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Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Zusammenfassung

Niedrige High-density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) Ebenen sind einer der leistungsstärksten unabhängigen negative Prädiktoren für arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Struktur und Funktion von HDL statt HDL-C können Arteriosklerose genauer vorherzusagen. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. HDL-Funktion richtet sich normalerweise nach zellbasierte Assays wie Cholesterin-Efflux-Assay, aber diese Tests haben zahlreiche Nachteile fehlende Standardisierung. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. HDL-Oxidation beeinträchtigt HDL-Funktion. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Lipid-Sonde Interaktionen sollten als Interpretation der Ergebnisse der nicht-enzymatische Fluoreszenz Tests zur Messung der Lipid oxidativen Status berücksichtigt werden. Dies hat uns motiviert, entwickeln eine zellfreie biochemische enzymatische Methode zur HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox) zu ermitteln, die zur HDL Dysfunktion beiträgt. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-c quantifizieren kann Hier ist ein Protokoll Describedfor Bestimmung des HDL-Lipid Peroxidation verwenden das Fluorochrom-Reagenz. Assay-Variabilität kann durch strikte Standardisierung der experimentellen Bedingungen reduziert werden. Höhere HDLox Werte sind verringerte HDL antioxidative Funktion zugeordnet. Das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen von kardiovaskulären Erkrankungen, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen. Dieser technische Ansatz ist eine robuste Methode zur HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beurteilen, wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose haben).

Einleitung

Arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) ist die führende Ursache des Todes weltweit1,2. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass geringe Mengen an High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin in der Regel umgekehrt das Risiko für die Entwicklung von Atherosklerose1,2zugeordnet sind. Obwohl einige Studien eine Atheroprotective Rolle für HDL1,2unterstützen, ist der Mechanismus, mit dem HDL die Initiierung und Progression der Atherosklerose dämpft, komplex 3,4. So wurde vermutet, dass die komplexe Struktur und Funktion des HDL statt absolute Ebene Atherosklerose 5,6,7,8genauer vorhersagen können. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. Diese i) reduzieren seinen Cholesterin Efflux potenzielle 9, Ii) verringern Sie anti-entzündliche und Erhöhung der HDL-assoziierten entzündungsfördernde Proteine 6,7, (Iii) Abnahme Antioxidans Faktorstufen und Aktivität und HDLs Fähigkeit zur Hemmung der Oxidation von Low Density Lipoprotein (LDLox)10 und iv) Lipid Hydroperoxid Inhalt und Redox-Aktivität (HDLox)9,11zu erhöhen. Robust-Assays, die die Pleotropic Funktionen des HDL (z. B. Cholesterin Efflux, antioxidative Funktion) auswerten können Bestimmung des HDL-HDL-C in der Klinik ergänzen.

HDL-Funktion wird in der Regel durch Zell-basierte Methoden wie das Cholesterin Efflux Assay8,12,13,14bewertet. Diese Methoden haben wesentliche Einschränkungen einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Standardisierung und verwirrende Effekte von Triglyceriden 7,15. Diese Nachteile aufwerfen Schwierigkeiten für große klinische Studien16. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. Der Cholesterin-Efflux ist eine der wichtigsten Funktionen von HDL, aber es kann nur durch zellbasierte Assays ermittelt werden. Andere Ansätze zur HDL-Funktion wie Proteomics17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen, 24 und zellbasierte Monocyte Chemotaxis-Assays HDL Funktion 17,22,25 nicht standardisiert wurden und nicht in großem Maßstab Studien am Menschen verwendet werden.

HDL hat bedeutende antioxidative Atheroprotective Effekt5,6,7,8. Die antioxidative Funktion von HDL wurde im Beisein von LDL in vorherigen Zelle frei fluorometrischen Assays 26bestimmt. Diese biochemischen fluorometrischen Methoden der HDL antioxidative Funktion wurden ursprünglich von Mohamad Navab und Alan Fogelman und ihre Kollegen26entwickelt. Obwohl viele Studien am Menschen diese Methoden verwendet haben, um festzustellen, HDL Funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, Lipid (HDL)-Lipid (LDL) und Lipid-Fluorochrom Interaktionen begrenzen Reproduzierbarkeit dieser Zelle frei nicht-enzymatische biochemischen Assays HDL Funktion27,28.

