Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Zelluläre Organellen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER), bilden ein Netzwerk, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Diese hochgekrümmten Strukturen werden in verschiedene Formen gefaltet, um je nach zellulären Bedingungen ein dynamisches Netzwerk zu bilden. Die Visualisierung dieses Netzwerks zwischen Mitochondrien und ER wurde mit superauflösungsklarer Fluoreszenz-Bildgebung und Lichtmikroskopie versucht; Die begrenzte Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Membranen zwischen den Mitochondrien und ER im Detail zu beobachten. Transmissionselektronenmikroskopie bietet einen guten Membrankontrast und eine Nanometer-Auflösung für die Beobachtung von Zellorganellen; Bei der Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Struktur hochgekrümmter Organellen ist es jedoch außerordentlich zeitaufwändig. Daher beobachteten wir die Morphologie von Mitochondrien und ER mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) und Volumenelektronenmikroskopie-Techniken mit verbesserter Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung. Zur Beobachtung der 3D-Struktur wurden eine en bloc-Färbemethode, ultradünne serielle Schnitte (Arraytomographie) und Volumenelektronenmikroskopie angewendet. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination von CLEM und 3D-Elektronenmikroskopie vor, um detaillierte Strukturstudien von Mitochondrien und ER durchzuführen.

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) sind membrangebundene Zellorganellen. Ihre Verbindung ist für ihre Funktion notwendig, und Proteine, die mit ihrem Netzwerk zusammenhängen, wurden beschrieben¹. Der Abstand zwischen den Mitochondrien und ER wurde mit Hilfe der Lichtmikroskopie²als etwa 100 nm gemeldet; Jüngste Studien der Superresolution-Mikroskopie³ und der Elektronenmikroskopie (EM)⁴ haben jedoch ergeben, dass sie mit etwa 10-25 nm erheblich kleiner ist. Die in der Hochauflösenden Mikroskopie erreichte Auflösung ist niedriger als EM, und eine spezifische Kennzeichnung ist erforderlich. EM ist eine geeignete Technik, um einen ausreichend hochauflösenden Kontrast für Strukturstudien der Verbindungen zwischen Mitochondrien und ER zu erreichen. Ein Nachteil sind jedoch die begrenzten Z-Achsen-Informationen, da die dünnen Abschnitte für die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) etwa 60 nm oder dünner sein müssen. Für eine ausreichende EM-Z-Achsen-Bildgebung kann die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3DEM)⁵verwendet werden. Dies beinhaltet jedoch die Vorbereitung von Hunderten von dünnen seriellen Abschnitten ganzer Zellen, was eine sehr schwierige Arbeit ist, die nur wenige erfahrene Technologen gemeistert haben. Diese dünnen Abschnitte werden auf zerbrechlichen Formwaren-Film-beschichteten Ein-Loch-TEM-Gittern gesammelt. Wenn der Film auf einem Gurt bricht, ist eine serielle Bildgebung und Volumenrekonstruktion nicht möglich. Die serielle Block-Face-Scanning-Elektronenmikroskopie (SBEM) ist eine beliebte Technik für 3DEM, bei der zerstörerische En-Block-Sektionen in der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit einem Diamantmesser (Dik-SBEM) oder einem fokussierten Ionenstrahl (FIB-SEM) ^{verwendet werden. 6}. Da diese Techniken jedoch nicht in allen Einrichtungen verfügbar sind, schlagen wir arraytomography⁷ mit seriellem Schnitt und SEM vor. In der Arraytomographie werden mit einem Ultramikrotom geschnittene serielle Abschnitte auf einen Glasdeckel anstelle eines TEM-Gitters übertragen und mittels Lichtmikroskopie und SEM⁸visualisiert. Um das Signal für die Rückstreuelektronen-Bildgebung (BSE) zu verbessern, haben wir ein en bloc EM-Färbeprotokoll verwendet, das Osmiumtetroxid (OsO₄)-feste Zellen mit osmiophilem Thiocarbohydrazid (TCH)⁹verwendet, so dass wir Bilder ohne Doppelfärbung nach der Einbettung.

