Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtig für die komplexe Regulierung von Entscheidungen über das Zellschicksal und das Entwicklungstiming. In-vivo-Studien über den Beitrag von miRNAs während der frühen Entwicklung sind aufgrund der begrenzten Zellzahl technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus erfordern viele Ansätze eine miRNA von Interesse in Assays wie Northern Blotting, Microarray und qPCR. Daher wurden die Expression vieler miRNAs und ihre Isoformen in der frühen Entwicklung nicht untersucht. Hier zeigen wir ein Protokoll zur kleinen RNA-Sequenzierung von sortierten Zellen aus frühen Mausembryonen, um eine relativ unvoreingenommene Profilierung von miRNAs in frühen Populationen von neuralen Kammzellen zu ermöglichen. Wir überwinden die Herausforderungen der geringen Zelleingabe und Größenauswahl während der Bibliotheksvorbereitung mit Verstärkung und gelbasierter Reinigung. Wir identifizieren das embryonale Alter als eine variable Bilanz ierung von Variationen zwischen Replikationen und stufenseitig abgestimmten Mausembryonen, die verwendet werden müssen, um miRNAs in biologischen Replikationen genau zu profilieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode allgemein angewendet werden kann, um die Expression von miRNAs aus anderen Zelllinien zu profilieren. Zusammenfassend lässt sich untersuchen, wie miRNAs Entwicklungsprogramme in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons regulieren.

Eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie ist, wie eine einzelne undifferenzierte Zelle einen ganzen Organismus mit zahlreichen komplexen Zelltypen hervorrufen kann. Während der Embryogenese wird das Entwicklungspotenzial der Zellen mit der Entwicklung des Organismus zunehmend eingeschränkt. Ein Beispiel ist die neuronale Kammlinie, die sich schrittweise von einer multipotenten Zellpopulation in verschiedene terminale Derivate wie periphere Neuronen, Glia, Schädelknochen und Knorpel unterscheidet. Neurale Kammzellen werden während der Gastrulation aus dem Ektoderm spezifiziert und durchlaufen dann einen epitheliaden mesenchymalen Übergang und wandern durch den Embryo zu diskreten Stellen im ganzen Körper, wo sie endlos¹differenzieren. Jahrzehntelange Arbeit hat ein transkriptionsspezifisches Gen-Regulierungsnetzwerk aufgedeckt, aber weit weniger ist über die Mechanismen der post-transkriptionellen Regulierung bekannt, die den Zeitpunkt der Entwicklung des neuronalen Kamms steuern.

Frühere Arbeiten legen nahe, dass microRNAs (miRNAs) die Genexpression für das richtige Entwicklungstiming und die Entscheidungen über das Zellschicksal^2,3,^4,,5,6. Studien über miRNAs in der Entwicklung des neuronalen Kamms haben sich weitgehend auf spätere Stadien der craniofacial Entwicklung konzentriert. Zum Beispiel sind miR-17-92 und miR-140 entscheidend für die Palatogenese während der craniofacial Entwicklung bei Maus und Zebrafisch, bzw.^7,8. Der Beitrag von miRNAs zu den frühesten neuralen Kammschicksalentscheidungen des Embryos wurde nicht gründlich untersucht. Studien über miRNAs bei Entscheidungen über das frühe Schicksal wurden durch technische Herausforderungen wie die geringe Zellzahl in frühen Embryonen begrenzt.

MiRNAs wurden in vitro aus Zelllinien mit embryoiden Körpern in verschiedenen Stadien der Differenzierung profiliert, um die frühe Mausentwicklung zu modellieren⁹. Die Untersuchung kleiner RNAs in vivo während der frühen Entwicklung von Säugetieren war relativ begrenzt. Frühere Methoden zum Profilieren von miRNAs haben zu Verzerrungen geführt, da eine bekannte Sequenz verwendet wird, um die Expression einer bestimmten miRNA in Methoden wie qPCR, Mikroarrays und nördlichen Blots¹⁰zu analysieren. Die Sequenzierung der nächsten Generation und die verbesserung der molekularen Werkzeuge ermöglichen nun eine relativ unvoreingenommene Analyse der miRNA-Expression, um ihren Beitrag zur frühen Entwicklung von Säugetieren und Entscheidungen über das Zellschicksal zu untersuchen.

