Ein DMS-Monitor (SGM) für Ventil klaffen Dauermessungen in Muscheln Muscheln als Reaktion auf Hypoxie Labor induzierte Diel-Radfahren und pH-Wert

Verständnis der Verhaltensreaktionen von zweischaligen Aussetzung-Zubringer zu Umgebungsvariablen wie gelöster Sauerstoff, kann einige Ökosystemprozesse erklären. Wir haben einen kostengünstige, Labor-basierte, DMS-Monitor (SGM) Ventil Gape Antworten von Austern, Crassostrea Virginica, Messen, Diel Radfahren Hypoxie und zyklischen pH entwickelt.

Ein preiswerte, Labor-basierte DMS Ventil Gape Monitor (SGM) wurde entwickelt, um das Ventil Gape Verhalten von Muscheln als Reaktion auf Hypoxie Diel-Radfahren zu überwachen. Eine Wheatstone-Brücke wurde mit Dehnungsmessstreifen verbunden, die die Schalen der Austern (Crassostrea Virginica) zugeordnet wurden. Die aufgezeichneten Signale erlaubt für das Öffnen und Schließen der Muscheln, kontinuierlich über aufgezeichnet werden jeweils zweitägigen Perioden der experimentell induzierten Diel Radfahren Hypoxie und Diel Radfahren Veränderung des pH-Wertes. Hier wir beschreiben ein Protokoll für eine kostengünstige DMS-Monitor zu entwickeln und in einem Laborexperiment Beispiel beschreiben, wie wir es verwendet, um das Ventil Gape Verhalten Messen Eastern Austern (C. Virginica), als Reaktion auf Hypoxie Diel-Radfahren und zyklische Veränderungen des pH-Wertes. Ventil Gape auf Austern ausgesetzt zyklischen schweren hypoxischen (0,6 mg/L) gemessen wurde aufgelöst sauerstoffbedingungen mit und ohne zyklische Veränderungen im pH-Wert, zyklische milde Hypoxie (1,7 mg/L) und Inklusieve (7,3 mg/L) Bedingungen. Wir zeigen, dass wenn Austern wiederholte Diel Zyklen begegnen, sie schnell ihre Schalen als Reaktion auf schwere Hypoxie schließen und mit einer zeitlichen Verzögerung zur Milde Hypoxie schließen. Wenn normoxiezustand wiederhergestellt wird, öffnen sie schnell wieder. Austern reagierte nicht auf zyklische pH-Bedingungen Diel Radfahren schwere Hypoxie überlagert. Bei reduzierten sauerstoffbedingungen mehr als ein Drittel der Austern gleichzeitig geschlossen. Wir zeigen, dass Austern auf Diel Radfahren Hypoxie reagieren, die berücksichtigt werden müssen bei der Beurteilung des Verhaltens der Muscheln zu Sauerstoff aufgelöst. Das Ventil SGM kann verwendet werden, um Antworten von Muscheln auf Änderungen an gelöstem Sauerstoff oder Verunreinigungen zu beurteilen. Dichtungstechniken für bessere Abdichtung brauchen Ventil Gape Dehnungsmessstreifen aus Meerwasser weitere Verbesserungen erhöhen die Lebensdauer der Sensoren.

Hypoxie, d.h. aufgelöst Sauerstoffkonzentrationen [] ausreichend niedrige um sich negativ auf biologische und ökologische Prozesse aber oft funktionell definiert als [tun] < 2 mg / L¹und Sauerstoffmangel (funktional definiert als [tun] 0,0-0,2 mg/L) treten immer häufiger und stark in der Welt Küstengewässer, Flussmündungen und die Tiefen des Ozeans^2,3 auf und sind oft verschärft durch die zunehmende Eutrophierung^4,5. Mit areal in zunehmendem Maße von Hypoxie und Anoxie Makrofauna negativ beeinflusst und verlieren Lebensraum Umfang und Lebensraumqualität. Der Klimawandel wird voraussichtlich Hypoxie und Anoxie⁶verschlechtern.

In vielen geschichtete, Nährstoff angereicherte Flussmündungen wie Chesapeake Bay, USA saisonal anhaltende Hypoxie kann sich durchsetzen und Jahr für Jahr²auftreten kann. Darüber hinaus Diel-Radfahren von Hypoxie ist häufig in Flussmündungen wie der Chesapeake Bay und an anderen Orten und tritt spät während der Nacht oder den frühen Morgenstunden in der Sommer-^7,-⁸.

Die meisten Studien konzentrierten sich auf die Wirkung der Dauerbelastung von Organismen zu niedrigen [tun] und auf ihre Toleranz gegenüber Hypoxie und Anoxie^{9,10,11,12,13,14} . Darüber hinaus haben Studien der großen Verschiebung der Artenzusammensetzung Distributionen, Häufigkeiten und Arten als Reaktion auf Erweiterte niedrig [tun]^4,15angeschaut. Oft Arten, die sehr empfindlich auf niedrige in Massen sterben [],¹⁶ verlagert die übrigen Arten, eine jüngere, kleinere, kurzlebige Fauna wie zum Beispiel auf der Louisiana-Texas Regal Ökosystem⁴gefunden.

Verhaltensänderungen in der Regel vorausgehen Gemeinschaft Zusammenbruch¹⁷ und Studien haben berichtet, auf Verhaltensreaktionen von Organismen auf Erweiterte niedrig [tun]^{4,16,17,18,19 ,20,21,22,23,24,25}. Diese Studien jedoch konzentrieren nicht auf den Antworten von Organismen Diel-cycling Belichtungen von Hypoxie und dem schwankenden Charakter [tun] Verfügbarkeit in Flussmündungen.