Zusätzlich wurde der mitochondriale Marker SCO1 (Cytochrom c Oxidase Assembly Protein 1)– Ascorbatperoxidase 2 (APEX2)¹⁰ molekulare Tags verwendet, um Mitochondrien auf EM-Ebene zu visualisieren. APEX2 ist ca. 28 kDa und wird aus Sojabohnen-Ascorbatperoxidase¹¹abgeleitet. Es wurde entwickelt, um die detaillierte Position spezifischer Proteine auf EM-Ebene auf die gleiche Weise zu zeigen, wie grüne fluoreszierende Protein-markierte Proteine in der Lichtmikroskopie verwendet werden. APEX2 wandelt 3,3' -Diaminobenzidin (DAB) in ein unlösliches osmiophiles Polymer an der Stelle des Tagsin Gegenwart des Cofaktors Wasserstoffperoxid (H2 O2 ) um. APEX2 kann als Alternative zur herkömmlichen Antikörperkennzeichnung in EM mit einer Proteinlokalisierung in der gesamten Zelltiefe verwendet werden. Mit anderen Worten, das APEX2-markierte Protein kann durch spezifische Osmisierung¹¹ ohne Immunogold-Etikettierung und Permeabilisierung nach Ultra-Kryosektion visualisiert werden. Meerrettichperoxidase (HRP) ist auch ein empfindliches Tag,das die H2 O2-abhängige Polymerisation von DAB in einen lokalisierten Niederschlag katalysiert und em-Kontrast nach der Behandlung mit OsO₄liefert. Die ER-Zielpeptidsequenz HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² wurde angewendet, um ER innerhalb einer ganzen Zelle zu visualisieren. Um unser Protokoll der Verwendung von genetischen Tags und En-Block-Färbung mit reduziertem Osmium und TCH (rOTO-Methode) unter Verwendung des Osmisierungseffekts gleichzeitig zu bewerten, verglichen wir den Membrankontrast mit und ohne die Verwendung jedes genetischen Tags in rOTO en bloc Färbung. Obwohl 3DEM mit Arraytomographie und DAB-Färbung mit APEX bzw. HRP für andere Zwecke verwendet wurden, ist unser Protokoll einzigartig, da wir Arraytomographie für 3DEM- und DAB-Färbung für Mitochondrien und ER-Kennzeichnung kombiniert haben. Insbesondere zeigten wir fünf Zellen mit und ohne APEX-markierte Gene im selben Abschnitt, die bei der Untersuchung der Wirkung der genetischen Veränderung auf Zellen halfen.

1. Zellkultur mit gemusterter Gitterkulturschale und Zelltransfektion mit SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmidvektor

1. Samen 1 x 10⁵ HEK293T Zellen, indem sie sie in 35-mm-Glasgitter-Boden-Kulturschalen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin.
2. Am Tag nach der Aussaat der Zellen, wenn sie auf 50%-60% Konfluenz angewachsen sind, führen Sie die Plasmids SCO1-APEX2¹⁰ und HRP-KDEL¹² mit Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Zellen ein (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 HRP-KDEL-Plasmid-DNA 0,5 g pro 3-L-Transfektionsreagenz).

2. Lichtmikroskopie von Zellen, die auf gemusterten Kulturgerichten wachsen, und DAB-Färbung für APEX2 und HRP

1. Entfernen Sie bei 16-24 h nach der Transfektion alle Kulturmedien und fügen Sie sofort 250 l warme (30-37 °C) Fixierungslösung (Tabelle1) durch sanfte Pipettierung hinzu. Entfernen Sie die Fixierlösung sofort und ersetzen Sie sie durch 1,5 ml frische Fixierungslösung. Auf Eis für 60 min bebrüten und dann dreimal für 10 min in 1 ml eiskaltem 0,1 M Natrium-Cakodylat-Puffer waschen (Tabelle 1).
   VORSICHT: Aldehyddämpfe sind extrem giftig. Führen Sie alle Arbeiten unter einer belüfteten Dunstabzugshaube durch.
2. 1 ml kalte (0-4 °C) 20 mM Glycinlösung hinzufügen und 10 min auf Eis brüten, gefolgt von drei Waschungen von je 5 min in 1 ml kaltem 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer.
3. Bereiten Sie eine frische 1x DAB-Lösung (3,33 ml 0,3 m Cacodylate-Lösung + 10 l 30% H₂O₂ + 5,67 ml kaltwasser + 1 ml 10x DAB-Lösung) vor.
4. Fügen Sie 500 l der frisch zubereiteten 1x DAB-Lösung (Schritt 2.3) hinzu und tauchen Sie ca. 5-45 min auf Eis ein, bis unter einem invertierten Lichtmikroskop ein hellbrauner Fleck sichtbar ist (Abbildung 1A).
5. Entfernen Sie die DAB-Lösung vorsichtig und spülen Sie sie dreimal mit 1 ml kaltem 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer für jeweils 10 min ab.
6. Verwenden Sie ein phasenkontrastinvertiertes Mikroskop (oder ein Hellfeld-Lichtmikroskop), um die DAB-Färbung bei einer Vergrößerung von 100x oder höher zu visualisieren. Verwenden Sie einen Markerstift, um den Unteren Rand des Glases zu markieren, in dem sich der Interessenbereich (ROI) befindet (Abbildung 1B,C).

