线粒体和内质视网膜成像由相关光和体积电子显微镜

我们提出了一个方案,研究线粒体和内质神经在全细胞的分布后,使用相关的光和体积电子显微镜,包括抗坏血蜡过氧化物酶2和马萝卜过氧化物酶染色后,同一部分中具有或没有靶基因的细胞的序列切片,并通过电子显微镜进行序列成像。

细胞细胞器,如线粒体和内质视网膜(ER),创建一个网络来执行各种功能。这些高度弯曲的结构被折叠成各种形状,形成一个动态网络,根据细胞条件。利用超高分辨率荧光成像和光显微镜,尝试对线粒体和ER之间的网络进行可视化;然而,有限的分辨率不足以详细观察线粒体和ER之间的膜。透射电子显微镜为细胞细胞器的观察提供了良好的膜对比度和纳米级分辨率;然而,在评估高度弯曲的细胞器的三维(3D)结构时,非常耗时。因此,我们利用增强的抗甲酰氨基甲酸酯过氧化物酶2和马萝卜过氧化物酶染色技术,通过相关的光电子显微镜(CLEM)和体积电子显微镜技术观察线粒体和ER的形态。应用了一种组染色方法、超薄序列切片(阵列断层扫描)和体积电子显微镜来观察三维结构。在此协议中,我们建议将CLEM和3D电子显微镜相结合,对线粒体和ER进行详细的结构研究。

线粒体和内质视网膜(ER)是膜结合的细胞器。它们之间的联系对于它们的功能是必要的,并且与其网络相关的蛋白质已经描述了1。线粒体和ER之间的距离已报告约100纳米使用光显微镜2;然而,最近的超分辨率显微镜3和电子显微镜(EM)4的研究表明,它相当小,在大约10-25纳米。超分辨率显微镜的分辨率低于EM,需要进行特定的贴标。EM是一种合适的技术,用于线粒体和ER之间的连接结构研究,实现足够高分辨率的对比度。然而,缺点是有限的z轴信息,因为薄部分必须大约60纳米或更薄的传统传输电子显微镜(TEM)。对于足够的EM z轴成像,可以使用三维电子显微镜(3DEM)5。然而,这涉及到整个细胞的数百个薄序列部分的制备,这是非常棘手的工作,只有少数熟练的技术人员已经掌握。这些薄部分被收集在易碎的圆锥膜涂层单孔TEM网格上。如果薄膜在一个梁上断裂,则无法进行序列成像和体积重建。串行块面扫描电子显微镜 (SBEM) 是 3DEM 的一种常用技术,它使用扫描电子显微镜 (SEM) 真空室内的破坏性组合切片,使用金刚石刀 (Dik-SBEM) 或聚焦电束 (FIB-SEM)^6.然而,由于这些技术并非在所有设施中都可用,我们建议阵列断层扫描⁷使用串行切片和 SEM。在阵列断层扫描中,使用超微缩的序列截取部分被转移到玻璃盖玻片上,而不是TEM网格,并通过光显微镜和SEM⁸进行可视化。为了增强背散射电子 (BSE) 成像的信号,我们使用了一个组合 EM 染色协议,该协议使用四氧化二氮(OsO 4) 固定细胞,其基质硫二氢化物 (TCH)9,使我们能够在不嵌入后双重染色。

此外,线粒体标记SCO1(细胞色素c氧化酶组装蛋白1)*抗坏药过氧化物酶2(APEX2)10分子标记用于在EM水平上可视化线粒体。APEX2约为28 kDa,来自大豆抗坏血球过氧化物^酶11。它被开发为显示特定蛋白质在EM水平的详细位置,就像绿色荧光蛋白标记蛋白在光显微镜中使用一样。APEX2在存在过氧化氢(H₂O₂)的情况下,将3,3' -二氨基苯甲酸(DAB)转换成标签部位的不溶性亲血性聚合物。APEX2 可用作 EM 中传统抗体标记的替代品,在整个细胞的深度进行蛋白质定位。换句话说,APEX2标记的蛋白质可以通过特定的^渗透11可视化,无需免疫金标记和超低温切片后的渗透。马萝卜过氧化物酶(HRP)也是一个敏感标签,催化H₂O₂依赖性聚化DAB成局部沉淀,提供EM对比度后处理与OsO_4。ER靶肽序列HRP-KDEL(裂化-白脂-葡-绿露)12应用于整个细胞内的ER可视化。为了评价我们使用遗传标记和组染色的协议,同时使用渗透效应,在rOTO群染色中比较了膜对比度,并且不使用每个遗传标记。 虽然具有阵列断层扫描和 DAB 染色的 3DEM 分别用于其他目的,但我们的协议是独一无二的,因为我们将 3DEM 阵列断层扫描和 DAB 染色相结合,用于线粒体和 ER 标记。具体来说,我们在同一部分展示了五个带有APEX标记基因和无APEX标记基因的细胞,这有助于研究基因改造对细胞的影响。