Diel-Radfahren Hypoxie in seichten Flussmündungen erhielt Sensibilisierung als Studien zu [tun] mehr überwachen häufig im Laufe der Tage mit Sonden in Flussmündungen^16,26. Wasser kann für Stunden am Ende der Nacht oder am frühen Morgenstunden im Sommer hypoxischen bleiben wenn es keine Photosynthese Sauerstoff erzeugenden während der Nacht aber hohe Sauerstoff verbrauchenden gibt aerobe Atmung^7,16. Ferner wurde festgestellt, dass die Gezeiten die Diel beeinflusst Radfahren niedrig-Bedingungen mit den extremen Minima beobachtet, wenn Ebbe fiel mit dem Ende der Nacht²⁷. Erst nach mehreren Stunden der Hypoxie [tut] normoxiezustand^7,16,28 im täglichen Zyklus zurückkommen.

Bestimmen die Verhaltensreaktion C. Virginica Diel Radfahren Hypoxie und pH-Wert wir überwacht das Öffnen und Schließen der Ventile von Austern ans Labor induzierte Diel Radfahren [tun] und zyklischen pH. Gape Antworten von Muscheln wurden zur ungünstigen Umweltbedingungen erkennen. Ventil-Schließungen von Muscheln als Reaktion auf Verunreinigungen^29,30,31, giftige Algen^32,33,34, thermische Verunreinigung^{35,36 , 37}, Essen Quantität verringern^38,39,40, Fütterung Regime^39,41, auftauchen^37,42, Photoperiode^{43 , 44}, pH^45,46, und kombinierte pH und gelösten Sauerstoff⁴⁷ wurden gemessen. Gape Techniken haben, direkte Beobachtungen^48,49,13, kontinuierliche Messungen mit Reed-Schalter und Magnete (Dreissena Monitor)⁵⁰oder faseroptischen Sensoren beispielsweise enthalten. ⁵¹ , die klares Wasser benötigen. Darüber hinaus wurden Magnet und Magnetfeld Stärke-Hall-Sensoren zur Muschel Gape Winkel^52,53,54,55, und eine hochfrequente elektromagnetische Induktionssystem studieren dass die unterschiedlichen Distanz zwischen zwei elektrischen Spulen, die auf den Ventilen geklebt werden bislang^56,57,58,59verwendet. Eine Hochspannungsquelle ist erforderlich für die elektromagnetische Induktionssystem und macht hat an beiden Seiten der Schale⁵²geliefert werden. Dieses System ist auch als "MOSSELMONITOR" (http://mosselmonitor.nl/) im Handel erhältlich.

Auf einem engen Forschungsbudget wir einen kostengünstige DMS-Monitor (SGM) kontinuierlich zu Auster Gape Messen über Labor-induzierte Diel gebaut [tun] Radfahren und pH unter schlechten Sichtverhältnissen. Unser System ist auch viel einfacher als konkurrierende Systeme, so dass viele Tiere während eines Experiments instrumentiert werden. Wir wollten herausfinden, die Verhaltensreaktionen von C. Virginica , Diel Radfahren schwere ([] = 0,6 mg/L) Hypoxie mit Kontrolle pH (pH = 7,8) und Radsport pH (pH = 7,8-7.0) bzw. und Gape Antworten zu Mild ([] = 1,7 mg/L) Hypoxie. Darüber hinaus wollten wir um festzustellen, ob Austern in der Lage sind, auf Veränderungen schnell reagieren, [] über die Diel Zyklus und wie sie reagieren, wenn normoxiezustand nach einem hypoxischen Event kehrt zurück. Vielleicht sind Austern optimal angepasst an die stark schwankenden Umgebung, die in vielen Flussmündungen^16,27 gefunden wird, wo sie leben. Während komplexer Ventil Gape Monitore zur Verfügung stehen, bietet der SGM eine preiswerte Technik, die Dauermessungen Ventil klaffen in den Gewässern auch bei schlechten Sichtverhältnissen ermöglicht.

Abbildung 1. Wheatstone-Brücke für den Ventil Gape Apparat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die DMS-Sensoren zur Überwachung von zweischaligen Gape eingesetzt sind resistive Filme in einem Mäander-Muster auf einem Polyimid sichern. Geringe Mengen an Stamm modulieren den Widerstand des Sensors. Die Muscheln beugt DMS, wenn es klafft verursacht eine Änderung in der Widerstand des Sensors. Wir Beschäftigten eine Abgleich, ausgewogene, Wheatstone-Brücke für jeden zweischaligen Kanal, wie in Abbildung 1 dargestellt, um den Wandel im Widerstand des Sensors messen. Die Wheatstone-Brücke ist durch das Potentiometer ermöglicht eine relativ hohe Verstärkung durch den Datenlogger eingesetzt werden wwww. Eine Wheatstone-Brücke ist eine Standardmethode für die präzise Messung einen unbekannten Widerstand Verhältnis zu einem bekannten Widerstand standard und ein Voltmeter. Die Geschichte dieser uralten Technik ist in Ekelof (2001)⁶⁰diskutiert. Wir haben 12 Kanäle, jeweils mit eigenem Wheatstone-Brücke und Abgleich Potentiometer in DMS-Monitor (SGM) Einheit integriert.

1. Bau der Wheatstone-Brücke für das Ventil Gape Gerät

Hinweis: Die DMS ist nominell 1000 Ω, also in vollem Umfang auszugleichen und null, die Brücke, alle Komponenten sollte 1000 Ω.