3. Probenvorbereitung für den EM-Block

1. Führen Sie Zellkultur und DAB-Färbung wie in den Schritten 2.1-2.6 beschrieben.
2. Nachfix der Proben mit 1 ml von 2% reduziert OsO₄ für 1 h bei 4 °C.
   VORSICHT: OsO₄ Dämpfe sind hochgiftig. Führen Sie alle Arbeiten unter einer belüfteten Dunstabzugshaube durch.
3. Bereiten Sie in Schritt 3.2 eine neue TCH-Lösung (Tabelle 1) vor und durchlaufen Sie einen 0,22-mm-Filter.
   VORSICHT: TCH-Dämpfe sind hochgiftig. Führen Sie alle Arbeiten unter einer belüfteten Dunstabzugshaube durch.
4. Entfernen Sie das Fixativ und spülen Sie dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei Raumtemperatur (RT).
5. Legen Sie die Zellen in 1 ml zuvor vorbereitete und gefilterte TCH-Lösung für 20 min bei RT.
6. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT.
7. Setzen Sie die Zellen ein zweites Mal auf 1 ml 2% Osmiumtetroxid in destilliertem Wasser für 30 min bei RT aus.
8. Das Fixiermittel entfernen und dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT abspülen. 1 ml 1% Uranylacetat (wässrig) hinzufügen und bei 4 °C im Dunkeln über Nacht lassen.
9. Waschen Sie die Zellen dreimal in 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT.
10. Vorwärmende Walton-Blei-Aspartatlösung (Tabelle 1) im Ofen bei 60 °C für 30 min.
11. Färben Sie die Zellen mit Waltons Blei-Aspartat-Lösung, indem Sie 1 ml der vorgewärmten Blei-Aspartat-Lösung hinzufügen, und legen Sie sie dann 30 min bei 60 °C in einen Ofen.
12. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 min bei RT.
13. Inkubieren in einer abgestuften Reihe von 2-ml-Ethanol-Aliquots (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) für jeweils 20 min bei RT.
14. Das Ethanol dekantieren und 30 min in 1 ml 3:1 Ethanol:Low-Viskosität-Einbettungsmischmedium bei RT inkubieren.
15. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 1:1 Ethanol: Niedrigviskosität Einbettung smisch medium. 30 min bei RT inkubieren.
16. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 1:3 Ethanol: Niedrigviskosität Einbettung smisch medium. 30 min bei RT inkubieren.
17. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 100% niedrigviskose Einbettung Medium und inkubieren über Nacht.
18. Die Probe in eine 100% niedrigviskose Einbettungsmischung einbetten und 24 h bei 60 °C brüten.
19. Bereiten Sie 90-nm dicke Abschnitte mit einem Ultramikrotom vor.
20. Beobachten Sie das Netz unter TEM bei 200 kV.