Hier berichten wir über eine Technik zur Ernte und Sequenzierung kleiner RNAs, die in neuralen Kammzellen von frühen Mausembryonen über die Gastrulation (E7.5) bis zum Beginn der Organogenese (E9.5) exprimiert werden. Diese Technik ist einfach und kombiniert Linienverfolgung, Zellsortierung und gelbasierte Größenauswahl, um kleine RNA-Sequenzierungsbibliotheken aus einer minimalen Anzahl von Zellen für die Sequenzierung der nächsten Generation vorzubereiten. Wir betonen, wie wichtig es ist, dass Embryonen in der strikten Anfangsphase 6-Stunden-Zeitintervalle auflösen, um einen umfassenden Überblick über miRNAs während der raschen Veränderungen der frühen Entwicklung zu erhalten. Diese Methode kann in genetischen und Entwicklungsstudien weit verbreitet werden und vermeidet die Bündelung von Embryonen. Wir beschreiben einen Weg, um Herausforderungen aktueller Methoden wie miRNA-Anreicherung mit gelbasierter Reinigung, Bibliotheksquantifizierung und Minimierung von Voreingenommenheit, die von PCR eingeführt wurde, zu überwinden. Diese Methode wurde verwendet, um miRNA-Expressionsmuster im Laufe der Zeit zu identifizieren, um zu untersuchen, wie miRNAs das Entwicklungstiming in der neuronalen Kammlinie von Mausembryonen steuern.

Alle Forschungs- und Tierpflegeverfahren wurden vom Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-zugelassene Tierpflegeeinrichtung am Baylor College of Medicine untergebracht. Alle Stämme wurden auf C57BL6-Hintergrund beibehalten.

1. Embryonizieren (E7.5-E9.5)

1. Entfernen Sie Gebärmutterhörner von einer schwangeren weiblichen Maus und sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol, wo der Schnitt gemacht werden soll.
2. Reinigen Sie die Gebärmutter durch Spülen mit Phosphat gepufferter Saline (PBS). Legen Sie die Gebärmutter in eine sterile Kunststoff 10 cm Schale.
3. Mit Mikrodissektionsscheren trennen Sie jede Decidua, die eine Region enthält, voneinander. Schälen Sie den Gebärmuttermuskel und setzen Sie alle Deciduae aus. Nacheinander entfernen Sie die Decidua aus jedem Embryo.
4. Entfernen Sie den Dottersack von jedem Embryo und speichern Sie die Genotypisierung.
5. Bewegen Sie alle Embryonen in ein neues Gericht mit frischem PBS für die Bildgebung.
6. Nehmen Sie ein Bild des gesamten Wurfs. Bild jeden Embryo einzeln und zählen Sie die Anzahl der Sos jedes Embryos. Halten Sie die Vergrößerung und Exposition (für Fluoreszenz) zwischen den Experimenten gleich.
   HINWEIS: Wir stellen fest, dass eine Exposition von 50-200 ms für die Fluoreszenz geeignet ist und dass 20 ms für die Einstellung des hellen Feldes geeignet sind.

2. Embryo-Dissoziation und Zellsortierung

1. Gehen Sie für jeden embryonalen Embryo wie folgt vor.
   1. Enthaupten Sie knapp über dem otischen Placode für Embryonen, die älter als E8.0 sind (wenn nur markierte Zellen des Schädelbereichs gewünscht werden). Bei E7.5-Embryonen extraembryonale Strukturen entfernen (wenn nur der embryonale Embryo gewünscht ist).
   2. Bewegen Sie den Kopf in einem minimalen PBS-Volumen auf einen sauberen Brunnen einer 48-Well-Platte. Fügen Sie 250 L Papain (27 U/ml) hinzu. Pipette sanft mit einem p200 auf und ab.
   3. Unter dem Mikroskop suchen und nach Klumpen und Einzelzellen suchen.
   4. Wiederholen Sie das sanfte Pipetieren nach oben und unten, bis eine Einzelzellsuspension erreicht ist (in der Regel drei Runden Nachundin und Ab, die zwischen 30 s und 1 min für E7.5-E9.5 entsprechen sollten).
   5. Quench mit 250 l fetalem Rinderserum (FBS).
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.5 für jeden zu sortierenden Embryo.
2. Filtern Sie 500 l Zellsuspension durch ein 35-m-Nylon-Mesh-Filterkappenrohr, um Klumpen zu entfernen.
3. Nehmen Sie das Filtrat und bewegen Sie sich auf neue 1,5 ml Rohr und drehen Sie bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie Überstand sorgfältig und übertragen Sie auf neue Röhre (speichern, bis lebende Zellen bekannt sind, in der Pellet zu sein).
4. Zellpellet in 300 l PBS mit 0,5-1% Rinderserumalbumin aufE setzen und bis zur Sortierung auf Eis halten (die Zeit bis zum Ende der Sortierung minimieren).
   1. Nehmen Sie auf Wunsch 10 l Zellsuspension und kombinieren Sie sie mit 10 l Trypan blue (0,4%) und zählen sie mit einem Hämozytometer, um die ungefähre Zellquantifizierung und Lebensfähigkeit zu identifizieren, da Trypan blau nur abgestorbene Zellen färbt.
5. Filtern Sie jede Probe kurz vor dem Sortieren erneut durch ein Filterkappenrohr, und fügen Sie DAPI-Färbung für lebende Zellen hinzu.
6. Sortieren Sie jede Probe in 500 l RNA-Extraktionslyselösung (siehe Tabelle der Materialien) auf Zellsortierer mit 70 m Düse.
7. Mischen und lagern Sie bei -80 °C, bis alle Proben geerntet sind. Gehen Sie von diesem Punkt aus nur, wenn alle Proben, die für ein Experiment benötigt werden, geerntet werden, um technische Variationen zwischen den Runden der Bibliotheksvorbereitung zu reduzieren.

