إذا كان الإيثان هو ترسيخ بسرعة كبيرة جدا، ثم استخدام زوج كبير من ملاقط نظيفة لتسخين بلطف وعاء الإيثان و / أو الإيثان الصلبة لمنع التصلب الإيثان الكامل. مرة واحدة في الإيثان _وLN2 مستقرة، وإغلاق جميع صمامات خزان الإيثان وتحديد موقع ديوار يغرق إلى المكبس اليدوي. تأمين ديوار يغرق إلى المكبس اليدوي.
       تنبيه: كن حذرا للغاية عند نقل ال ديوار حيث يمكن أن يتسرب _LN2 إلى وعاء الإيثان وترسيخ الإيثان السائل. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام مجموعة نظيفة من الملاقط لإذابة أي إيثان صلب في منتصف السفينة.
12. اختبار موقع dewar الإيثان مع زوج من ملاقط فارغة لضمان طرف ملاقط يقع في وسط سفينة الإيثان وهناك مساحة كافية للشبكة وطرف ملاقط داخل الإيثان السائل (الشكل 1D).
    1. إذا كان حلقة الإيثان الصلبة سميكة جدا لسهولة التعامل مع الشبكة، ثم استخدام زوج من درجة حرارة الغرفة، ملاقط نظيفة لإذابة الإيثان الصلبة وخلق المزيد من منطقة التجمد في وسط سفينة الإيثان.

5. إعداد شبكات EM

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 1-5 دقائق

1. إضافة مربع التخزين الشبكة (es) إلى dewar، فك غطاء مربع التخزين الشبكة (ق)، وتأكد من كل غطاء يمكن تدوير بحرية إلى فتحة شبكة جديدة.
2. نقل الشبكات بعناية من مربع تخزين الشبكة إلى حافة غطاء الزجاج المربع مع ~ 30-40٪ من الشبكة قبالة حافة الشريحة. تأكد من أن احباط الشبكة تواجه. تأكد من تغطية الشبكات عندما لا تكون قيد الاستخدام. وضع الشبكات على حافة غطاء الزجاج مربع يوفر سهولة التعامل مع الشبكة ويقلل من فرصة الانحناء أو إتلاف الشبكة أثناء النقل.
   ملاحظة: عادة ما يتم إعداد شبكات 4-6 في كل مرة.
3. جعل الشبكات هيدروفيلي باستخدام تفريغ توهج أو منظف البلازما.
   ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الإرشادات الموصى بها لتنظيف الشبكة التي يوفرها مصنع منظف التوهج/منظف البلازما.
   1. استخدام الشبكات في غضون 10 دقائق من تنظيف البلازما والشبكات تفقد hydrophilicity والشبكة إلى الشبكة استنساخ يقلل بعد هذا الوقت.

6. إعداد عينة cryoEM عن طريق يغرق تجميد

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 10 دقائق > (~1-3 دقائق لكل شبكة)