4. SerielleS Teilen und Montieren auf indium-zinnoxidbeschichteten Abdeckungen für DIE SEM-Bildgebung

1. Substratvorbereitung
   1. Reinigen Sie Indium-Zinn-Oxid (ITO)-beschichtete Glasabdeckungen (22 mm x 22 mm) durch sanftes Rühren in Isopropanol für 30-60 s.
   2. Entfernen Sie die Deckellippen, abtropfen lassen Sie das überschüssige Isopropanol ab und lassen Sie es in einer staubfreien Umgebung bis zum Trocknen.
   3. Behandeln Sie die ITO-beschichteten Glasabdeckungen durch Glühenentladung mit einem Plasmalackfürst für 1 min.
      HINWEIS: Plasmaaktivierung verleiht der Substratoberfläche eine hydrophile Eigenschaft. Es erzeugt einen sehr dünnen Wasserfilm auf dem Substrat, um Faltenbildung in den Abschnitten zu verhindern, wenn der Abschnitt am Substrat befestigt ist.
   4. Setzen Sie die ITO-beschichteten Glasabdeckungen in den Substrathalter ein und legen Sie sie in das Messerboot.
2. Trimmen des Probenblocks und serielle Steilierung
   1. Legen Sie den Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotom ein und setzen Sie ihn in den Trimmblock.
   2. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das gesamte überschüssige Harz um die Zielposition herum zu schneiden (identifiziert in Schritt 2.6, Abbildung 1D-G). Die Form der Blockfläche sollte Trapez oder rechteckig sein. Die Vorder- und Hinterkante muss absolut parallel sein (Abbildung 1H,I).
   3. Legen Sie den Probenhalter auf den Arm des Ultramikrotom und legen Sie das Diamantmesser in den Messerhalter. Setzen Sie die ITO-Glasabdeckungen in den Bandträger ein und klemmen Sie den Träger mit dem Griff (Abbildung 1J). Stellen Sie den Bandträger in das Messerboot ein und füllen Sie das Messerboot mit gefiltertem destilliertem Wasser (Abbildung 1K).
   4. Stellen Sie die Trägerposition mit dem Schlitten des Messers ein, indem Sie den Griff des Halters vorsichtig drücken, um die Kante des ITO-Glases in der Nähe des Messers einzustellen (Abbildung 1L).
   5. Nach dem Schneiden des Abschnitts, stoppen Sie den Schnittprozess, und öffnen Sie langsam die Spannschraube des Rohres und entleeren Sie das Wasserboot (Durchflussrate von einem Tropfen Wasser pro Sekunde).
   6. Nach Abschluss des Band-Entnahmeprozesses das Substrat mit dem Griff der Spannvorrichtung entfernen und das Band trocknen (Abbildung 1M).

5. Bildgebung im SEM und Ausrichtung des SEM-Bildstapels

1. Montieren Sie den ITO-beschichteten Coverslip auf Aluminiumstummeln mit klebrigem Carbonband. Versiegeln Sie die Glasoberfläche und die Oberfläche im Stub mit klebrigem Carbonband, und beschichten Sie dann mit einer 10 nm dicken Kohlenstoffschicht (Abbildung 1N).
2. Beachten Sie den ITO-beschichteten Abdeckschlupf in einem Feldemissions-SEM bei einer niedrigen Beschleunigungsspannung von 5 kV und einem geeigneten Arbeitsabstand für die effiziente Sammlung von BSEs.
3. Importieren Sie die seriellen Bilder mit der Option "Virtueller Stack" in die Image J Software (Fiji)^13. Öffnen Sie eine neue TrakEM¹⁴, und importieren Sie den Bildstapel in TrakEM. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie das Ausrichten-Menü.
4. Wählen Sie dann den Bildbereich (vom ersten Bis zum letzten Bild) aus. Beenden Sie die automatische Ausrichtung, speichern Sie das ausgerichtete Dataset, und wählen Sie Export aus, um ein flaches Bild aus dem ausgewählten Bildbereich (vom ersten Bild bis zum letzten Bild) zu kompilieren. Speichern Sie schließlich die flachen Bilddaten im AVI-Format im Hauptmenü Bild J.
   HINWEIS: Ergänzender Film 1 und Ergänzungsfilm 2 zeigen den SEM-Bildstapel bzw. den zugeschnittenen Bildstapel an.

6. Segmentierung von Mitochondrien und ER aus seriellen Bildern

1. Starten Sie den 3dmod in DER IMOD¹⁵ Software und öffnen Sie Bilddateien.
2. Zeichnen Sie im ZaP-Fenster die Kontur der Mitochondrien und ER mit der Mittelmaustaste.
3. Um das segmentierte Volume zu visualisieren, öffnen Sie das Fenster Modellansicht (Ergänzender Film 3).