3. RNA-Extraktion

HINWEIS: Das Protokoll wird vom RNA-Isolationskit angepasst; siehe Materialtabelle.

1. Fügen Sie jeder Probe 500 l RNA-Extraktionslyselösung (siehe Materialtabelle)hinzu, um das Gesamtvolumen von 1000 l zu erreichen.
2. Jede Probe bei Raumtemperatur auftauen.
3. Wirbel jede Probe für 1,5 min, um sicherzustellen, dass die Kappe sicher auf jedem Rohr vor Beginn der Homogenisierung ist. Inkubieren Sie das Homogenat bei Raumtemperatur (15–25 °C) für 5 min.
4. 140 l Chloroform hinzufügen, Das Rohr sicher kappen und 15 s kräftig schütteln. Bei Raumtemperatur für 3 min inkubieren.
5. Zentrifuge für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf eine neue Sammelröhre auf Eis. Übertragen Sie keine Interphase oder organische Phase. Wenn Sie sich der rosaorganischen Phase nähern, kippen Sie das Rohr zur Seite und entfernen Sie kleine Aliquots, bis keine klare wässrige Phase gesammelt werden kann.
6. Messen Sie das Volumen der RNA, die wässrige Phase enthält, die aus jeder Probe gesammelt wird, für die korrekte Berechnung im nächsten Schritt.
7. Fügen Sie 1,5 Volumen (in der Regel 525 l, kann aber etwas mehr oder weniger) von 100% Ethanol und mischen gründlich durch Pipettieren.
8. Pipette bis zu 700 l Probe, einschließlich etwaiger Niederschlagsproben, in die Säule in einem 2 ml Sammelrohr. Deckel und Zentrifuge bei ≥8.000 x g für 15 s bei Raumtemperatur schließen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
9. Wiederholen Sie Schritt 3.8 mit dem Rest der Probe.
10. Waschen Sie die Spalte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Trocknen Sie die Säule, indem Sie mit voller Geschwindigkeit für 1 min drehen. Übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5 ml Sammelrohr.
11. Rohrleitung 11 l nukleasefreies Wasser auf die Mitte der Membran. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 1 min sitzen. Drehen Sie die maximale Geschwindigkeit für 1 min, um die Spalte zu löschen.
12. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und einem parallelen kapillaren Elektrophorese-Instrument (Tabelle der Materialien).

4. Bibliotheksvorbereitung

HINWEIS: Das Protokoll ist aus kleinen RNA-Bibliothek Vorbereitung Kit Handbuch angepasst; siehe Tabelle der Materialien.

1. Vervollständigen Sie die Denaturierung und 3' Adapterligation, wie im Handbuch für die Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek angegeben, mit einer Verdünnung des 3'-Adapters.
2. Fahren Sie mit der übermäßigen 3' Adapterentfernung fort.
3. Vervollständigen Sie die Adaptererschöpfung, wie im Handbuch zum Vorbereiten der kleinen RNA-Bibliothek angegeben. Achten Sie darauf, frisch zubereitetes 80% Ethanol für die Perlenreinigung zu verwenden und dass alle überschüssigen Ethanolvollständig enthoben wird, kurz vor der Resuspension in nukleasefreiem Wasser, ohne die Perlen zu übertrocknen (Das Knacken des Perlenpellets wird beim Übertrocknen beobachtet).
4. Fahren Sie direkt mit der Überzahlder inaktivierung des Adapters fort.
5. Vervollständigen Sie die überschüssige Adapterinaktivierung, wie im Handbuch zur Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek angegeben, in dem alle Reagenzien auf Eis montiert werden.
6. Fahren Sie mit 5' 4N Adapterligation fort.
7. Komplette 5' Adapterligation, wie im Handbuch zur Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek angegeben, wobei eine 1/4 Verdünnung des 5'-Adapters verwendet wird und alle Reagenzien auf Eis montiert werden.
8. Fahren Sie mit der umgekehrten Transkription fort.
9. Vollständige Reverse-Transkriptions-Erste-Strang-Synthese, wie im Handbuch für die Vorbereitung der RNA-Bibliothek angegeben und darauf geachtet wird, alle Reagenzien auf Eis zu montieren und das Enzym nicht für längere Zeit aus dem Gefrierschrank fernzuhalten.
   HINWEIS: An dieser Stelle kann das Protokoll angehalten werden, wobei Proben über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Alternativ können Sie auch weiterhin PCR-Verstärkung enden.
10. Vollständige PCR-Verstärkung durch Zusammenstellung der Reagenzien, wie im Handbuch für die Vorbereitung der RNA-Bibliothek angegeben, und Minimierung der Anzahl der PCR-Zyklen. Die Anzahl der PCR-Zyklen sollte experimentell für jede Anwendung bestimmt werden, und die minimale Anzahl von Zyklen sollte verwendet werden. Hier haben wir 16 Zyklen verwendet, um unsere kleinen RNA-Bibliotheken erfolgreich zu verstärken.
11. Fahren Sie direkt mit der Größenauswahl fort.