1. Wie in Abbildung 1drehen Lot zwei 1 kΩ Präzisionswiderstände zueinander und dann zu einem ~ 976 Ω Widerstand und eine 100 Ω 10 Potentiometer. Das typische DMS ist ein paar Ω aus der 1000 Ω nominal, nur dieser Widerstand muss angepasst werden. Verwenden Sie zu diesem Zweck einen festen 976 Ω Widerstand und ein einstellbarer Widerstand (10 drehen Potentiometer).
2. Bringen Sie einseitig die Variable Arm und eine Seite des 1 kΩ Widerstand an einem Anschluss der zweischaligen DMS zuordnen, wie in Abbildung 1dargestellt.
3. Legen Sie der Ober- und der Unterseite der Brücke auf ein Netzteil zu Bias Strom an der Brücke, wie in Abbildung 1dargestellt.
4. Legen Sie die Mittelpunkte der Brücke auf die Vorverstärker und Daten-Recorder, wie in Abbildung 1dargestellt. Dies wird die zweischalige Antwort aufzeichnen, wie seine Gape Bewegung den Widerstand des DMS moduliert.
5. Nachdem die zweischaligen DMS befestigt ist, null die Brücke durch die Anpassung der 10 Potentiometer drehen, bis die Spannung am Eingang Daten Recorder gleich NULL ist. Verwenden Sie eine Separate BNC-Stecker und eine Hand statt Voltmeter für diesen Zweck.
   Hinweis: Die Ausgabe Nulling bedeutet, dass sehr hohe Gewinne mit der Data Recorder verwendet werden können, ohne Sättigung der Eingabe ermöglicht sehr präzise Spannungen (Gape Antwort) gemessen werden.
   Hinweis: Unsere Mehrkanal-Setup verwendet diskrete Bauelemente Hand gelötet auf ein standard Stück Elektronik "Perf-Board". Dies könnte leicht auf einer sehr preiswerten Platine mit wenig zusätzlichen Aufwand formalisiert werden.

2. allgemeine Einstellung für Diel-Cycling Hypoxie und zyklisch pH

1. Denken Sie Austern mit bekannten niedrigen Krankheit Prävalenz⁶¹ 75 L Aquarien unter 14 h Licht: 10 h dunkel Photoperiode, 7 Tage pro Woche⁴⁸und Expose fand sie zyklische Veränderungen in [tun] imitiert Diel Radfahren Hypoxie als in Natur^{7, 8}. während 14 h Licht simulieren der Lichtverhältnisse an einem sonnigen Tag in 2 m Tiefe in Rhode River, Maryland-⁶¹.
2. Diel-Radfahren Hypoxie und zyklischen pH-Wert im Labor für langfristige Experimente wie im Detail von Burrell Et Al. beschrieben einrichten (2015) ⁴⁹. manipulieren [tun] und pH-Wert in jedem Aquarium und halten auf vorher festgelegten Ebenen zu allen Zeiten. Zur Vermeidung von Ventil Schließung wegen Essen Einschränkung fügen Sie Phytoplankton⁶² der Aquarien hinzu. Jede mögliche Aufnahme von Algen Zersetzung durch die Regelung [tun] in jedes Aquarium kompensieren.

(3) zweischaligen Akklimatisierung

1. Akklimatisieren Sie Austern, Diel Radfahren Hypoxie für ungefähr eine Woche bevor Sie gaffen Experimente durchführen.

4. Einrichten von Diel Radfahren Hypoxie Plateau Phasen

Abbildung 2 . [Tun] wurde experimentell manipuliert jeden Tag um Diel Radsport Hypoxie generieren. Hier sind 2 aufeinanderfolgende Diel Zyklen gezeigt, über welche Gape Messungen waren. Diel Zyklus enthält vier Phasen [tun]: ein = Übersättigung (SS), b = normoxiezustand nach Übersättigung, C = niedrige Plateau (LP), d = normoxiezustand nach niedrigen Plateau. Für die Low-Hochebene, schwere Hypoxie ([] = 0,6 mg/L) mit Steuerung oder Radsport pH-Wert wird mit einer dicken schwarzen Linie, milde Hypoxie ([] = 1,7 mg/L) mit Radfahren pH mit eine dünne graue Linie und normoxiezustand ([] = 7,3 mg/L) mit einer gestrichelten Linie. Graue Kästchen zeigen 10-h Dunkele Abständen über zwei Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1. Um Diel Radsport Hypoxie erstellen, anpassen [tun] im Laufe eines Tages in vier aufeinander folgenden Phasen wo [tun] ist konstant gehalten: Übersättigung 2 h, 6 h normoxiezustand nach Übersättigung, 4 h niedrige Plateau (normoxiezustand bei den Kontrollen) und 2 h normoxiezustand nach den niedrigen plateauphasen.
2. Während der niedrigen Plateauphase konstant zu halten die Inklusieve Behandlung [DO] 7,3 mg/L, die milde Hypoxie Behandlung konstant bei [tun] von 1,7 mg/L und die schweren Hypoxie Behandlungen Konstante [DO] von 0,6 mg/L.
3. Laufen Sie für schwere Hypoxie zwei pH-Behandlungen während der niedrigen Plateau, d. h. schwere Hypoxie mit Kontrolle pH, in dem der pH-Wert auf 7,8 gehalten wird, und schwere Hypoxie mit zyklischen pH wo ist der pH-Wert von 7,8 auf 7.0 bei niedrigen Plateau radelte. Führen Sie die milde Hypoxie Behandlung mit zyklischen pH wo pH-Wert von 7,8 auf 7.0 radelte. Führen Sie eine zweite milde Hypoxie Behandlung mit konstanter pH-Wert, falls gewünscht.

5. ramping Up/Down [tun] zwischen Plateau Stufen

1. Planen Sie die Rampe nach oben oder unten [tun] zwischen den vier ständigen Phasen, jeweils 2 h zu nehmen, außer für die Rampe nach unten von normoxiezustand nach Übersättigung, die niedrige Plateau-Phase, die 3 h. oft stattfindet, Hypoxie gefunden worden ist, zu spät in der Nacht oder am frühen Morgenstunden in der Sommer^7,8; So halten Sie die niedrigen Plateau-Phase in der Dunkelheit sowie die Perioden Rampen drauf oder bis daraus eine Gesamtlänge von Dunkelheit von 10 h.
2. Wiederholen Sie Diel Radfahren Hypoxie 4-5 Tage ein Woche⁶¹.
3. Fügen Sie Austern mit Sensoren in der Ramp-Up Phase vor Übersättigung hinzu und entfernen Sie sie, nachdem Sie geschlossen, zwei Tage später so dass sie zwei komplette Diel Zyklen (Abbildung 2) erleben mit angeschlossenen Sensoren.