Abbildung 1 beschreibt den Zeitplan und den Workflow für dieses Protokoll. Das Protokoll benötigt 7 Tage; Abhängig von der Zeit, die für die SEM-Bildgebung aufgewendet wird, kann dies jedoch zunehmen. Bei der Zelltransfektion sollte die Konfluenz der Zellen so gesteuert werden, dass der Boden der gesamten Gitterplatte nicht abgedeckt wird (Abbildung 1A). Eine hohe Zelldichte könnte die Identifizierung der von Interesse sindden Zelle während der Lichtmikroskop- und EM-Beobachtung verhindern. Wir verwendeten genetisch markierte Plasmide, die APEX2 und HRP exprimierten, um effizient transfizierte Zellen unter den zahlreichen kultivierten Zellen in der Kulturschale auszuwählen. Wir kultivierten HEK293T-Zellen und bestätigten die Expression von SCO1-verknüpftem APEX2 (mitochondrialem Intermembranraum [IMS]) und HRP-konjugierten KDEL (ER) in kotransrefekierten Zellen. Unter der Lichtmikroskopie wurden APEX2-transfikierte Zellen mit einer braunen Farbe gefärbt, während Zellen ohne Transfektion ungefärbt blieben (Abbildung 1A und Abbildung 2). Dies ermöglichte die Identifizierung der transfizierten Zielzellen, die dann für die korrelative Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) verwendet wurden, mit DAB-Färbung in einer kultivierten Zellpopulation (Abbildung3D-F und Abbildung 4B). Es war hilfreich, den Glasboden zu markieren (Abbildung 1B,C), um es einfach zu machen, die Position der Zielzelle während des flachen Einbettungsschritts zu identifizieren (Abbildung 1E,F). Als die HEK293T-Zellen mit einem verbesserten "Doppelosmium"-Färbeprotokoll (rOTO) behandelt wurden, wurden ganze Zellen mit einer dunklen Farbe gefärbt (Abbildung 1D). Nachdem wir den gerasterten Deckelausstrich aus der Kulturschale entfernt hatten, identifizierten wir die Zielposition auf der Blockoberfläche unter einem Stereomikroskop (Abbildung 1G). Wir trimmten die Zellen im ROI in trapezförmiger Form, und die führenden und nachfolgenden Kanten wurden parallel gemacht (Abbildung 1H,I). Um Mitochondrien und ER-Netzwerkrekonstruktion enden zu können, haben wir ein großes Diamantmesser mit einem großen Wasserboot verwendet, um SCO1-APEX2 und HRP-KDEL-exzessierende HEK293T-Zellen seriell zu schneiden (Abbildung 1J-L). Serielle 90-nm dicke Bandprofile wurden erfolgreich am ITO-beschichteten Glasdeckel befestigt (Abbildung 1M), und die Oberfläche wurde zur Beobachtung über SEM mit 10 nm dickem Kohlenstoff beschichtet (Abbildung 1N).

SCO1-APEX2- und HRP-KDEL-Proteine erzeugen hochdichte elektronische Signale aus der DAB-Konvertierung, die in TEM (Abbildung 3) und SEM (Abbildung 4) nachweisbar sind. Der durch SCO1-APEX2 erzeugte dunkle Fleck wurde ausschließlich im IMS und nicht im Matrixraum von Mitochondrien beobachtet (Abbildung 3D). Kotransfikierte Zellen (die linke Zelle in Abbildung 3D,E) mit SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmiden drückten ein hochdichtes Elektronensignal in mitochondrialem IMS und ER aus; wir beobachteten jedoch keine ER-Färbung in Zellen, die nur mit SCO1-APEX2 transfiziert wurden (die rechte Zelle in Abbildung 3D,F). Für serielle Bilder mit SEM haben wir zunächst einen Überblick über das gesamte Arraybild mit dem BSE-Detektor über einen großen Bereich erstellt (Abbildung 4A). Zweitens wurde der ROI im ersten Abschnitt platziert und an alle anderen Abschnitte weitergegeben (Abbildung 4B). Schließlich visualisierten wir den ROI mit fünf Zielzellen mit 5-nm Bildpixeln (Abbildung 4C). Vergrößerte Bilder zeigten detaillierte subzelluläre Strukturen (Abbildung 4D) wie Golgi-Apparat, Mitochondrien, Kerne und ER. Die seriellen Bilder zeigten deutlich, dass ER-Mitochondrien-Kontakte auf verschiedenen Z-Ebenen auftraten (Supplemental Movie 2 und Supplemental Movie 3).