Vor kurzem Interesse konzentriert sich auf die funktionellen Konsequenzen der HDL-Oxidation, die das Ergebnis der Oxidation von Lipiden und Proteinen innerhalb von HDL 27,29,30. Frühere Studien haben gezeigt, dass Oxidation von HDL HDL Funktion 27,29,30beeinträchtigt. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Somit kann HDL Lipid Peroxid Inhalte zur Bestimmung der HDL-Funktion 9,17,20,31 und angesichts der bekannten Grenzen der vorherige Assays von HDL-Funktion7, 15,27,32, wir entwickelt alternatives fluorometrisch Verfahren, das HDL Lipid Peroxid Inhalt (HDLox) 32quantifiziert. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-C 32quantifizieren können. Die biochemische Prinzip des Tests ist in Abbildung 1dargestellt. Wir haben gezeigt, dass diese Fluoreszenz basierenden Ansatz nicht die Grenzen der vorherige HDL Funktion Assays27,28. Dieser Assay wurden weiter verfeinert und in unserem Labor standardisiert, so dass es in großem Maßstab Studien am Menschen selbst mit kryokonservierten Plasma 32,33,34, zuverlässig genutzt werden kann 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen der Herz-Kreislauf-Krankheit, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier beschreiben wir diese einfache, aber robuste Methode zur Messung der HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox). Dieser Assay kann als Werkzeug verwendet werden, um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beantworten wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide haben eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose)32.

Protokoll

alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik an der Universität von Kalifornien-Los Angeles, Los Angeles und der Alfred Hospital menschliche Ethik-Kommission, Melbourne durchgeführt.

Hinweis: Es gibt viele Variationen der Fluorochrom HDL-Funktion Assay (siehe Diskussion) 32. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll, das die beständigsten und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Eine Übersicht des Tests ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Probe Verarbeitung

  1. Verwendung frischer, nicht hämolysiert Serum (in Serum Separator Rohre gesammelt werden können) oder Citrat-Plasma nach 12-14 Stunden Fasten erhalten. Wenn kryokonservierte Proben verwenden, enthalten entsprechende Steuerung, wie in diesem Protokoll beschrieben.

2. Tag 0-Vorbereitung auf den Test

  1. Prepare arbeiten Layout des Experiments mit den entsprechenden Kontrollen, Proben und repliziert. Führen Sie jede Probe mindestens im Triplicates. Eine Vertreter 96 gut Layout ist in Abbildung 3 dargestellten.
  2. Berechnen alle Bände der Reagenzien, die für den Assay, basierend auf der Anzahl von Mustern und Wiederholungen verwendet werden.
    Hinweis: Enthalten ein zusätzliches Volumen von 10 % in jede Aktie arbeiten, stellen Sie sicher, es gibt genügend Volumen für jedes Reagens für das spezifische Experiment.
  3. Beschriften Sie alle erforderlichen Rohre für alle Stufen des Assays z. B. für die Trennung von HDL, Messung von HDL-C (optional) und die Fluorochromeassay.

3. Tag 1-Vorbereitung von Steuerelementen

  1. Vorbereitung der studienspezifischen gepoolten Kontrolle
    1. Erstellen einer Kontrollprobe von gepoolten Plasma oder Serum alle Studie Proben. Wenn 20 Proben in jede Platte in dreifacher Ausfertigung ausgeführt, kombinieren Sie 10 µL von jeder Probe in ein Steuerelement 200 µL gebündelt. Geben Sie eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor den HDL-C-Wert dieses Steuerelements bestimmen.
      Hinweis: Verwenden Sie dieses gebündelte Steuerelement Assays zu standardisieren und alle möglichen bekannten entfallen (z.B. Art des Matrix-Serum im Vergleich zu Plasma, Frost-Tau-wechseln, Kryokonservierung) und unbekannte Störfaktoren, die experimentelle Variabilität beeinträchtigen 27 , 28.
  2. Vorbereitung der Labor-spezifische Qualitätskontrolle (QCs)
    1. bereiten einen großen Vorrat an HDL in jedem Labor (z. B. HDL von 5 mL Plasma von 10 gesunden Spendern isoliert) und mehrere Aliquote das Tiefgefrieren Lager, Frost-Tau-Wechseln zu minimieren.
    2. Nutzung von mindestens 10 verschiedenen repliziert aus diesem Bestand den Durchschnittswert des HDLox zu bestimmen. Ein akzeptablen Bereich des gemessenen HDLox Werte für jede QC-Probe in jedem Assay enthalten innerhalb ist < 15 % von der Variationskoeffizient der durchschnittlichen Wert.
    3. Geben eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor, HDL-C-Wert dieses Steuerelements (z.B. 40 mg/dL) zu bestimmen.
      Hinweis: Eine detaillierte Vorgehensweise wie Blut von Blutbanken verwenden, um diese Steuerelemente erstellen beschrieben 27 , 28 , 32 bislang. Bei Bedarf zusätzliche QCs verwenden (z.B. eine eines gesunden Spenders bekannt, normale HDL-Funktion und einer von einem Spender bekannt, weitgehend abnormale HDL-Funktion haben.
  3. Optimierung von Hintergrundsignal und leere Werte (optional)
    1. um Hintergrund zu minimieren, fügen Sie die entsprechende Menge an Katalase (1-4 U/mL) Inkubation Mittel-und rasch gebildeten H 2 O entfernen 2 durch spontane Luftoxidation der Puffer.
      Hinweis: Da die Werte aus den leeren Brunnen (keine HDL) die Werte der HDL Proben abgezogen wird sind und die Ergebnisse werden berichtet relativ zu einem gepoolten Steuerelement (das in der gleichen 96-well-Platte enthalten ist), fanden wir, dass dieser Schritt nicht praktisch Affec tut t die Ergebnisse. So kann Optimierung der Hintergrundsignal mit Katalase verzichtet werden, wenn erforderlich.