5. Größenauswahl

1. Zu jeder Probe 5 l 6x Gel-Ladefarbstoff und Pipette zum Mischen hinzufügen.
2. Laden Sie 10 l Leiter auf den ersten Brunnen des Gels, so dass der Brunnen sofort nach rechts leer. Das gesamte Produkt ab Schritt 5.1 auf ein 6% Tris/Borat/Ethyleniamintetraessigsäure – Polyacrylamidgel (TBE-PAGE) laden und 1 Spur zwischen jeder Probe lassen.
   HINWEIS: Bewahren Sie den Behälter auf, in dem das Gel für die folgenden Schritte geliefert wurde.
3. Führen Sie das Gel bei 150 V für ca. 30-40 min in 0,5x TBE Laufpuffer (bis das untere Farbstoffband in der Nähe der Unterseite des Gels ist, 0,5-1 cm).
4. Machen Sie 1 L Färbung Lösung, während das Gel läuft: SYBR Gold verdünnt 1:10,000 in 0.5x TBE.
5. Wenn das Gel fertig ist (d. h. das untere Farbstoffband befindet sich in der Nähe der Unterseite des Gels), entfernen Sie vorsichtig das Gel von den Glasplatten, unter Notierung der Ausrichtung des Gels.
6. Legen Sie Gel in das Fach der Originalverpackung. Entfernen Sie den 0.5x TBE und ersetzen Sie ihn durch die Färbelösung aus Schritt 5.5. Stain Gel für 15 min. Die Färbezeit muss möglicherweise erhöht werden.
7. Legen Sie das Gel auf einen UV-Transilluminator, achten Sie darauf, das Gel nicht zu reißen und die oben erwähnte Ausrichtung beizubehalten (re-stain für zusätzliche Zeit, wenn Bänder der Leiter nicht klar zu sehen sind).
8. Bild das Gel, sobald die Färbung auf UV-Transilluminator mit einer Kamera abgeschlossen ist.
   1. Wenn ein besseres Bild erforderlich ist, verwenden Sie zunächst ein anderes Bildgebungsgerät als den UV-Transilluminator, um ein Bild des Gels zu erfassen, bevor sie die Bänder auf einem UV-Transilluminator als Bildgebung direkt auf dem UV-Transilluminator ausschneiden, wodurch die variable Färbung des Hintergrunds, wie in Abbildung 3A-Bdargestellt, verursacht. Bewegen Sie das Gel nicht zu oft, da es empfindlich ist und reißen kann.
9. Identifizieren und entfernen Sie das 150 bp-Band mit einer sauberen Rasierklinge und legen Sie es in ein sauberes 1,5 ml-Rohr. Schneiden Sie nicht das 130 bp-Band (Adapter-Dimer-Produkt) aus.
   1. Stellen Sie das Gel erneut ab, nachdem Sie die Slices, die das Bibliotheksprodukt enthalten, zu Dokumentationszwecken entfernt haben.
10. Drehen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen, die die Gelscheibe mit maximaler Geschwindigkeit von 30 s enthalten, um die Scheiben an der Unterseite jedes Rohres zu sammeln.
11. Verwenden Sie eine p200-Spitze für jede Probe, um die Gelscheibe in die kleinsten Teile zu zerkleinern. Werfen Sie jede Spitze in jede Röhre.
12. Fügen Sie jedem Rohr 300 L Elutionspuffer hinzu, wobei Sie darauf achten, Gelbits von der Seite des Rohres zu waschen und die p200-Spitze wieder anzubringen und die Spitze für jede Probe abzuwaschen.
13. Legen Sie die Eluproben in einen Schüttelinkubator, der auf 25 °C eingestellt ist. Über Nacht mit 1000 Umdrehungen schütteln. Entfernen Sie Rohre aus dem Inkubator und drehen Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min bei Raumtemperatur.
14. Übertragen Sie den Überstand, der das Bibliotheksprodukt enthält, auf eine 2 ml RNase freie 96-Wellplatte. Achten Sie darauf, kein Gel zu übertragen.
15. Fügen Sie jeder Probe 50 L Reinigungsperlen hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. Sofort 350 L Isopropanol hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Bei Raumtemperatur 10 Minuten mit Schaukeln bebrüten.
16. Puls-Spin-Platte zu Pellet Perlen und dann magnetisieren für 2 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
17. Fügen Sie 950 l 80% Ethanol hinzu. Inkubieren für 30 s. Entfernen Sie alle Überstand. Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Ethanol-Wähungen.
18. Trocknen Sie die Probe für 3 min. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, alle Restethanole zu entfernen, die sich am Boden jedes Brunnens sammeln (nicht mehr als einmal) und die Perlen nicht zu übertrocknen (übertrocknen führt zu Rissen des Perlenpellets).
19. Entfernen Sie alle Restflüssigkeit an der Unterseite des Brunnens. Entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen Ständer.
20. Setzen Sie das Pellet in 13 l Resuspensionspuffer wieder auf. Durch Pipette bis homogen mischen. 2 min inkubieren und dann für 3 min magnetisieren.
21. Übertragen Sie 12 L Überstand auf ein sauberes Rohr oder einen Brunnen der sauberen Platte für die anschließende Lagerung. Alle Proben über Nacht bei 4 °C oder -20 °C langfristig lagern.
22. Überprüfen Sie die Größe und Konzentration der Fragmente in jeder Bibliothek mit dem hochempfindlichen DNA-Test der Kapillarelektrophorese. Bestätigen Sie die Konzentration mit mehr als einer Methode.
    HINWEIS: Wir haben gelegentlich das Standard-Empfindlichkeitskit verwendet, um eine Überlastung der Kapillarelektrophorese zu vermeiden.