Abbildung 1 : S umfangreicher Vorbereitungsworkflow für SEM und TEM. (A) Eine Kulturschale mit gegitterten Coverlips wurde mit Zellen gesät und mit DAB gebeizt. (B,C) Nach der DAB-Färbung wurde ein Markerstift verwendet, um den Boden des Glases zu markieren, in dem sich die Zielzellen befanden. (D) Nach O_sO₄ Färbung werden die Zellen zu einer dunklen Farbe. (E,F) Polymerase-Kettenreaktions-Röhren (PCR) (oder jede Art von Einbettkapseln) wurden verwendet, um leicht einen EM-Block herzustellen, der die markierten Positionen enthielt. (E) Obere Ansicht. (F) Untere Ansicht. (G) Ein stereomikroskopisches Bild mit geringer Vergrößerung der Oberfläche eines EM-Blocks. (H) Der ROI befindet sich in der Mitte der flachen Oberfläche. (I) Ein Stereomikroskopmitatmitatsbild mit höherer Vergrößerung des rechteckigen ROI. (J) ITO-beschichtete Glasabdeckungen (weißes Sternchen) werden in den Bandträger (blauer Pfeil) eingeführt, und der Träger wird durch Drehen des Griffs im Uhrzeigersinn geklemmt. (K,L) Der Griff des Halters wird sorgfältig geschoben, und der Träger wird so eingestellt, dass die Kante der ITO-beschichteten Glasabdeckung durch Gleiten in der Nähe des Messers positioniert wird. (M) Die Bänder sind an den ITO-beschichteten Glasabdeckungen befestigt. (N) Die ITO-beschichteten Glasabdeckungen werden an den SEM-Stubs befestigt, und das Restglas wird mit klebrigem Carbonband versiegelt und mit einer 10-nm-Kohlenstoffgewindeschicht beschichtet. Weiße Sternchen zeigen den ITO-beschichteten Glasdeckel und schwarze Sternchen auf das Carbonband an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Invertiertes Phasenkontrastmikroskopiebild kultivierter HEK293T-Zellen, die mit DAB gefärbt sind. (A) Färbung von Zellen nur mit DAB (ohne O_sO₄ Färbung). Weiße Pfeile zeigen die unbefleckten Zellen und schwarze Pfeile dAB-gefärbte Zellen an. (B) Bild mit höherer Vergrößerung des ROI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : TEM-Bildgebung von HEK293T-Zellen mit dem gezielten mitochondrialen IMS (SCO1-APEX2) und ER (HRP-KDEL). (A-C) Untransfizierte HEK293T-Zellen, die die Doppelmembran von Mitochondrien (M) und endoplasmatischem Retikulum (ER) zeigen. (D-F) APEX2 und HRP katalysieren die Polymerisation von DAB in einen lokalen Niederschlag, der anschließend mit elektronendichtem OsO₄gefärbt wird. Ein dunkler Kontrast ist im mitochondrialen IMS (schwarze Pfeilspitze) und ER (schwarzer Pfeil) zu erkennen; Zellen, die nicht mit HRP-KDEL transfiziert wurden, weisen jedoch ungefärbten ER (weißer Pfeil) auf. Maßstabsbalken: 1 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Serielle SEM-Bildgebung von HEK293T-Zellen mit dem gezielten mitochondrialen IMS (SCO1-APEX2) und ER (HRP-KDEL). (A) Überblick über die mit dem BSE-Detektor beobachteten seriellen Abschnittsbänder. (B) Korrelation des Bildes mit geringer Vergrößerung (Einset) mit BSE-Bild mit hoher Vergrößerung (weiße gepunktete Linie zeigt den ROI von DAB-gefärbten Zellen an). (C) Hohe Vergrößerung der ROI-Zielzellen mit 5-nm Bildpixeln. (D,E) Ein dunkler Kontrast zeigt sich im mitochondrialen IMS und ER, aber nicht im Golgi-Apparat. (F-I) ER-Mitochondrienkontakte (weißer Pfeil) treten auf verschiedenen Z-Ebenen auf. N, Kern; M, Mitochondrien; ER, endoplasmatisches Retikulum; G, Golgi Apparat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Lösungsrezepte.

Ergänzender Film 1: SEM-Image-Stack. Fidschi¹³ mit TrakEM¹⁴ Software wurde verwendet, um 91 Bilder auszurichten. Der ursprüngliche ausgerichtete Datensatz ist 11 GB. Um die Größe des Stapels zu verkleinern, wurde ein geänderter und zugeschnittener Bildsatz verwendet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Ergänzender Film 2: Zugeschnittener Bildstapel. Um Mitochondrien, ER und ihre Kontaktseiten im Detail zu visualisieren, wurden Bilder aus dem ursprünglichen Datensatz (5 nm/Pixel) abgeschnitten. Maßstabsbalken: 1 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download.)