1. استخدم ملاقط لقط نظيفة وجافة لالتقاط شبكة تنظيف ، وانزلاق المشبك البلاستيكي لإصلاح الشبكة في مكانها ، وانقر بلطف على الملاقط لضمان تأمين الشبكة بشكل صحيح.
   1. التعامل مع الشبكات من الحلقة الخارجية لمنع تلف احباط الشبكة.
2. تطبيق 1 إلى 5 ميكرولتر من العينة على الجانب المعد (على سبيل المثال، الجانب الأمامي أو احباط) من الشبكة.
   ملاحظة: يعتمد الحجم الأمثل ووقت النشاف على العينة ويحتاج إلى تحسين لكل عينة; تتطلب أحجام أكبر وعينات أكثر لزوجة فترات النشا أطول.
3. تأمين التجميع عينة الشبكة ملاقط إلى ذراع الغطس اليدوي عن طريق التفاف الشريط حول مقبض ملاقط.
   1. مواجهة العينة نحو المستخدم للنشاف الجبهة التقليدية. إذا تطلب النموذج إعادة النشاف، ثم حدد موقع العينة بعيدا عن المستخدم.
4. عقد نظيفة وجافة وقطع قطعة من الورق النشاف بين الإبهام والسبابة من كل يد.
   1. التعامل فقط مع أوراق النشاف من الحواف وأبدا لمس المركز والزيوت والملوثات الأخرى من اليدين / قفازات يمكن أن تغير جودة الشبكة.
5. بقية الأيدي على حافة ديوار يغرق لإنشاء موقف مستقر. حدد موقع ورقة النشاف الموازية لسطح الشبكة على بعد 1 سم تقريبا من سطح الشبكة.
   1. استخدم القسم الأوسط من ورق النشاف للسماح بحركة السوائل الكاملة وحتى الفتل عبر سطح الشبكة.
6. قم بزلاجة الإبهام وتدوير أصابع الإبهام والرنين برفق باتجاه بعضها البعض لثني ورق النشاف نحو الشبكة لبدء النشاف. حافظ على الاتصال بين ورق النشاف وسطح الشبكة أثناء عملية النشاف بأكملها.
   1. اتصل مباشرة بالورق النشاف إلى سطح الشبكة وحافظ على اتصال متناسق عبر سطح الشبكة.
   2. الانحناء بلطف ورقة النشاف يقلل من الانحناء من الشبكة و / أو الأضرار التي لحقت سطح الشبكة، ويؤدي إلى الجليد أكثر اتساقا عبر الشبكة (الشكل 3A).
7. مراقبة الجبهة السائلة المتنقلة وبمجرد أن يتوقف عن التقدم في ورقة النشاف تبدأ العد لمدة 4 إلى 6 ثوان.
   ملاحظة: يمكن أن يحدث العد بمجرد اتصال الورق النشاف بسطح الشبكة ولكن يمكن أن يحدث إمكانية إعادة إنتاج الشبكة إلى الشبكة. سيعتمد إجمالي وقت اللطخة على نوع الشبكة ونوع احباط وتركيز العينة ونوع العينة (على سبيل المثال ، قابل للذوبان مقابل الغشاء مقابل البروتينات الخيطية). للحصول على عينات لزجة أكثر، يلزم الحصول على أوقات لطخ أطول (على سبيل المثال، من 5 إلى 7 ثوان).
   1. هام: وضع نظام عد موثوق ومتسق لتعزيز إمكانية إعادة الإنتاج بشكل كبير أثناء عملية التجميد.
8. حرك أصابع الإبهام والسبابة اليمنى واليمنى في اتجاهين متعاكسين لإزالة ورق النشاف في "حركة التقاط" بعيدا عن سطح الشبكة. الاكتئاب على الفور دواسة القدم للافراج عن الذراع يغرق ويغرق الشبكة في الإيثان السائل.
   1. في وقت واحد إزالة ورقة النشاف واضغط على دواسة القدم لإغراق الشبكة في الإيثان في أقرب وقت ممكن للحصول على أفضل نتائج التجميد. كلما طالت الفترة الزمنية بين إزالة الورق النشاف والغطس ، كلما زاد تبخر الأفلام الرقيقة وسيقلل من إمكانية إعادة الإنتاج من الشبكة إلى الشبكة.
9. استخدام يد واحدة لتحقيق الاستقرار في ملاقط لقط، والاسترخاء الشريط بعناية من جميع أنحاء ملاقط والذراع يغرق دليل.
   1. الحفاظ دائما على اتصال مع ملاقط لمنع حركة شبكة ملاقط والحد من الأضرار الشبكة التي تحدث من ضرب الشبكة ضد الإيثان الصلبة.
10. بمجرد أن تكون ملاقط لقط خالية من الذراع اليدوي يغرق، والحفاظ على ملاقط في يد واحدة يستريح على رأس ديوار يغرق، وضمان الشبكة لا تزال في الإيثان السائل. الشريحة بعناية المشبك البلاستيك بعيدا عن الشبكة بحيث يمكن نقل الشبكة. الحفاظ على الضغط على الملاقط للاحتفاظ بالشبكة.
    1. مع حركة واحدة سريعة، نقل بسرعة الشبكة من سفينة الإيثان إلى خزان _LN2 . ضع الشبكة بعناية في مربع تخزين الشبكة.
       ملاحظة: قد تتوطد بعض الإيثان على سطح الشبكة. فتح ملاقط قليلا سوف كسر الإيثان والسماح للشبكة أن تسقط في مربع الشبكة.
11. التفاف غيض من ملاقط في مهمة حساسة مسح لمنع تراكم الصقيع. يترك جانبا حتى تعود الملاقط إلى درجة حرارة الغرفة.
    1. لديك 4 إلى 6 ملاقط في متناول اليد لسهولة الاستخدام. سيتم استخدام كل ملاقط لتجميد العينة وتسخينها قبل الاستخدام اللاحق.
12. كرر الخطوات 6.1-6.11 لكل شبكة.
13. بمجرد أن يتوج التجميد ، أغلق مربع الشبكة بشكل آمن ونقله إلى موقع تخزين مناسب.
14. التخلص بعناية من الإيثان السائل وLN2 وتخزين جميع المواد في مكان جاف.