1. 具有SCO1-APEX2和HRP-KDEL质粒载体的带图案网格培养皿和细胞转染的细胞培养

1. 种子 1 x 10⁵ HEK293T 细胞,将它们放入 35 毫米玻璃网格底培养皿中,在 Dulbecco 的改性 Eagle 介质 (DMEM) 中,在 37°C 下含有 5% CO₂的加湿气氛中,辅以 10% 胎儿牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素。
2. 在细胞播种后的第二天,当细胞生长到50%-60%的汇合性时,根据制造商的说明(SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg | HRP-KDEL质粒DNA每3μL转染试剂0.5微克)。

2. 在图案培养皿上生长的细胞的光显微镜和APEX2和HRP的DAB染色

1. 在转染后16-24小时,去除所有培养基,并立即通过温和移液加入250μL的温热(30-37°C)固定溶液(表1)。立即取出固定溶液,并将其替换为 1.5 mL 的新鲜固定溶液。在冰上孵育60分钟,然后在1mL的冰冷0.1M钠卡科迪酸盐缓冲液中每次洗涤三次10分钟(表1)。
   注意:醛烟雾具有极强的毒性。在通风的通风通风罩下执行所有工作。
2. 加入1 mL的冷(0-4°C)20 mM甘氨酸溶液,在冰上孵育10分钟,然后三次每次5分钟的冷0.1M钠卡科迪酸盐缓冲液中各5分钟。
3. 准备新鲜的 1x DAB 溶液(3.33 mL 的 0.3M 卡科迪酸盐溶液 + 10 μL 的 30% H₂O₂ = 5.67 mL 冷水 = 1 mL 10x DAB 溶液)。
4. 加入500 μL的新鲜制备的1x DAB溶液(步骤2.3),在冰上孵育约5-45分钟,直到在倒置光显微镜下看到浅棕色污渍(图1A)。
5. 轻轻取出 DAB 溶液,用 1 mL 的冷 0.1 M 钠卡科迪酸盐缓冲液冲洗三次,每次 10 分钟。
6. 使用相对比倒置显微镜(或亮场光学显微镜)以 100 倍或更高的放大倍数可视化 DAB 染色。使用记号笔标记感兴趣区域 (ROI) 所在的玻璃底部(图 1B,C)。