Mit dem hier gezeigten Verfahren haben wir Embryonen bei E7.5, E8.5 und E9.5 geerntet. Extraembryonale Strukturen wurden aus allen Embryonen entfernt und dann embryonen inszeniert, um 6-Stunden-Zeitintervalle zu lösen (Abbildung 1A-1B). Anhand der Prinzipkomponentenanalyse zur Gruppierung von Proben auf der Grundlage der Ähnlichkeit stellen wir fest, dass sich Proben nach Alter gruppieren, was die Variation als Ergebnis des embryonalen Alters und die Notwendigkeit eines sorgfältigen Matchings für biologische Replikationen hervorhebt (Abbildung 1C). Wir profilierten den pluripotenten Epiblast bei E7.5, Linie verfolgt vorwandernden und wandernden neuronalen Kammzellen mit Wnt1-Cre bei E8.5 und wandernden neuronalen Kammzellen mit Sox10-Cre bei E9.5 (Abbildung 1D). Hier ernten wir gezielt den kranialen Neuralkamm, indem wir den Embryo knapp über dem otischen Placode enthaupten. Ein Vergleich der beiden Cre-Treiber (Wnt1 und Sox10), die häufig zur Kennzeichnung von neuralen Kammzellen verwendet werden, bestätigt, dass sie unterschiedliche Populationen in frühen Mausembryonen markieren (Abbildung 1E). Gating-Strategien wurden verwendet, um lebende einzelne RFP-positive Zellen zu erhalten, die direkt in RNA-Extraktionslyselösung sortiert (siehe Materialtabelle) und bei -80 °C gespeichert wurden (Abbildung 1F). Es ist wichtig, zu verfolgen, wie viele Zellen aus jeder Probe geerntet wurden.