4. Tag 1-Trennung von HDL-Cholesterin HDL Niederschlag mit

Hinweis: verwenden Sie ein handelsübliches standardisierte HDL-Cholesterin auslösenden Reagenz ApoB erschöpft Serum nach Angaben des Herstellers zu isolieren ' s Anweisungen. Diese Reagenzien sind weit verbreitet in farbmetrischen Assays, um HDL-Cholesterin-Werte zu bestimmen.

  1. Plasma oder Serum Probe frisch verwenden (oder Auftauen).
  2. Mix gleiche Volumina (z.B. 80 µL) Plasma und HDL-Cholesterin Fällung Reagenz (20 % w/V Polyethylenglykol in Glycin Puffer bei pH 10,0 (25 ° C)).
  3. Mix gut von oben und unten pipettieren.
  4. Zentrifugieren bei 1000-2000 x g für 10 min.
  5. Aspirieren den überstand (HDL Bruch).
  6. Verwenden Sie isolierte HDL im Idealfall sofort für die Fluorochromeassay der Lipidperoxidation HDL. Jedoch wenn mehrere Proben am selben Tag ausgeführt werden und andere Schritte wie Messung der Konzentration von HDL-Cholesterin sind auch getan, dann die isolierte HDL bei 4 ° C lagern und verwenden Sie es am nächsten Tag für die FluorochromeHDL-Funktion Test.

5. Tag 1-Bestimmung des HDL-C in isolierte HDL

Hinweis: dieser Schritt ist optional, wenn der Wert des HDL-C aus dem klinischen Labor verwendet wird, um HDLox zu normalisieren von HDL-C-Menge.

  1. Quantify das HDL-Cholesterin aus dem Plasma, mit Standard-farbmetrische assays 27. 50 µL Reagenz Cholesterin in jede Vertiefung hinzufügen und bestimmen, Cholesterin-Konzentration mit einer kolorimetrischen Platte-Leser und eine Cholesterin-standard in jedem Kit zur Verfügung gestellt.

6. Tag 2-Vorbereitung der Reagenzien

  1. bereiten HRP und Cholesterin-Lösungen von HRP 5 U/mL Lösung (Bereich 1-10 U/mL).
  2. 20 mM bereiten Fluorochrom (z. B. Amplex Red) Lösungen: ein Fläschchen Fluorochrom Reagenz und DMSO auf Zimmertemperatur auftauen. Vor dem Gebrauch lösen Sie Fluorochrom Reagenz (1 mg) in 200 µL von DMSO auf. Speichern-Stammlösung auf eingefroren ≤-20 ° C, vor Licht geschützt werden.
  3. Bereiten Sie positive und negative Kontrollen: benutzen Sie 1 X ' Reaktion Puffer ' Cholesterin und 20 mM H 2 O 2 arbeiten ohne Lösung als negative und positive Kontrolle bzw..