6. machen das Sensorkabel

Abbildung 3 . Zweischaligen SGM DMS Ventil Sensor. (a) DMS-Sensor, (b) DMS befestigt eine Auster mit einer Schleife der Belastung Messen zwischen beide Ventile, (c) DMS-Sensor montiert auf einer Auster. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1. Ventil Gape Sensorleitungen zu konstruieren, durch Verdrehen der beiden 32 AWG (7/40) Drähte (siehe Tabelle der Materialien) der gewünschten Farbe (Abbildung 3ein). Schneiden Sie einer Länge von Draht doppelt so lang wie die gewünschte Gape Sensorkabel, d. h. doppelt so lang aus dem Aquarium an der SGM plus das gewisse extra.
2. Haben Sie zwei Menschen einander, gegenüber stehen jeweils ein Ende des Kabels.
3. Schieben Sie den Griff der Schere über das Kabel, so dass in der Mitte des Kabels der Schere durch das Kabel gehalten ist. Halten Sie das Kabel unter Spannung zu allen Zeiten (es kann nicht schlaff gehen).
4. Haben Sie beide Personen drehen Sie das Kabel in die entgegengesetzte Richtung das Kabel unter Spannung zu halten. Da das Kabel beginnt zu drehen, das Paar der Schere in der Mitte (das Gewicht sorgt für) sinkt nach unten, und beide Enden des Kabels können umeinander drehen.
5. Die beiden Enden des Kabels zusammengestellt und halten sie hoch oben, nicht erlauben, die Schere mit dem Kabel an den Boden berühren oder gehen Sie locker. Anschließend das Kabel führt drehen, schneiden Sie das Kabel auf der anderen Seite, so gibt es 4 Kabel insgesamt, zwei an jedem Ende.
6. Alternativ, um diesen Schritt zu beschleunigen, haben Sie eine Person halten Sie einen Bohrer mit den Drähten, die an einem Ende eingespannt, halten Sie die Spannung auf den Drähten und twist die Drähte durch den Bohrer einschalten.
7. Streifen 2 cm Abisolieren der Drähte an jedem Ende des twisted-Pair.

7. Löten den Sensor

1. Verlöten Sie das freiliegende Kabel.
2. Löten Sie Masseanschlüsse männlichen Crimp Steckerstifte auf die zwei Leitungen an einem Ende des Sensorkabels indem pretinning die Pins und die Kabel.
3. Dann, isolieren Sie die Leitungen indem man Schrumpfschlauch über jeden Lead. Wählen Sie Schrumpfschlauch, die nicht viel größer im Durchmesser als der Kabel. Schrumpfen Sie die Hitze schrumpfen mit einer Heißluftpistole. Der Schrumpfschlauch sollte jetzt fest rund um die Kabel gewickelt werden.
   Hinweis: Diese zwei Leitungen erhalten während der Experimente in der Wheatstone-Brücke angeschlossen.
4. Lot, das andere Ende des Sensorkabels, die beiden Kontakte eines 1000 Ω Stamm zu messen, mit den Abmessungen von 13,5 mm * 5,5 mm Raster auf die restlichen zwei, führt (Abbildung 3ein).
5. Fügen Sie einen Sensor-Tag, um das Sensorkabel (Abbildung 3ein) zu identifizieren.

(8) Abdichtung des Sensors

Hinweis: Die Dehnungsmessstreifen im Meerwasser schnell korrodieren und somit sehr gut abgedichtet werden müssen. Die Qualität der Dichtung beeinflusst die Lebensdauer des Sensors.

1. Versiegeln Sie die Dehnungsmessstreifen durch Befestigung an PCT-2A-Band 15 mm Klebestreifen an den langen enden und 2 mm an den Seiten des Sensors (Abbildung 3ein) verlassen. Nach dem anbringen PCT-2A Klebeband auf der Unterseite des DMS, fügen Sie schnelle Gel auf die Sensorleitungen und die angeschlossenen offenen Enden der Kabel hinzu.
2. Legen Sie ein zweites Stück der PCT-2A-Band von der gleichen Größe wie das untere Stück auf der Oberseite des Sensors und befestigen Sie beide Teile des Bandes mit der DMS in der Mitte zusammen. Lassen Sie nicht die schnelle Gel Flow überall anders als über die Leitungen und die Sensorleitungen.
3. Um das Siegel zu verbessern, fügen Sie dünnere Klebestreifen PCT-2A bis an den Rand, wo die beiden Teile der Band rund um den Sensor treffen. Dies gilt für die drei sichtbaren Kanten der Sensoren.
4. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 8,4 elfmal, um 12 Sensorleitungen mit Sensoren, eine für jeden Kanal auf der Wheatstone-Brücke zu bauen.
   Hinweis: Erfolgreiche Abdichtung der Dehnungsmessstreifen war die zentrale Variable zweischaligen Gape Sensor Überleben im Meerwasser und zur Minimierung der gelegentlichen "Sprünge" in der Sensor-Ausgang beeinflussen. Frühere Studien ohne die Abdichtung oben beschriebene Technik führte zu frühen Sensor Korrosion und scheitern oder schnelle Drift außerhalb des Messbereichs. Zukünftige Verbesserungen gehören Techniken, um das Siegel zu verbessern.