Die RNA-Isolierung wurde mit einer modifizierten Version des RNA-Kit-Protokolls durchgeführt. Insbesondere verwenden wir die Mini-RNA-Säulen, die bei 4 °C gespeichert werden sollen. Diese Säulen sind nützlich für die Eluierung in einem kleinen Volumen (11 l), um die höchstmögliche Konzentration von RNA aus Proben zu erhalten, in denen die Zelleingabe begrenzt ist. Aus dem gleichen Grund ist es wichtig, die gesamte wässrige Phase nach der Phenol-Chloroform-Extraktion zu erhalten. Langsames Pipettieren und Kippen des Rohres zur Seite während des Sammelns sind entscheidend, um die Ausbeute zu maximieren. In diesem Verfahren quantifizieren wir die RNA sowohl mit einem Spektralphotometer, um Informationen über Salz-Protein-Kontamination zu erhalten, als auch mit einer kapillaren Elektrophorese zur Messung der Konzentration (Abbildung 2). Die Spektralphotometer-Spur zeigt, dass RNA ohne kontaminierende Proteine isoliert wurde, aber einen hohen Salzgehalt hat (Abbildung 2A-2B). Idealerweise sollte das Verhältnis 260/280 1,8 und das Verhältnis 260/230 >2,0 betragen. Die mit dem Spektralphotometer gemessene Gesamtleistung der RNA stieg mit dem Alter zwischen E8.5-E9.5 nicht an. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Auflösung des Spektralphotometers nicht empfindlich genug ist, um Veränderungen der RNA-Konzentration aus der Anzahl der Zellen zu erkennen, die wir ernten, und wir empfehlen, die Konzentrationsinformationen aus der Kapillarelektrophorese zu verwenden (Abbildung 2C). Die Kapillarelektrophoresespur kann verwendet werden, um die Konzentration und Größe der RNA-Fragmente zu schätzen. Peaks <1000 Nukleotide deuten auf eine Verschlechterung hin. Die repräsentative Spur stimmt mit RNA überein, die nicht abgebaut wird. Spitzenwerte bei 2000 Nukleotiden und 5100 Nukleotiden sind 18s bzw. 28s rRNA. Die kleine RNA-Region befindet sich bei 150 Nukleotiden (Abbildung 2D).

Kleine RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem im Materialverzeichnisbeschriebenen kleinen Vorbereitungskit für RNA-Bibliotheken vorbereitet. Hier verwenden wir nur weniger als die Hälfte der RNA, die aus jeder Probe gewonnen wird (4 l der 11-L-Elution, 80-120 ng), die es ermöglicht, RNA-Sequenzierungsbibliotheken aus der verbleibenden RNA aus jeder Probe zu synthetisieren. Hier verdünnen wir die 3' und 5' kleinen RNA-Adapter 1/4, um die Menge der vorhandenen Adapter-Dimer zu senken und schlagen vor, dass die Adapterligations-, Bereinigungs- und Reverse-Transkriptionsschritte so weit wie möglich kontinuierlich durchgeführt werden. Wir haben 16 PCR-Zyklen verwendet, um die Bibliotheken zu verstärken und vorzuschlagen, dass die minimale Anzahl von PCR-Zyklen für jedes Experiment empirisch bestimmt werden. Durch das Abschließen überschüssiger PCR-Zyklen könnte man die Leseanzahl einer niedrig exprimierenden miRNA künstlich aufblasen.

Die Größenauswahl ist unerlässlich, um Bibliotheken von miRNAs und nicht Adapter-Dimern anzureichern, die in der Regel vorhanden sind. Die Bibliotheksproduktgröße (150 bp) und Adapterdmere (130 bp) sind sehr ähnlich. Die Gelextraktion wird verwendet, um die kleinen RNA-Sequenzierungsbibliotheken von den Adapterdimern weg zu isolieren (Abbildung 3). Ein Bild eines PAGE-Gels vor der Exzision zeigt, dass in jeder Probe eine Vielzahl von Produktgrößen vorhanden sind (Abbildung 3A). Es ist wichtig, eine Spur zwischen zwei beliebigen Proben oder einer Leiter, die auf das Gel geladen wird, offen zu lassen. Die Migrationsfront am unteren Rand des Gels ist leicht gekrümmt, was darauf hinweist, dass ein langsameres Laufen erforderlich sein kann, wenn das 150 bp-Band für alle Samples schwer zu unterscheiden ist. Dieses repräsentative Bild zeigt auch eine Fülle von 150 bp Produkt aus der höheren Konzentration der Positivkontroll-RNA (Gesamt-RNA aus dem Gehirn einer Ratte), die in die Bibliotheksvorbereitung ging im Vergleich zu dem, das in jede embryonale Probe ging. Die negative Kontrolle zeigt, dass die Reagenzien frei von kontaminierenden Nukleinsäurearten waren (Abbildung 3A). Die Exzision des 150 bp-Bandes sollte mit einer sauberen Rasierklinge erfolgen und der gesammelte Bereich ist in Abbildung 3Bdargestellt. Kapillarelektrophoresespuren vor und nach der Größenauswahl zeigen die dramatische Verbesserung der Reinheit des 150 bp Bibliotheksprodukts mit Gelreinigung (Abbildung 3C-3D). Es ist wichtig zu beachten, dass die Spuren in Abbildung 3C-3D Stichprobenspitzen haben, die höher sind als die Marker, was auf eine Überlastung hindeutet. In diesen Fällen kann die Größe der Fragmente genau sein, die Konzentration kann jedoch nicht. Die Quantifizierung kann durch Verdünnung der Bibliotheken in den Bereich der Marker oder mit alternativen Methoden erreicht werden. Wir finden einige Unterschiede zwischen alternativen Methoden der Bibliotheksquantifizierung und empfehlen, mehrere Methoden der Quantifizierung empirisch zu testen. Eine genaue Quantifizierung der Konzentration ist bei der Maximierung der Anzahl der zu sequenzierenden Proben unerlässlich. Bibliotheken werden für die Sequenzierung auf 1,3 pM verwässert und im Allgemeinen können überall zwischen 15 und 25 Samples gleichzeitig auf einem 150-Zyklus-Sequenzierungskit sequenziert werden, das 140 Millionen Lesevorgänge bietet. Dies führt zu etwa 5 Millionen Lesevorgängen pro Stichprobe. Im Allgemeinen liegen die Zuordnungsraten zwischen 60 und 80 %.