7. Tag 2-Fluorochrom Assay

  1. hinzufügen 50 µL 1 x Reaktion Puffer als Leerzeichen (Negativkontrolle).
  2. Optional: positiv-Kontrolle in jeder Platte 20 mM Arbeitslösung von H 2 O 2 Agrega.
  3. Experimentelle Variabilität zu minimieren und sicherzustellen, dass Zusatz von Reagenzien und Proben werden konsequent durchgeführt und in einer fristgerechten Weise, führen alle Ergänzungen der Proben in einer separaten 96 gut Rundboden, klar, Polystyrol oder Polypropylen Platte (Platte 1). Verwenden Sie dann eine Mehrkanal-Pipette übertragen bestimmte Volumes in 3 96-Well-Platten (Platten 2-4: Polypropylen, flache BotTom, schwarz) (das haben identische Layout) ( Abbildung 2, Abbildung 3).
    1. Z. B. zunächst 160 µL isolierte HDL in jede gut/Probe der Platte 1 hinzufügen und dann mit dem Einsatz von Mehrkanal-Pipette übertragen 50 µL des HDL-Cholesterins von jeder gut/Probe in der schwarzen 96-Well Platten. Tipps zwischen jeder Zeile/Spalte ändern und verwenden Sie ungefilterte Tipps für alle Transfers.
  4. Proben in den Brunnen zu verlassen. Nicht wegwerfen. Es gibt keine Wäsche-Stufen zwischen Zugabe von Reagenzien.
  5. Fügen Sie 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) in jede Vertiefung.
    Hinweis: Verwenden Sie HRP vor der Zugabe des Reagenz Fluorochrom.
  6. 30 min bei 37 ° c inkubieren Entsorgen Sie Proben nicht nach der Inkubation (keine Wäsche Schritte zwischen Ergänzungen von Reagenzien).
  7. Fügen Sie 50 µL des Fluorochromereagent für eine Endkonzentration von 300 µM. Zu diesem Zeitpunkt insgesamt Reaktionsvolumen beträgt 150 µL. gut mischen und vor Licht schützen.
  8. Bewerten das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) jede Minute mehr als 120 min bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm-Filter).
    Hinweis: Verwenden Sie ein kürzeres 60-Minuten-Intervall mit frische Proben. Wir haben festgestellt, dass 120-Minuten-Test gibt mehr reproduzierbaren Daten mit der Verwendung von kryokonservierten Proben.
  9. Daten, die mittels geeigneter Software.

8. Tag 3-Datenanalyse

  1. Fluoreszenz Einheiten (willkürliche Einheiten) 120 Minuten nach Zugabe von Fluorochrom Reagenz für alle Proben einschließlich leere Brunnen aufnehmen und alle Steuerelemente.
  2. Berechnen Sie den Mittelwert der Fluoreszenz-Einheiten (basierend auf mindestens triplicates) (HDL Ox_sample). Nehmen Sie nicht Ausreißer (> 2 SDs vom Mittelwert) in Betracht.
  3. Subtrahieren die Hintergrundfluoreszenz mithilfe der folgenden Formel:
    figure-protocol-9672
  4. Normalisierung für HDL-Cholesterin-Betrag (HDL-C): Normalisierung den HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (einschließlich der gepoolten Kontrolle) von HDL-C) (mg/dl). In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als n (HDL-C) HDLox Maßnahme entsprechend der Einstellung für HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-10118
  5. die Expression von HDLox Lipid Peroxidation Wert jeder einzelnen Probe gegen den Wert eines Steuerelements gepoolten zu standardisieren. N (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (bereinigt um HDL-C) von n (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert des Steuerelements gebündelt zu normalisieren. In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als nHDL Ochsen Maßnahme entsprechend der Einstellung für experimentelle Variabilität und HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-10742
    Hinweis: dieser Ansatz ist ähnlich zu anderen etablierten experimentellen Ansätzen, wie experimentelle Variabilität von Messungen zu reduzieren International normalized Ratio (INR) 44 , 45. Dieser Ansatz wurde in klinischen Studien 32 , 33 , 34 , 35 , 36 validiert , 37 , 38 , 39.
  6. Qualitätskontrolle von Versuchsergebnissen mit standard Qualitätskontrolle Proben durchführen. Jedes Labor sollte eigene Qualitätskontrollen (QCs) festlegen. Im Idealfall gibt es einen QC für nHDLox aus einer Stichprobe mit bekannten dysfunktionalen HDL und QC für nHDLox aus einer Stichprobe von gesunden Spendern [z.B. Verwendung gepoolten Probe von jungen Erwachsenen, die etablierten Blutbank Geber und haben keine bekannten Komorbidität und Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich Rauchen]. Die letztere Kontrolle standardisiert Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Die Durchschnittswerte der diese QCs sind etablierte basierend auf mindestens 5 Wiederholungen (in der Regel verwenden wir für diesen wichtigen Schritt 10 Wiederholungen).
    1. Check ob gemessene QCs in jeder Probe haben innerhalb des erwarteten Bereichs der Werte schätzt. Angenommen, eine akzeptable maximale experimentelle Variabilität von 15 %, sollten alle experimentellen Messwerte in 15 % der bekannten durchschnittliche Werte von etablierten QC fallen. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen:
      figure-protocol-12551
      figure-protocol-12625
      Hinweis: Wenn entweder die inklusive Qualitätskontrolle Proben ( Normal im Vergleich zu dysfunktionalen HDL) HDLox Werte außerhalb der erwarteten Bereich (gegründet in jedem Labor) gibt, dann wiederholen Sie den Versuch.
  7. Durchführen Qualitätskontrolle der experimentellen Ergebnisse mit den Variationskoeffizienten (CV), um experimentelle Variabilität zu quantifizieren: wiederholen Sie alle Proben mit CV % > 15 %. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-13184
    Hinweis: eine typische Intra-Assay (innerhalb der gleichen Platte) und Inter-Assay (unter verschiedenen Platten) experimentelle Variabilität ist < 15 %. 2) ein typisches Intra-Assay-Lebenslauf ist zwischen 1-7 % und eine typische Interassay Lebenslauf zwischen 3-10 ist %.