9. Befestigung Ventil Gape Sensor an einer Muscheln (Abbildung 3b, C)

1. Entfernen Sie Auster aus Diel Radfahren Hypoxie Aquarium vor den niedrigen Plateau-Phase.
2. Schreiben Sie mit Nagellack eine Identifikationsnummer auf der sauberen, trockenen Schale jedes C. Virginica.
3. Die saubere und getrockneten Ventile der live C. Virginica (Abbildung 3b, c) mit Aquarium Dichtstoff damit den Sensor nach dem Lauf entfernt werden zuordnen Sie die versiegelten Dehnungsmessstreifen. Befestigen Sie den Gape Sensor mit der führt am rechten (flach) Ventil Auster über auf halbem Weg auf der Schale (Abb. 3c) und lassen Sie eine Schleife von Dehnungsmessstreifen (Abbildung 3b) über die Ventile nicht zu behindern die Öffnung der Ventile ( Abbildung 3b). Kleben Sie die restlichen freie Ende des Sensors auf das linke Ventil.
   Hinweis: Beobachtungen bestätigen, dass Austern ihre Ventile normalerweise mit den Sensoren im Ort öffnen.
4. Es spielt keine Rolle, welchen Weg um den Sensor herum geklebt wird, jedoch die Richtung des Signals wird geändert werden wenn einige führt auf das linke Ventil und einige auf das passende Ventil verklebt sind. Die Richtung des Signals wird ergibt sich aus der erzwungenen Schließung die Muscheln am Ende eines Laufs. Für alle Muscheln führt Aufkleben den DMS-Teil mit dem Sensor zu der gleichen Ventil-Seite für eine einheitliche Richtung der Veränderung in das Antwortsignal Gape.
5. Bei jedem Schritt des Prozesses der Abdichtung Sensoren und Befestigung an der Austern Überprüfen der Widerstand des Sensors in regelmäßigen Abständen, um sicherzustellen, dass es im Bereich der ausleseelektronik bleibt und für mögliche Sensor Schäden während der Verarbeitung zu überprüfen.
6. Legen Sie 12 Austern auf 12 Sensoren alle 12 Kanäle von der SGM füllen.
7. Die verschiedenen Aquarien Austern kurz vor der Übersättigung Plateauphase hinzufügen.

10. Setup der Datenlogger und Multiplexer für das Ventil Gape Gerät

1. Befestigen Sie einen Sensor an die Muscheln und dann verbinden Sie die Kabel mit der SGM mit einzelnen Wheatstone Brücken (Abbildung 1) für jeden Sensor (insgesamt 12 Brücken) und mit einem Datenlogger verbunden.
2. Festlegen der Datenlogger Abtastperiode einmal jede 2,5 zu lesen s und dann gemittelt für 15 s.
   Hinweis: Die 62 k Sample-Speicher auf den Datenlogger verwendet hier erlaubt 12 h von unbeaufsichtigten Betrieb. Größere Datenlogger und schnellere Abtastraten können ausgewählt werden, falls gewünscht.
3. NULL das Gape Signal für jeden einzelnen Sensor nach dem Anbringen des Sensors an eine Muscheln mit dem Potentiometer auf der SGM wählt.
4. Wenn nötig, wie höhere Salzgehalte, jeder Sensor in regelmäßigen Abständen für Drift im Sensor Antwort korrigieren, so dass der Sensor im Bereich der SGM bleibt (-25 bis + 25 mV) Ausgabe der Wheatstone-Brücke. Die SGM-Palette wurde für maximale Empfindlichkeit zwischen der Wheatstone-Brücke und dem Eingang der Datalogger gewählt.

11. Einsatz von Muscheln mit Gape Sensoren in Diel Radfahren Hypoxie

1. Dichtstoff hat geheilt, nachdem das Aquarium (ca 30 min) ein sauerstoffreiches Holding Eimer mit Durchfluss Wasser für mindestens 5 h erlauben das Aquarium Dichtungsmittel, vor dem Eintauchen in das Experiment Auslaugen der Muscheln zurückzukehren.
2. Platzieren Sie Austern in den Aquarien während der Hochlaufphase die Übersättigung (SS)-Plateau (Abbildung 2).

12. die Rückgewinnung von Muscheln mit Gape Sensoren

1. Wenn Sie die Auster mit Diel Radfahren Hypoxiaat Ende der Frist von zwei Tagen aus dem Aquarium wiederherstellen, benutzen Sie Ihre Finger zum Auslösen der Auster zu schließen und ein Schlusssignal der Sensor Spannung zu erzeugen. Auf diese Weise können die Richtung und das Ausmaß der dem Schlusssignal aufgezeichnet werden
2. Definieren Sie die Auster als offen, wenn der Sensorwert größer als ½ der geschlossenen Wert ist. Definieren Sie der Auster als geschlossen, wenn der Sensorwert kleiner als ½ schließen Wert.
   Hinweis: Östliche Austern nicht öffnen viel im Zwischenbereich.

13. die Linearisierung der rohen Ventil Gape Daten

Abbildung 4. Linearisierung der rohen Gape Daten einer Auster. (a) 14 h Licht: 10 h Dunkelphasen, (b) [tun] über einen Zeitraum von zwei Tagen mit Perioden der schweren Hypoxie ([tun] 0,6 mg/L), (c) Raw Gape Daten Zeitreihen eine Auster. Lineare Drift der Daten wird durch Korrosion des Sensors verursacht und muss entfernt werden, in der Nachbearbeitung (d) Gape Daten Zeitreihen nach Post-Processing, ungefähre Echtzeit (e) . Um das Ausmaß und die Richtung der Schließung Spike zu bestimmen, wird die Auster ausgelöst, um am Ende eines Laufs zu schließen. Größen variieren zwischen den verschiedenen Sensoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1. Visuell Auster Gape Aktivität, zu identifizieren und Verwenden der geschlossenen (oder öffnen, je nachdem, welche länger ist) Phasen der Muscheln Instrument Drift zu bestimmen. IF-Anweisungen in Tabellenkalkulations-Software verwenden, um die geschlossenen Werte mit einem markieren und öffnen Sie Werte mit NULL (z. B. = wenn (Zell-> 5, 1 (wahr), 0 (False))).
2. Entfernen Sie die kürzeste Phasen und führen Sie eine lineare Regression auf den verbleibenden Rohdaten. Verwenden Sie die Regressionsgleichung um zu linearisieren die experimentellen Daten (Abbildung 4). Linearisierung muss für jeden Sensor individuell erfolgen.
   Hinweis: Sensordrift ist kurz (Minuten) und lange (Tage) zeitlich linearen Skalen und die Höhe der Drift variiert von Sensor zu Sensor. Drift ist über kurze Zeiträume z. B. eine Stunde, in der nur gelegentlich lineare Drift gemerkt worden ist in der Regel vernachlässigbar. Sensordrift erfordert, dass Kalibrierungen Ventil Gape und Sensor Gape für jeden Sensor getrennt vorgenommen werden und eine Linearisierung für jeden Sensor in der Nachbearbeitung der Daten erfolgen muss.