3. EM 模块的样品制备

1. 执行细胞培养和DAB染色,如步骤2.1-2.6所述。
2. 在 4°C 下,用 1 mL 2% 的样品后固定后,OsO₄可降低 1 小时。
   注意:OsO₄烟雾是剧毒的。在通风的通风通风罩下执行所有工作。
3. 在步骤 3.2 期间准备新的 TCH 溶液 (表 1), 并通过 0.22 μm 滤波器。
   注意:TCH 烟雾是剧毒的。在通风的通风通风罩下执行所有工作。
4. 在室温 (RT) 下,用 1 mL 蒸馏水各冲洗 3 次,每次 5 分钟。
5. 在RT处将细胞置于先前制备和过滤的TCH溶液的1 mL中20分钟。
6. 在RT处用1 mL蒸馏水冲洗细胞三次,每次5分钟。
7. 在RT处,将细胞第二次暴露在1mL的2%的四氧化二甲酸二铵中30分钟。
8. 在RT处,用1 mL蒸馏水去除固定剂并冲洗三次,每次5分钟。 加入1 mL的1%醋酸尿酸酯(水),在黑暗中以4°C过夜。
9. 在RT处,在1mL蒸馏水中清洗细胞三次,每次5分钟。
10. 预加热沃尔顿的铅阿斯巴溶液(表1)在60°C的烤箱中30分钟。
11. 通过加入预加热的铅阿斯巴溶液1 mL,在60°C下放入烤箱30分钟,用沃尔顿的铅阿斯巴溶液染色。
12. 在RT处用1 mL蒸馏水冲洗细胞三次,每次5分钟。
13. 在分级系列的2-mL乙醇等分剂(50%,60%,70%,80%,90%,95%,100%,100%)中孵育在 RT 上各 20 分钟。
14. 在3:1乙醇的1mL中分30分钟孵育乙醇:低粘度嵌入混合物介质在RT。
15. 取出介质,加入1mL的1:1乙醇:低粘度嵌入混合物介质。在 RT 孵育 30 分钟。
16. 取出介质,加入1:3乙醇的1 mL:低粘度嵌入混合物介质。在 RT 孵育 30 分钟。
17. 取出介质,加入1mL的100%低粘度嵌入介质,并在一夜之间孵育。
18. 将样品嵌入100%低粘度嵌入混合物中,在60°C下孵育24小时。
19. 使用超微缩菌制备90纳米厚的截面。
20. 在 200 kV 下观察 TEM 下的电网。

4. 用于 SEM 成像的连续切片和安装在氧化钠涂层盖玻片上

1. 基底制剂
   1. 通过在异丙醇中轻轻搅拌 30-60 s,清洁氧化钠 (ITO) 涂层玻璃盖玻片 (22 mm x 22 mm)。
   2. 拆下盖玻片,排出多余的异丙醇,并在无尘环境中离开,直到干燥。
   3. 使用等离子涂布器处理 ITO 涂层玻璃盖唇 1 分钟。
      注: 等离子体激活在基板表面具有亲水特性。它在基材上产生非常薄的水膜,以防止当部分附着在基板上时,在部分形成皱纹。
   4. 将 ITO 涂层玻璃盖片插入基板支架,并放入刀艇中。
2. 修剪样品块和串行切片
   1. 将样品块插入超微缩体样品支架,并设置到修剪块中。
   2. 使用剃刀刀片将目标位置周围的所有多余的树脂修剪掉(在步骤 2.6 中确定,图 1D-G)。块面的形状应为梯形或矩形。前缘和后缘必须绝对平行 (图 1H, I)。
   3. 将样品架插入超微缩器的臂上,并将金刚石刀放在刀架中。将 ITO 玻璃盖唇插入带状托架,用手柄夹紧托架(图 1J)。将带状载体放入刀艇中,用过滤的蒸馏水填充刀艇(图1K)。
   4. 通过小心地按下支架的手柄,将 ITO 玻璃的边缘设置在靠近刀刃的位置(图 1L),通过刀的滑动调整托架位置。
   5. 切割截面后,停止切片过程,并缓慢打开管的夹紧螺钉并排空水船(每秒一滴水的流速)。
   6. 完成色带收集过程后,用夹紧装置的手柄拆下基板并擦干色带(图1M)。

5. SEM 中的成像和 SEM 图像堆栈的对齐

1. 将 ITO 涂层盖玻片安装在铝根上,并带有粘性碳胶带。用粘性碳胶带密封玻璃表面和孔片表面,然后涂上10纳米厚的碳层(图1N)。
2. 在低加速度电压为 5 kV 且适合有效收集 BSEs 的工作距离下,在场发射 SEM 中观察 ITO 涂层盖玻片。
3. 使用虚拟堆栈选项将串行映像导入映像 J 软件 (Fiji)^13。打开一个新的TrakEM14,并将图像堆栈导入TrakEM。单击鼠标右键并选择对齐菜单。
4. 然后选择图像范围(从第一个图像到最后一个图像)。完成自动对齐,保存对齐的数据集,然后选择导出以从所选图像范围(从第一个图像到最后一个图像)编译平面图像。最后,在 Image J 主菜单中以 AVI 格式保存平面图像数据。
   注:补充影片 1和补充影片 2分别显示 SEM 图像堆栈和裁剪图像堆栈。