Abbildung 1: Ernte von Zellen aus Mausembryonen für die kleine RNA-Sequenzierung. (A) E8.5-Maus-Embryo, um die Entfernung des Dottersacks und der Sosches hervorzuheben, die zur Bestimmung des Stadiums des Embryos (B) verwendet werden, um die Stadien der Entwicklung des neuronalen Kamms zu erfassen (C) Prinzipielle Komponentenanalyse von Bibliotheken, die aus sortierten Neurokpfen-Kremmzellen des Wildtyps hergestellt wurden, die zeigen, dass Proben nach Alter gruppiert sind (D) Schematisch, das zeigt, wie Proben mit Wnt1-Cre bei E8.5 geerntet wurden. Label vorwandernde und wandernde neurale Kammzellen und Sox10-Cre bei E9.5, um nur wandernde neurale Kammzellen zu kennzeichnen (E) Prinzipialanalyse von Bibliotheken, die aus sortierten Wildtyp-Neuralkammzellen vorbereitet wurden, die Proben zeigen, die unabhängig vom Alter durch Cre-Driver gruppiert sind (F) Gating-Strategie zur Isolierung von RFP+ Neurokpfzellen aus E8.5- und E9.5-Embryonen mittels FACS-Sortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: RNA-Isolierung von E7.5-E9.5-Mausembryonen. (A) Repräsentative Spektralphotometer-Spur einer RNA-Isolierung aus dem jüngsten Stadium des Embryos, das wir dieses Protokoll angewendet haben. (B) Tabelle mit den repräsentativen Werten der RNA-Qualität, die aus dem Spektralphotometer gewonnen werden. (C) Beispiel für die RNA, die aus sortierten neuralen Kammzellen von Embryonen jeden Alters geerntet wird (D) Kapillarelektrophorese-Spur, die eine gute RNA-Qualität zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: miRNA-Bibliotheken vor und nach der Größenauswahl. (A) TBE-PAGE Gel mit repräsentativen kleinen RNA-Bibliotheken für vier Proben und Kontrollen vor und (B) nach 150 bp Bandexzision. Die Pfeile stellen das 150 bp-Band dar, das ausgeschnitten werden soll (C) Kapillarelektrophorese-Spur der kleinen RNA-Bibliothek vor und (D) nach Größenauswahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Entwicklungsprozesse können schnell voranschreiten, und Zellen durchlaufen viele sequenzielle Spezifikationen, so dass eine spezifischere Inszenierung als das weit verbreitete Halbtags-Inkrement erforderlich ist, um einen umfassenden Überblick über die miRNAs zu gewinnen, die zu frühen Schicksalsentscheidungen beitragen. Eine aktuelle Studie hat eine RNA-Sequenzierung von Theiler-Stadium-12-Embryonen durchgeführt, die von 3 bis 6 Sos¹¹reichen. Wir stellen fest, dass in diesem Zeitraum die neuralen Kammzellen spezifiziert werden (3 Soden des Alters), delaminat (4 Soes des Alters) und migrieren (5-6 Soden des Alters). Wir stellen auch fest, dass neben dem Cre-Treiber, der zur Abstammung von Spurenzellpopulationen verwendet wird, das Alter die größte Quelle für Variationen zwischen biologischen Proben ist und nur so abgestimmte Embryonen als Wiederholungen betrachtet werden sollten. Dies sollte auch beim Vergleich transgener Embryonen mit Wildtypkontrollen berücksichtigt werden.