سيؤدي التنفيذ الناجح لبروتوكول النشاف والغطس الموصوف هنا إلى طبقة رقيقة وموحدة من الجليد الزجاجي الخالي من أي جليد سداسي وملوثات وتدرجات كبيرة من الجليد غير القابل للاستخدام والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني (الشكل 3). الاتصال غير المتسق لورق النشاف مع سطح الشبكة ، أو إزالة ورق النشاف قبل الأوان ، أو تحريك ورقة النشاف أثناء اتصال الشبكة يمكن أن يقلل من جودة الجليد الزجاجي ويؤدي إلى سمك جليدي غير متناسق عبر شبكة EM (الشكل 4)

الشكل 1: عينة يغرق غرفة والمعدات المطلوبة. أ) غرفة باردة نظمت لتجميد يدوي من العينات البيولوجية باستخدام جهاز لطخة والغطس التقليدية المبينة في هذه المقالة. يتم عرض المعدات اللازمة ووضع العلامات وفقا لذلك. ب) لضبط ارتفاع العمل من المكبس اليدوي، وضبط وقف عثرة عن طريق الانزلاق صعودا وهبوطا الذراع يغرق دليل وتأمينه عن طريق تشديد المسمار. ج) التكبير في عرض السفينة الإيثان ومنصة تخزين شبكة الغزل للإشارة إلى الارتفاع المناسب والموقع من ملاقط لقط والشبكة داخل سفينة الإيثان النحاس فارغة. يجب أن لا تتصل الملاقط والشبكة بجوانب أو أسفل الإيثان النحاسي لتجنب الضرر. د) الارتفاع المناسب وموقع ملاقط لقط والشبكة في الإيثان السائل. يجب أن تدخل الملاقط والشبكة الإيثان السائل في المركز ، وتجنب الاتصال مع الإيثان الصلب في المحيط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الإيثان السائل المعد. التكبير في عرض ل dewar يغرق تظهر حالة الإيثان السائل في وعاء الإيثان النحاس قبل تجميد العينة. حلقة 2-3 ملم من الإيثان الصلب داخل وعاء الإيثان النحاسي مرئية بوضوح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور أبوفيريتين التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام تقنية النشاف والغطس اليدوية. (أ) أطلس تمثيلي لشبكة cryoEM يظهر سمك الجليد وجودة مربعات الشبكة التي يمكن الحصول عليها باستخدام تقنية النشاف والغطس اليدوية. (ب) ميكروجراف مصحح بالحركة من أبوفيريتين الماوس الهزاز المكتسبة باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال 200 كيلو فولت مجهزة كاشف الإلكترون المباشر في جامعة كاليفورنيا، مرفق CryoEM في سان دييغو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: أطلس تمثيلي لشبكة cryoEM دون المستوى الأمثل تظهر سمك الجليد غير متناسقة عبر الشبكة، والعديد من المربعات المكسورة، والمناطق التي الجليد سميكة جدا لتصوير العينة.

لا يزال تزجيج العينات البيولوجية للتصوير عن طريق المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) خطوة بالغة الأهمية لتحديد الهيكل الناجح. تمثل طريقة النشاف والغطس اليدوية الموصوفة في هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة وقوية لتجميد العينات البيولوجية بسرعة في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي للتصوير بالتبريد. وباستخدام الأساليب المبينة في المخطوطة، سيتمكن الباحثون من تجميع وتشغيل المكبس اليدوي، وإعداد المبرد المناسب للعينات البيولوجية التجميدية، وشبكات EM الملطخة يدويا التي تحتوي على عينات بيولوجية. في حين أن هذه الطريقة قوية جدا، ينبغي توخي الحذر خلال الخطوات الحاسمة في هذا الإجراء للحصول على سمك الجليد الأمثل وجودة للتصوير عالي الدقة. لقد حددنا العديد من هذه الخطوات الهامة أدناه ونقدم توصيات حول كيفية استكشاف هذه الخطوات وإصلاحها.

من الضروري وضع ذراع الغطس اليدوي بشكل صحيح لضمان أن الشبكة تقع في مركز الإيثان السائل داخل السفينة النحاسية بعد الغطس. ارتفاع غير لائق أو موقف من الذراع يغرق و / أو عدم تأمين ملاقط بشكل صحيح سيؤدي إلى تلف ملاقط لقط، وشبكة EM، وربما المكبس اليدوي. كما نوقش أعلاه، ونحن دائما أداء تجربة واحدة على الأقل تشغيل قبل إعداد العينات البيولوجية للتحقق من أن شبكة EM سوف تحدد موقع إلى مركز السفينة الإيثان النحاس بعد هبوط ناجح (الشكل 1C). وبالإضافة إلى ذلك، نقوم أيضا بإجراء تعديلات طفيفة على موقع dewar يغرق بعد تجميد كل شبكة لضبط موضع الشبكة داخل سفينة الإيثان (الشكل 1D).