14. die Kalibrierung der Sensoren: tatsächliche Gape Breite Versus Sensor mV

In einem Experiment Seite kalibrierbar Sensorspannung der tatsächlichen klaffen Breite der Austern.

1. In einem Aquarium Einrichten einer Auster mit einem Gape-Sensor. Gape Aufnahme zu initiieren. Lösen Sie die Auster zu schließen, indem Sie ihn berühren. Bald darauf wird die Auster wieder geöffnet.
2. Wie die Auster zu öffnen ist, fotografieren Sie und notieren Sie die Sensorspannung des Apparates Gape jedes Mal, wenn ein Foto aufgenommen wird. Behalten Sie den Überblick welches Bild mit welcher Gape Apparat lesen geht. Legen Sie einen Bezugsmaßstab auf dem Foto, auf dem gleichen Niveau der Ventile.
3. Analysieren Sie die Entfernung die Auster ist in jedes Foto (mm) mit einer open-Source-Bildbearbeitungsprogramm wie ImageJ geöffnet.
4. Vergleichen Sie tatsächliche klaffen Breite Sensorspannung und Ausführen einer Regressionsanalyse. Dadurch die Kalibrierung für die eigentliche Öffnung-Status und weitere Sensormessungen können dann im Zusammenhang mit tatsächlichen klaffen Breite die Muscheln.
   Hinweis: Dies zeigt, dass klaffen Breite linear auf Sensorspannung, in Wirklichkeit bezieht dieser Prozess dauert zu lange und wurde nicht für die Hypoxie Gape Experimente durchgeführt. Für die Hypoxie Gape Experimente war es wichtig, die Austern für den geringsten Zeitaufwand aus ihren Aquarien, statten sie mit Sensoren und wieder in die Aquarien zu entfernen. Für einige Versuche die Breitenmessung Gape kann wichtig sein und die Kalibrierung Techniken oben befolgt werden.

Austern, die ununterbrochene Inklusieve Mündungs Wasser (keine Hypoxie während der niedrigen Plateauphase des täglichen Zyklus) ausgesetzt waren die meiste Zeit offen und selten nur kurz geschlossen (Abbildung 5). Wenn sie abwechslungsreiche von Auster, Austern geschlossen. Dieses Muster ist auch in Loosanoff und Nomejko 1946⁴⁴ und Higgins 1980³⁹festgestellt worden. Austern reagierte auch nicht auf die Differenz in dunklen und hellen Phasen.

Abbildung 5 . (a-g) Eine Teilmenge der Gape Antworten von sieben Austern ausgesetzt (h) zwei Tage der normoxiezustand ([] = 7,3 mg/L) schließen gelegentlich jede Auster mit einem anderen Muster. Simulierte Nachtzeit wird in die schwarzen Balken, simulierte Tageszeit mit weißen Balken angezeigt. Diese Zahl wurde von Porter und Breitburg 2016⁶³geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die meisten Austern, schwere Hypoxie ausgesetzt ([] = 0,6 mg/L) während der niedrigen Plateau Phase während Diel Radfahren Hypoxie geschlossen sobald das Ziel [tun] erreicht wurde, und einige Austern auch geschlossen, bevor das Ziel [tun] erreicht und blieb war für die meiste Zeit geschlossen, schwere Hypoxie weiter (Abbildung 6). Kontrolle und zyklischen pH beeinflusste nicht klaffen.

Abbildung 6. (a-g) Eine Teilmenge der Gape Antworten von sieben Austern ausgesetzt (h) zwei Tage von Diel Radfahren Hypoxie mit schweren Hypoxie ([] = 0,6 mg/L) während der niedrigen Plateauphase. Simulierte Nachtzeit wird in die schwarzen Balken, simulierte Tageszeit mit weißen Balken angezeigt. Diese Zahl wurde von Porter und Breitburg 2016⁶³geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Mit milde Hypoxie ([] = 1,7 mg/L), Verschlüsse oft aufgetreten später während der niedrigen Plateauphase statt an dem Punkt als Ziel [tun] (Abbildung 7) erreicht wurde.

Abbildung 7. (a-g) Eine Teilmenge der Gape Antworten von sieben Austern ausgesetzt (h) zwei Tage von Diel Radfahren Hypoxie mit milde Hypoxie ([] = 1,7 mg/L) während der niedrigen Plateauphase. Simulierte Nachtzeit wird in die schwarzen Balken, simulierte Tageszeit mit weißen Balken angezeigt. Strom wurde in c, e, g ("no Data") unterbrochen. Diese Zahl wurde von Porter und Breitburg 2016⁶³geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Während der niedrigen Plateauphase mit abwechslungsreichen [tun], Austern, unter schweren ([] = 0,6 mg/L) Diel Radfahren Hypoxie mit Kontrolle pH (pH = 7,8) sowie zyklische pH-Wert (pH = 7,8–7.0) schlossen sich deutlich länger als Austern unter normoxiezustand (7,3 mg / L). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Höhe von Verschlüssen zwischen Steuerung und zyklischen pH-Wert unter schweren Hypoxie. Austern unter Mild ([] = 1,7 mg/L) Diel Radfahren Hypoxie wurden ähnliche Mengen an Zeit während der niedrigen Plateau als Austern unter schweren Hypoxie mit Kontrolle pH-Wert oder zyklische pH geschlossen. Darüber hinaus wurden Austern unter milden Diel Radfahren Hypoxie eine ähnliche Menge an Zeit wie die Austern unter normoxiezustand während der niedrigen Plateauphase geschlossen. In jeder der Phasen gab es keine signifikanten Unterschiede in der Höhe von Verschlüssen zwischen Steuerung und zyklischen pH-Wert unter schweren Hypoxie.