Ergänzender Film 3: 3D Rekonstruktion von Mitochondrien und ER. Für die 3D-Visualisierung wurde die Kontur von Mitochondrien und ER mit der Software IMOD¹⁵ segmentiert und visualisiert. Mitochondrien wurden als lange röhrenförmige Strukturen (rot) visualisiert, und die ER-Netzwerke (grün) zeigten ihre komplizierte Morphologie. Gelb stellte eine große Oberfläche der Kontaktfläche zwischen Mitochondrien und ER in verschiedenen Z-Ebenen dar. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Die Bestimmung der zellulären Lokalisierung bestimmter Proteine bei einer Nanometerauflösung mit EM ist entscheidend, um die zellulären Funktionen von Proteinen zu verstehen. Im Allgemeinen gibt es zwei Techniken, um die Lokalisation eines Zielproteins über EM zu untersuchen. Das eine ist die Immunogold-Technik, die seit 1960 in EM verwendet wird, und die andere ist eine Technik mit neu entwickelten genetisch kodierten Tags¹⁶. Herkömmliche Immunogold-Techniken haben antikörperkonjugierte Goldpartikel oder Quantenpunkte verwendet, um die Position des markierten Proteins zu zeigen. Aufgrund der Anforderung an hochwertige Antikörper und der Penetrationseffizienz von Antikörpern, die von Harz und Fixierung beeinflusst werden, ist diese Technik jedoch deutlich eingeschränkt¹⁷. Da die Immunogold-Etikettierung überwiegend auf die Oberfläche eines ultradünnen Abschnitts ohne en bloc-Metallfärbung und starke Osmiumfixierung beschränkt ist, ist diese Technik nicht direkt auf moderne 3DEM¹⁸anwendbar. Um aktuelle 3DEM-Methoden, einschließlich SBEM- und Array-Tomographie, mit Proteinkennzeichnung zu verwenden, haben wir genetisch codierte EM-Tags in diesem Protokoll verwendet. Genetisch codierte Tags erfordern keine Permeabilisierung, technisch anspruchsvolle Ultra-Kryosektionen und Immunfärbung einzelner Abschnitte, da sie vor der Fixierung an der Stelle des Interesses lokalisiert werden.

Die Verfahren zur Probenvorbereitung in 3DEM umfassen im Allgemeinen eine Kombination aus gängigen chemischen Fixierungs- und Schwermetallfärbeverfahren, da Zellen hauptsächlich aus C, H, O und N bestehen, so dass die Färbung mit Schwermetallen den Kontrast unter EM⁹ . Daher haben wir reduzierte Osmiumfixierung und Metallfärbung eingesetzt, um kontrast- und Leitfähigkeit für die serielle Bildgebung zu verbessern. Das Verfahren zur Färbung von Proben vor dem Schnitt, bekannt als en bloc Staining, wurde als wesentlicher Schritt für 3DEM-Methoden wie SBEM und FIB-SEM¹⁹gemeldet. Wir bestätigten, dass die en bloc-befleckten Zellen in unserem Protokoll einen klaren SCO1-APEX2- und HRP-KDEL EM-Kontrast ausschließlich im mitochondrialen IMS bzw. ER in TEM (Abbildung 3) zeigten. Darüber hinaus zeigten die SEM-Bilder aus 90-nm-Serienabschnitten einen deutlichen Kontrast in beiden Organellen (Abbildung 4). Insbesondere der verstärkte Kontrast durch en bloc Färbung war deutlich vom DAB-Signal zu unterscheiden, und der Kontrast und die Leitfähigkeit führten zu hochwertigen seriellen Bildern (Abbildung4). Darüber hinaus unterstützt dieser kontrastreiche die Erleichterung nachfolgender Aufgaben wie Ausrichtung und Segmentierung mit dreidimensionaler (3D) Bildsoftware.

In den letzten Jahren haben Volumenelektronenmikroskopietechniken (dik-SBEM, FIB-SEM und Arraytomographie) biologische Fragen beantwortet, die die Beobachtung eines großen Sichtfeldes und einer 3D-Ansicht erforderten. Dik-SBEM und FIB-SEM beinhalten keine physikalische Handhabung von Abschnitten, so dass der Zeitaufwand für die Ausrichtung von Bildern reduziert werden kann. Das Beispiel muss jedoch zerstört werden, um serielle Bilder zu erhalten, und das Sichtfeld ist kleiner als das der Arraytomographie. Serielle SEM-Bildgebung mittels Arraytomographie wird zunehmend als Alternative zum TEM-Serienschnitt eingesetzt, und der haupte Vorteil dieser Technik ist ihre zerstörungsfreie Art und ihr großes Sichtfeld. Im Gegensatz zu anderen 3DEM-Techniken wie dik-SBEM und FIB-SEM können Abschnitte auf einem Deckslip, einem ITO-beschichteten Coverslip, einem Siliziumwafer oder einem Band gelagert und wiederholt abgebildet werden⁷.