Frühere Methoden zur Profilierung von miRNAs während der frühen Entwicklung haben zwischen 10-100 ng RNA-Eingang für die kleine RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung verwendet und mehrere Embryonen in einer Probe^13,14gepoolt. Wir demonstrieren DIE RNA-Isolation und Bibliotheksvorbereitung aus einem einzelnen E7.5-Embryo oder aus sortierten neuralen Kammzellen bei E8.5 und E9.5 unter Verwendung von ca. 100 ng gesamter RNA als Input. Bei der Trennung von Embryonen zum Sortieren sollte man darauf achten, die Dissoziation unter dem Mikroskop zu beobachten und die Reaktion zu löschen, um zu beobachten, wann einzelne Zellen erhalten werden. Wir stellen fest, dass die Dissoziation der Schädelregion von E8.5-E9.5 Embryonen mit sanfter manueller Pipettierung, wie im Protokoll beschrieben, fast augenblicklich erfolgt. Bei größeren Geweben und immer älterwerdenden Embryonen kann die Dissoziationszeit je nach dem Teil des embryonalen Embryos länger sein. Bei E7.5-E9.5-Embryonen sind Zellklumpen unter dem Mikroskop gut sichtbar und die Dissoziation sollte so lange fortgesetzt werden, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind. Einzelne Zellen sind in der Lösung sichtbar, wenn Sie den Fokus durch die Lösung in Ihrem Brunnen überall zwischen 5-10x einstellen. Frühere Methoden sortieren Zellen direkt in Lysepuffer für die RNA-Sequenzierung, um Massen-RNA aus einer geringen Anzahl von Zellen^{vorzubereiten 14}. Hier sortieren wir direkt in rna-Extraktionslyselösung, so dass RNA vor Beginn der Bibliotheksvorbereitung isoliert werden kann. Die Verwendung von Mini-Säulen mit 11 L Elutionsvolumen ermöglichte eine ausreichend hohe RNA-Konzentration, so dass eine einzelne RNA-Vorbereitung zwischen kleiner RNA und Bulk-RNA-Sequenzierung aufgeteilt werden konnte.

Eine aktuelle Einschränkung der meisten kleinen RNA-Sequenzierungsmethoden ist die PCR-Verstärkung der umgewandelten cDNA. Unsere Methode überwindet diese Einschränkung nicht, aber wir konnten die Anzahl der PCR-Zyklen von den empfohlenen 25-Maximum-Zyklen auf 16 Zyklen minimieren. Diese Verringerung der Amplifikation verringert die künstliche Amplifikationsverzerrung, die durch PCR eingeführt wird. Eine weitere Quelle der Verzerrung ist die Ligation von Adaptern, wo bekannt ist, dass bestimmte Sequenzen an den Enden von Adaptern und miRNAs zusammen mit einer größeren Effizienz als andere Sequenzen ligaten können. Um dies zu vermeiden, verfügen die in diesem Protokoll verwendeten Adapter über 4 zufällige Basen, die am Ende jedes Adapters integriert sind, um Verzerrungen bei Ligationsreaktionen zu verhindern. Darüber hinaus ist ein weiteres häufiges Problem die Menge an Adapterdimermern, die sich bilden, wenn der RNA-Eingang niedrig ist. Das Bibliotheksvorbereitungskit enthält Schritte zur Reduzierung der Adapterdimerbildung, z. B. Adapterinaktivierung und Perlenbereinigung, um überschüssige Adapter nach jeder Ligation zu entfernen. Wir haben auch die 3' und 5' 4N Adapter um 1/4 verdünnt, um die Menge an Adapter-Dimer zu reduzieren, die sich bilden kann. Wir fanden heraus, dass die Bandbreite von 130 bp erhöht wird, wenn sie nicht verdünnt wird, was es schwierig macht, von dem 150 bp-Band zu unterscheiden, das die gewünschten kleinen RNA-Bibliotheken auf einem Gel enthält.

Eine weitere aktuelle Herausforderung bei der Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken ist die genaue Quantifizierung des Produkts vor der Sequenzierung. Wir haben festgestellt, dass verschiedene Methoden unterschiedliche Ergebnisse auf der gleichen Bibliothek liefern. Wir schlagen vor, dass die Forscher mehrere Methoden der Quantifizierung verwenden, um eine genaue Schätzung der Konzentration zu erhalten.

Dieses Protokoll kann weit verbreitet auf genetische, Entwicklungsstudien oder andere Anwendungen angewendet werden, bei denen RNA aus einer geringen Anzahl von Zellen geerntet wird. Dieser Ansatz vereinfacht zeitliche Studien, indem das Zusammenwerden von Embryonen vermieden wird, und kann leicht sowohl auf nicht sortierte als auch auf sortierte Zellen angewendet werden.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Projekt wurde von der Andrew McDonough B+ Foundation und dem NIH (R01-HD099252, R01-HD098131) unterstützt.   R.J.P. ist CPRIT-Stipendiat in Der Krebsforschung (RR150106) und V-Stipendiat in der Krebsforschung (V Foundation). Die Autoren möchten auch den Cytometrie- und Zellsortierungskern am BCM für die Bereitstellung der für dieses Projekt erforderlichen Ausrüstung würdigen.