Während der normoxiezustand Phase nach dem niedrigen Plateau Austern, die schwere Hypoxie während der niedrigen Plateau erlebten öffneten die meiste Zeit (Abbildung 8) und machten oft während [tun] Ebenen Hochfahren waren, noch bevor das normoxiezustand-Plateau erreicht hatte) ( Abbildung 6). Während die Übersättigung und normoxiezustand nach Übersättigung Phasen waren bzw. Austern aller Behandlungen offen die meiste Zeit. Austern zeigte diese Muster über wiederholte Diel Zyklen über die zwei Tage Zeit-Spanne.

Abbildung 8. Prozent Zeit Austern waren geschlossen (a) niedrige Plateau, (b) normoxiezustand nach dem niedrigen Plateau, Übersättigung (c) und (d) normoxiezustand nach Suspersaturation Phasen während der Diel Radfahren [tun]. Während der niedrigen Plateauphase in (a): "zyklische 0,6" = [tun] von 0,6 mg/L (schwere Hypoxie), zyklische pH (pH 7,8–= 7.0) (n = 4); "0,6, Kontrolle" [tun] = 0,6 mg/l (schwere Hypoxie), Steuern, pH-Wert (pH = 7,8) (n = 4); "zyklische 1,7" = [tun] von 1,7 mg/L (Milde Hypoxie), zyklische pH-Wert (pH = 7,8–7.0) (n = 4); "Kontrolle, Kontrolle" [tun] = 7,3 mg (normoxiezustand), Steuern, pH-Wert (pH = 7,8) (n = 4). Statistische Unterschiede sind durch verschiedene Buchstaben über die Balken (geschachtelte ANOVA, p≤ 0,05) angezeigt. Fehlerbalken sind Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Während der niedrigen Plateauphase wurden geschlossene 70 % der Zeit und Austern aus der schweren Hypoxie, 1/3 oder mehr Austern aus der schweren Hypoxie, zyklische pH-Wert pH Steuern wurden geschlossene 49 % der Zeit (Abbildung 9). Im Gegensatz dazu waren 1/3 oder mehr Austern aus der milde Hypoxie zyklischen pH-Wert während der niedrigen Plateauphase geschlossenen 29 % der Zeit und aus der Inklusieve pH Kontrollbehandlung 12 % der Zeit. Die meisten Austern, die gleichzeitig während der niedrigen Plateauphase geschlossen wurden 82 % und 67 % der Austern in der schweren Hypoxie, zyklische pH-Wert und schweren Hypoxie, Steuern bzw. pH-Behandlungen. Die milde Hypoxie, zyklische pH ausgesetzt Behandlung, maximal 45 % der Austern geschlossen während der niedrigen Plateau und Austern nur normoxiezustand maximal 42 % kurz gleichzeitig geschlossen. In der normoxiezustand nach dem niedrigen Plateau, die Übersättigung und normoxiezustand nach Übersättigung geschlossen selten mehr als 1/3 der Austern zu jeder Zeit.

Abbildung 9 . Prozent der Austern geschlossen zur gleichen Zeit während der niedrigen Plateau, normoxiezustand nach niedrigen Plateau, Übersättigung und normoxiezustand nach Übersättigung Phasen dargestelltAbbildung 2. (A), die niedrigen Plateau war stark hypoxischen ([] = 0,6 mg/L) und hatten zyklischen pH-Wert (pH = 7,8–7.0) (n = 13 Austern). Für (b), die niedrigen Plateau war milde Hypoxie ([] = 1,7 mg/L) und hatten zyklischen pH-Wert (pH 7,8–= 7.0) (n = 11 Austern). (C), die niedrigen Plateau war stark hypoxischen ([] = 0,6 mg/L) und hatte Kontrolle pH-Wert (pH = 7,8) (n = 11 Austern). (D), war der niedrige Plateauphase Inklusieve ([] = 7,3 mg/L) (n = 11 Austern). Horizontale Linie zeigt, wo ein Drittel der Austern waren gleichzeitig geschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Klaffen Breite bezieht sich linear auf Sensor mV (Abbildung 10). Die Richtung, dass der Sensor am Ventil verklebt ist bestimmt die Richtung des Signals.

Abbildung 10 . Kalibrierungen von Gape Sensorspannung tatsächlich klaffen Breite der Austern. (a, b) Gape Sensor führt zu das passende Ventil der Austern befestigt, (c, d) Gape Sensor führt zu das linke Ventil angebracht. Aus Gründen der Kohärenz in die Richtung der Antwort soll die Sensoren in die gleiche Richtung der Ventil jede Auster angebracht werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Typische Studien Fokus auf kontinuierliche, erweitert Zeiträume der sauerstoffarmen Bedingungen und die Antwort, die oft als das Überleben der Tiere gemessen. Zur Zeit ist unser Verständnis von Verhaltensreaktionen von Tieren zur Hypoxie Diel Radfahren jedoch minimal⁶³. Daher sollten weitere Studien auf das Verhalten der Organismen als Reaktion auf Hypoxie Diel-Radfahren konzentrieren, die tritt regelmäßig im Laufe des Sommers in vielen Flussmündungen^7,8.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Messung kontinuierlich die Verhaltensreaktionen von Muscheln, Diel Radfahren Hypoxie und zyklischen pH. Austern reagierte nicht behaviorally Diel-Radsport von pH. Jedoch reagiert Austern stark sauerstoffarmen Bedingungen von Shell Gape reduziert. Darüber hinaus mehr als ein Drittel der Austern für längere Zeit unter hypoxischen Behandlungen gleichzeitig geschlossen aber am meisten geöffnet wieder unter die Inklusieve Phase, die folgten. Gape erhöhen und reduzieren Ventil Verschluss zum Ausgleich von verlängert Zeiten des Ventils Schließung während der schweren Hypoxie reduzieren könnte die Auswirkungen der Diel Radfahren Hypoxie auf die Austern selbst und auf das Phytoplankton sie filtern. So könnte solche Verhaltensstörungen Entschädigung Nahrungsnetz oder Ökosystem Effekte minimieren.