APEX2 ist einfach zu bedienen und kann eine breite Palette von Färbungen ohne spezielle Ausrüstung geben, im Gegensatz zu Mini Singlet Sauerstoffgenerator²⁰ oder fluoreszierende Protein²¹ Techniken, dAB-Fällung über eine Photooxidation zu erzeugen. Seine variable Anwendung wurde in mehreren Zellorganellen getestet, einschließlich Kern, Plasmamembran, Mitochondrienmatrix, mitochondriale Cristae, ER, Tubulin und Actin in COS 7 und HEK293T Zelle²². Es gibt jedoch einige Einschränkungen und mehrere Kontrollpunkte für die Verwendung von genetisch kodierten Markierungen in Elektronenmikroskopen. Die Expressionskonzentrationen der exogenen Gene sollten kontrolliert werden, um eine angemessene Färbung auf EM-Ebene zu erreichen, da die Expression des genetischen Tags zu hoch ist, es falsch-positive Signale auslösen und die Ultrastruktur der Zellen über Membranbruch stören kann. und subzelluläre Organelle Aggregation²³. Ein weiteres mögliches Problem ist die DAB-Überfärbung, die angeblich Unschärfen und Membranzerstörung verursacht²². Um die angemessene Expression von Genen zu gewährleisten, wurden DAB-gefärbte Zellen mit ungefärbten Zellen verglichen, die sowohl Lichtmikroskopie als auch EM verwenden (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus sollte der Fixierungsgrad gut reguliert werden, um sicherzustellen, dass die endogene Oxidasen vollständig inaktiv sind. Um Artefakte aus endogenen Oxidasen während der Verarbeitung zu verhindern, haben wir eine Monoschicht von Zellen anstelle von abgetrennten und pelletierten Zellen²⁴fixiert. Dies half auch, die von Interesse befindlichen Zellen zu identifizieren, als wir das DAB-Signal unter Lichtmikroskopie überprüften. Unsere Ergebnisse zeigen daher, dass die Färbung und Fixierung von Zellmonolayern für CLEM mit DAB-Färbung nützlich sind (Abbildung 2). Die seriellen Bilder mit Array-Tomographie und 3D-Modell zeigten, dass die ER-Mitochondrien-Kontaktseiten auf verschiedenen Z-Ebenen auftreten (Supplemental Movie 2 und Supplemental Movie 3). Das Bild erzeugt eine vollständige 3D-Visualisierung der mitochondrialen und ER-Netzwerke in ganzen Zellen (Supplemental Movie 1). Es legt nahe, dass eine 3D-Volumenanalyse für den quantitativen Vergleich von ER-Mitochondrien-Kontakten unerlässlich ist. Beim Studium der komplexen Netzwerke intrazellulärer Organellen ist dies eine außerordentlich nützliche Technik.

Zusammenfassend war dieses Protokoll eine effiziente Kombination von CLEM- und 3DEM-Techniken, die eine Ganzzelluntersuchung auf EM-Ebene ermöglichte. Bemerkenswert ist, dass zwei verschiedene Tags gleichzeitig und DAB-Signale in zwei verschiedenen Organellen in einer ganzen Zelle sichtbar waren. Darüber hinaus können markierte Zellen und nicht beschriftete Zellen im gleichen Abschnitt verglichen werden, da em groß flächige EM ist. In diesem Protokoll waren En-Bloc-Färbung und DAB-Signale von genetisch kodierten Tags nützlich, um die Wechselwirkung zwischen membranösen Organellen in ganzen Zellen zu untersuchen. Dies könnte eine geeignete Anwendung für großflächige EM sein, um andere zelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Forschung wurde durch das KBRI-Grundlagenforschungsprogramm durch das Korea Brain Research Institute unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (19-BR-01-08) und vom National Research Foundation of Korea (NRF) gefördert wird. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmide wurden freundlicherweise von Hyun-Woo Rhee (Seoul National University) zur Verfügung gestellt. TEM-Daten wurden in Brain Research Core Facilities in KBRI erfasst.