6. 从序列图像分割线粒体和ER

1. 在 IMOD¹⁵软件中启动 3dmod 并打开图像文件。
2. 在 ZaP 窗口中,使用鼠标中键绘制线粒体和 ER 的轮廓。
3. 要可视化分段卷,打开模型视图窗口 (补充影片 3)。

图 1描述了此协议的计划和工作流。协议需要7天;但是,根据在 SEM 成像上花费的时间,这可能会增加。对于细胞转染,应控制细胞的汇合,以免覆盖整个网格板的底部(图1A)。高细胞密度可以阻止在光学显微镜和EM观察过程中识别感兴趣的细胞。我们使用表示APEX2和HRP的基因标记质粒在培养皿中的众多培养细胞中选择有效的转染细胞。我们培养了HEK293T细胞,并确认了SCO1链接APEX2(线粒体膜间空间[IMS])和HRP结合KDEL(ER)在共转染细胞中的表达。在光显微镜下,APEX2转染细胞被染成棕色,而没有转染的细胞则保持无色(图1A和图2)。这允许识别转染的目标细胞,然后用于相关的光电子显微镜(CLEM),使用DAB染色在培养细胞群(图3D-F和图4B)。标记玻璃底部(图1B,C)有助于在平面嵌入步骤(图1E,F)期间轻松识别目标单元的位置。当HEK293T细胞使用增强的"双阴"染色方案(rOTO)进行处理时,整个细胞被染成深色(图1D)。从培养皿中取出网格盖玻片后,在立体显微镜下确定了块表面上的目标位置(图1G)。我们以梯形形式修剪 ROI 中的细胞,前缘和后缘是平行的(图 1H,I)。为了实现线粒体和ER网络重建,我们用一把大金刚石刀与一艘大型水船串联地分割SCO1-APEX2和HRP-KDEL表达HEK293T细胞(图1J-L)。串行90纳米厚的带状部分被成功连接到ITO涂层玻璃盖玻片(图1M),表面涂有10纳米厚的碳,通过SEM(图1N)进行观察。

SCO1-APEX2和HRP-KDEL蛋白产生来自DAB转换的高密度电子信号,在TEM(图3)和SEM(图4)中可检测到。SCO1-APEX2产生的暗斑仅在国际监测系统中观察到,而不是线粒体的基质空间(图3D)。具有SCO1-APEX2和HRP-KDEL质粒的共转染细胞(图3D,E中的左细胞)在线粒体IMS和ER中表示高度密集的电子信号;然而,我们观察到只有SCO1-APEX2(图3D,F中的右细胞)才转染的细胞中没有ER染色。对于使用 SEM 的串行图像,首先,我们使用 BSE 探测器在大面积上创建了整个阵列图像的概览(图 4A)。其次,ROI 被放置在第一部分,并传播到所有其他部分 (图4B)。最后,我们可视化了包含 5 个 5 nm 图像像素的目标单元的 ROI(图 4C)。放大的图像揭示了详细的亚细胞结构(图4D),如高尔基仪器,线粒体,核和ER。串行图像清楚地显示,ER线粒体接触发生在不同的z平面上(补充电影2和补充电影3)。