Ein wichtiger Schritt in dieser SGM-Methode ist erfolgreich Gape Sensor abzudichten. Wenn der Sensor nicht ordnungsgemäß verschlossen ist, kann Meerwasser zu DMS, Drift zu erhöhen und schließlich unbrauchbar. 29-Sensoren wurden im Laufe eines Experiments Mesokosmen Bergeron (2005)⁶⁴ eingesetzt und die Höhe der Zeit, die sie funktionierte bewertet. Die am längsten laufenden Sensoren funktionierte für mehr als 16 d, wenn das Experiment beendet wurde. Kürzester Zeit dauerte ein Sensor wurde 0,5 d. Die durchschnittliche Länge der erfolgreichen Sensorausbringung betrug 4,9 ± 3,0 Tage umfasst Sensoren, die vorzeitig abgebrochen wurden. Die meisten Sensoren arbeiteten über den zweitägigen Einsatz im Diel-Radsport Hypoxie Experiment.

Die Lebensdauer der Sensoren sollte verbessert werden, obwohl das aktuelle Gerät für viele Anwendungen geeignet ist. Das Aquarium-Dichtungsmittel enthält Essigsäure, die die Korrosion in den Sensoren erhöhen können. In Zukunft sollte nicht-sauren Elektronik RTV Silikon verwendet werden. Dies kann auch die lineare Drift abzuwenden, wurde festgestellt, dass und das in der Nachbearbeitung entfernt werden musste. Zur Zeit empfiehlt es sich, einen neuen Sensor für jede Gape laufen zu konstruieren.

Eine vorliegende Einschränkung ist, dass die SGM in einer Laborumgebung ausschließlich hat und Sensorleitungen lang genug, um die verschiedenen Aquarien erreichen vorgenommen werden müssen. Eine weitere Einschränkung der Methode ist, dass Analysen erfolgt nicht automatisch und müssen von hand durchgeführt werden und die lineare Drift individuell korrigiert werden muss. Wenn der tatsächliche Gape Raum der die Muscheln gemessen werden soll, hat jeder Sensor individuell kalibriert werden, da die Signal-Stärke von Sensor zu Sensor variiert. Es ist wichtig, am Ende eines Laufs, die Muscheln zu nah an die Größe und Richtung von der Schließung Spike auszulösen. Wenn im Feld, widrigen Umweltbedingungen wie Perioden der sauerstoffarmen Bedingungen können durch die Überwachung der Muscheln mit der SGM erkannt werden und erkennen, wenn mehr als ein Drittel schließen gleichzeitig Gape gemessen wird.

Vor der Porter und Breitburg (2016)⁶³, Ventil Gape hatte nicht auf Muscheln, Diel Radfahren Hypoxie ausgesetzt gemessen worden. Jedoch gibt es verschiedene Techniken um Ventil Gape zu messen. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass es sehr preiswert und keine direkte Sichtverbindung zu den Muscheln benötigt. Wiederkehrende Kosten sind nur die Kosten für Dehnungsmessstreifen. Das System kann auch Bereich einsetzbaren erfolgen durch die Unterbringung der Wheatstone-Brücke und Datenlogger in einem wasserdichten Gehäuse für das Herunterladen von Daten in regelmäßigen Abständen entfernt werden. Die Muscheln würde in einem feuchten Raum untergebracht werden.

Wir zeigen signifikante Ventil Gape Antworten der Austern in Diel Radfahren Hypoxie und zeigen, dass Austern auf zyklische Veränderungen des pH-Wertes nicht ansprechen. Zukünftige Arbeit konzentrieren bessere Abdichtung des Sensors zur weiteren frühen Sensorausfall reduzieren und driften, evtl. mit Klebeband flexibel Wärme-Schmelze in Jou Et al. (2013) ⁵⁷ und mithilfe von nicht-sauren elektronische Silikon RTV. Zukünftige Studien sollten die Ventil Gape Beantwortung anderer zweischaligen Arten Diel Radfahren Hypoxie Messen und auch untersuchen die Wirkung von Diel Radfahren Hypoxie und Essen Beschränkung Ventil Gape Verhalten. Es ist bekannt, dass Muscheln zu, als Reaktion auf niedrige Essen Konzentrationen schließen aber die Interaktion zwischen Diel Radfahren Hypoxie und Essen Konzentration wurde nicht geprüft.

Wir haben nicht alles offenlegen.

Wir danken für die Fotos von Austern und Messen ihre klaffen Breite in ImageJ Melinda Forseth. Wir danken Denise Breitburg für den Zugriff auf die Aquarien mit Diel Radfahren Hypoxie und zyklischen pH-Bedingungen. Wir danken dem Smithsonian Environmental Research Center, Edgewater, Maryland, Raum für Experimente. Die Hypoxie-Experimente wurden von einem National Oceanic and Atmospheric Administration - Zentrum für gesponserte Coastal Ocean Research Grant Nein finanziert. NA10NOS4780138 und dem Smithsonian Hunterdon Fonds, Denise Breitburg. Das Ventil klaffen Messungen während der Hypoxie, die Experimente durch eine Fakultät für Verbesserung von Washington College, Elka T. Porter finanziert wurden.