التحضير السليم للكريوجين الإيثان أمر بالغ الأهمية للحصول على أفلام رقيقة من العينات البيولوجية في الجليد الزجاجي. وقد لاحظنا أن وجود حلقة من الإيثان الصلب من عيار 2-3 مم حول الحافة الداخلية لوعاء الإيثان النحاسي يضمن أن درجة حرارة الإيثان السائل هي المثلى لتزجيج العينة (الشكل 2). في الواقع ، بعد تجميد كل شبكة ، نراقب جودة الإيثان ونجري تعديلات طفيفة - الاحترار قليلا للسفينة إذا كان الكثير من الإيثان قد عزز أو يبرد الإيثان إذا كان النظام قد استعد - حسب الحاجة. لقد وجدنا أن حافة ملاقط درجة حرارة الغرفة كافية لتسييل الإيثان الصلب أثناء تغطية الديوار بغطاء الرغوة لمدة 1-5 دقائق هو الوقت الكافي للسماح للإيثان بالتبريد. والأهم من ذلك، أننا نجري هذه التعديلات قبل إعداد سطح الشبكة (أي تنظيف البلازما) وتطبيق العينة على الشبكة لأن هذا يمكن أن يدخل متغيرا آخر لإعداد الشبكة غير قابل للاستنساخ.

وأخيرا، نوصي بتطوير روتين موحد لللطخ والغطس - تطبيق العينة، ولطخ العينة، ووقت النشاف - لزيادة إمكانية إعادة الإنتاج من الشبكة إلى الشبكة. الانحناء ورقة النشاف نحو الشبكة م يسمح للاتصال موحدة من الورق مع الشبكة وتنتج سمك الجليد أكثر اتساقا عبر الشبكة بأكملها، مما أدى إلى توزيع الجسيمات حتى داخل ثقوب الشبكة (الشكل 3A والشكل B، على التوالي). هذه الطريقة من النشاف على النقيض من أجهزة النشاف الروبوتية التي تتفاعل مع العينة بزاوية قد تؤدي إلى تدرج من سمك الجليد عبر الشبكة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الانحناء من ورقة النشاف يقلل أيضا من فرصة إتلاف الشبكة EM عند الاتصال مع ورقة النشاف عن طريق التخزين المؤقت للقوة التي يتم تطبيقها من قبل المستخدم. بعد وقت النشاف المطلوب ، قم بسرعة بتصويب ورقة النشاف من خلال إجراء حركة عض لتحريك ورقة النشاف بسرعة بعيدا عن سطح الشبكة قبل الغطس لمنع تلف الشبكة عند إطلاق ذراع الغطس اليدوي. لقد وجدنا هذه الطريقة النشاف والحركة العض من ورقة النشاف، عندما توقيت مع الإفراج في وقت واحد من الذراع يغرق دليل عبر دواسة القدم، ويحد من تبخر الفيلم رقيقة قبل التزجيج ويزيد من إعادة إنتاج الشبكة إلى الشبكة.

طريقة لطخة والغطس اليدوية الموصوفة هنا هي طريقة قوية وموثوقة تساعد على تقليل بعض العبء المالي الذي يمكن أن يضعه cryoEM على المختبرات الناشئة. في حين أن هذه الطريقة قابلة للاستنساخ ، فإن إنشاء جليد حيوي عالي الجودة مناسب للكريويم يعتمد على خبرة ومهارة الباحث الفردي. على الرغم من أن المكبس الروبوتية وغيرها من التكنولوجيات الناشئة أتمتة عدة جوانب من عملية التجميد، فهي محدودة عموما من قبل مدى السيطرة التي تقدمها للباحثين وغالبا ما تتكبد ثمنا باهظا لشراء وتشغيل. مع الطريقة المبينة في هذا البروتوكول ، سيتمكن الباحثون من الاستفادة من منصة إعداد شبكة EM بأسعار معقولة وتنوعا توفر المرونة لتحسين ظروف الهبوط (أي أنواع ورق النشاف ، وزاوية النشاف ، وفترات النشاف ، واتجاهات النشاف ، وما إلى ذلك) استنادا إلى أنواع العينة والخصائص.

ليس لدينا ما نكشفه

نشكر أعضاء مختبر هيرزيك على التفكير النقدي وتقديم الملاحظات حول هذه المخطوطة ومحتوى الفيديو. M.A.H.Jr. مدعوم من قبل NIH R35 GM138206 وكباحث سيرل. H.P.M.N مدعوم بمنحة التدريب على الفيزياء الحيوية الجزيئية (NIH T32 GM008326). كما نود أن نشكر بيل أندرسون وتشارلز بومان والدكتور غابرييل لاندر في معهد سكريبس للأبحاث للمساعدة في تصميم وتجميع واختبار المكبس اليدوي المعروض في الفيديو.