图 1: S充足的准备工作流程用于 SEM 和 TEM。(A) 一个含有网格盖玻片的培养皿,用细胞播种,并涂上民建联的污渍。(B,C)在 DAB 染色后,使用标记笔标记目标细胞所在的玻璃底部。(D) O_sO₄染色后,细胞变成深色。(E,F)聚合酶链反应(PCR)管(或任何类型的嵌入胶囊)用于轻松制造含有标记位置的EM块。(E) 顶视图.(F) 底部视图。(G) EM 块表面的低倍率立体显微镜图像。(H) 投资回报率位于平面中间。(I) 矩形 ROI 的更高放大倍率立体显微镜图像。(J) ITO 涂层玻璃盖唇(白色星号)插入带状托架(蓝色箭头),并且通过顺时针转动手柄夹紧托架。(K,L)仔细观察支架的手柄,并通过滑动调整托架,使镀膜玻璃盖玻片的边缘靠近刀。(M) 丝带附着在ITO涂层的玻璃盖上。(N) ITO 涂层玻璃盖唇附在 SEM 存根上,残余玻璃用粘性碳胶带密封,并涂有 10 纳米碳线层。白色星号表示 ITO 涂层玻璃盖玻片,黑色星号表示碳胶带。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:涂有DAB的培养HEK293T细胞的倒置相位对比显微镜图像。(A) 仅用 DAB 染色(无 O_sO₄染色)的细胞染色。白色箭头表示未染色的单元格,黑色箭头表示 DAB 染色的单元格。(B) ROI 的放大倍率图像。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:显示目标线粒体IMS(SCO1-APEX2)和ER(HRP-KDEL)的HEK293T细胞的TEM成像。(A-C)未转染的HEK293T细胞,显示线粒体(M)和内质神经质(ER)的双膜。(D-F)APEX2和HRP催化DAB聚合成局部沉淀物,随后被电子密集的OsO4染色。线粒体IMS(黑色箭头)和ER(黑色箭头)中明显有暗反差;然而,未用HRP_KDEL转染的细胞表现出未染色的ER(白色箭头)。比例尺:1 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:显示目标线粒体IMS(SCO1-APEX2)和ER(HRP-KDEL)的HEK293T细胞的串行SEM成像。(A) 使用 BSE 探测器观察到的串行部分功能区概述。(B) 低放大率图像(内集)与高放大倍率 BSE 图像(白色虚线框表示 DAB 染色电池的 ROI)的相关性。(C) 具有 5 nm 图像像素的 ROI 目标单元的高放大倍率。(D,E)在线粒体IMS和ER中,暗反差很明显,但Golgi设备则不明显。(F-I)ER 线粒体触点(白色箭头)出现在不同的 z 平面上。N,核;M,线粒体;ER,内质视网膜;G,高尔基仪器。请点击此处查看此图的较大版本。

表 1:解决方案配方。

补充影片 1:SEM 图像堆栈。斐济¹³与 TrakEM¹⁴软件用于对齐 91 图像。原始对齐的数据集为 11 GB。为了缩小堆栈的大小,使用了调整大小和裁剪的图像集。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。

补充影片 2:裁剪的图像堆栈。为了详细可视化线粒体、ER 及其接触点,从原始数据集(5 nm/像素)裁剪图像。比例尺:1 μm。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。

补充电影3:线粒体和ER的3D重建。对于 3D 可视化,使用 IMOD¹⁵软件对线粒体和 ER 的轮廓进行了分割和可视化。线粒体被形象化为长管状结构(红色),ER网络(绿色)显示了其复杂的形态。黄色表示线粒体和ER之间不同z平面之间的大面积接触部位。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。

使用EM以纳米分辨率确定特定蛋白质的细胞定位对于了解蛋白质的细胞功能至关重要。通常,有两种技术可以研究通过EM定位靶蛋白。一种是免疫黄金技术,自1960年以来一直用于EM,另一种是使用最近开发的遗传编码^标签16的技术。传统的免疫金技术使用抗体结合的金颗粒或量子点来显示标记蛋白的位置。然而,由于对高质量抗体的要求和受树脂和固定性抗体影响的抗体的渗透效率,该技术受到很大^限制。具体来说,由于免疫金标签主要局限于超薄部分的表面,没有金属染色和强的氧化铝固定,这种技术并不直接适用于现代3DEM^18。为了使用最近的 3DEM 方法,包括 SBEM 和阵列断层扫描,带有蛋白质标记,我们在该协议中使用了基因编码的 EM 标记。基因编码的标签不需要渗透,技术上要求超低温切片,以及单个部分的免疫染色,因为它们在固定前定位到感兴趣的部位。

3DEM 中的样品制备程序通常包括常见化学固定和重金属染色方法的组合,因为细胞主要由 C、H、O 和 N 组成,需要用重金属染色才能获得 EM 9 下的对比度.因此,我们采用减少的氧化铝固定和金属染色,以提高对比度和导电性,用于串行成像。切片前染色样品的程序,称为"组染色",已报告为3DEM方法(如SBEM和FIB-SEM¹⁹⁾的必要步骤。我们确认,我们的协议中带有细胞的细胞在TEM(图3)中分别在线粒体IMS和ER中显示了清晰的SCO1-APEX2和HRP-KDEL EM对比度。此外,来自 90 nm 串行部分的 SEM 图像揭示了两个细胞器中的明显对比(图 4)。值得注意的是,通过包围染色增强的对比度与DAB信号有明显区别,对比度和电导率产生了高质量的串行图像(图4)。此外,这种高对比度有助于简化后续任务,如使用三维 (3D) 图像软件进行对齐和分割。

近年来,体积电子显微镜技术(dik-SBEM、FIB-SEM和阵列断层扫描)回答了需要观察大视场和3D视图的生物问题。Dik-SBEM 和 FIB-SEM 不涉及截面的物理处理,因此可以减少图像对齐的耗时。但是,必须销毁样本才能获得串行图像,并且视野比阵列断层扫描的字段小。使用阵列断层扫描的串行 SEM 成像越来越多地用作 TEM 串行切片的替代方法,该技术的主要优点是其无损方式和大视场。与其他 3DEM 技术(如 dik-SBEM 和 FIB-SEM)不同,部分可以存储在盖玻片、ITO 涂层盖玻片、硅晶圆或胶带上,并可以重复成像⁷。

APEX2 易于使用,无需特殊设备即可提供广泛的染色密度,与微型单氧发生器²⁰或荧光蛋白²¹技术不同,该技术通过光氧化产生 DAB 沉淀。其可变应用已在多个细胞细胞器中进行了测试,包括细胞核、等离子膜、线粒体基质、线粒体远光、ER、图布林和ACTin在COS 7和HEK293T^细胞22中。然而,在电子显微图中使用基因编码标记有一些限制和几个检查点。外源基因的表达水平应加以控制,以便在EM水平上达到合理的染色,因为如果遗传标记的表达过高,则可能诱发假阳性信号,并通过膜破裂干扰细胞的超微结构。和亚细胞细胞器^聚集23。另一个可能的问题是DAB过度染色,据报道,它会导致模糊和膜^破坏22。为了确保基因的适当表达,使用光显微镜和EM(图2和图3)将DAB染色细胞与未染色细胞进行比较。此外,应很好地调节固定水平,以确保内源性氧化酶完全处于非活性状态。为了防止任何伪影在加工过程中产生内源性氧化酶,我们修复了细胞的单层,而不是使用分离和颗粒^细胞24。当我们在光显微镜下检查 DAB 信号时,这也有助于识别感兴趣的细胞。因此,我们的结果表明,使用DAB染色的细胞单层的染色和固定对CLEM是有用的(图2)。具有阵列断层扫描和 3D 模型的串行图像显示 ER_线粒体接触位出现在不同的 z 平面上(补充影片 2和补充影片 3)。图像生成整个细胞中的线粒体和 ER 网络的完整 3D 可视化(补充影片 1)。研究表明,3D体积分析对于ER-线粒体接触体的定量比较至关重要。当研究细胞内细胞器的复杂网络时,这是一项非常有用的技术。

总之,该协议是CLEM和3DEM技术的有效组合,允许全细胞在EM级调查。值得注意的是,两个不同的标签同时和DAB信号在两个不同的细胞器可见在整个细胞。此外,由于大规模EM,可以比较同一部分的标记单元格和未标记的单元格。在该协议中,来自基因编码标签的成群染色和DAB信号有助于研究整细胞中膜细胞器之间的相互作用。这可能是一个合适的应用程序,用于大规模EM来研究其他细胞相互作用。

作者没有什么可透露的。

这项研究得到了KBRI基础研究计划的支持,该计划由韩国脑研究所资助,由科学和ICT部(19-BR-01-08)和韩国国家研究基金会(NRF)资助,由韩国政府(MSIT)资助(NO.2019R1A2C1010634. SCO1-APEX2和HRP-KDEL质粒由玄武瑞(首尔国立大学)提供。TEM数据是在KBRI的大脑研究核心设施获得的。