Ergebnisse

50 µL jeder HDL-Probe werden in jedem Brunnen wie in Schritt 7.3 hinzugefügt. 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) werden dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,5 hinzugefügt. Proben sind für 30 min bei 37 ° C wie in Schritt 7.6 inkubiert. 50 µL Reagenz Fluorochrom sind dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,7 (Endkonzentration von 300 µM) hinzugefügt. Das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) wird dann jede Minute mehr als 120 Minuten bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm Filter) bewertet. Repräsentative Fluoreszenz Daten für eine leere, gepoolte Steuerung, Probe mit bekannten dysfunktionalen HDL und Probe mit normalen HDL sind in Abbildung 4dargestellt. Repräsentative Rohdaten und Schritt-für-Schritt-Analyse der Ergebnisse mit Hilfe der Gleichungen beschrieben in Abschnitt 8 des Protokolls ergeben sich Tabelle 1. In diesem Beispiel frische HDL Proben dienten und höhere HDLox Werte sind in der Regel mit frischen HDL erhalten. Zum Beispiel hatte HDL bekanntermaßen dysfunktionalen basierend auf unabhängige Tests der HDL-Funktion auch von HIV-infizierten Person ca. 2-fold relativ höheren Betrag von Lipid-Peroxid im Vergleich zu gepoolten HDL von gesunden Teilnehmern. Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse aus einer Studie mit Probanden bekanntermaßen HDL Funktion28,32beeinträchtigt haben. Der HIV-infizierten Personen hatten etwa 60 % höhere HDL-Peroxid Lipidgehalt (pro mg HDL-C) im Vergleich zu den nicht infizierten Personen bedeuten. In unserem vorherigen veröffentlichten Studien mit kryokonservierten HDL war diese Methode zumindest nachweisen, 10 % relative Unterschiede in der HDLox im Vergleich zu HDL von Kontrolle Gruppen (ohne Krankheit z.B. chronische HIV-Infektion)36,37, 38.

figure-results-2088
Abbildung 1: Bestimmung der HDL Lipid Peroxid-Gehalt pro spezifische Menge an HDL-C.
In Staaten der systemischen Entzündung und oxidativem Stress stieg HDL Lipid-Peroxide (LOOH) (HDLox) mit eingeschränkter HDL-Funktion verbunden sind. HRP katalysiert die Oxidation von nicht-fluoreszierende Fluorochrom, rot fluoreszierenden Resorufin. Diese Oxidation werden von endogenen Peroxide vorhanden in der Reaktion (Oh-) und HDL-Lipid-Peroxide (LOOH-) angetrieben kann. Ohne Cholesterin Oxidase kann Resorufin (mit HRP) die intrinsische HDL Peroxid Lipidgehalt der eine bestimmte Menge an HDL-Cholesterin quantifizieren. Die Hintergrund-Produktion von OH - durch Luftoxidation des Puffers wird von fluoreszierenden Auslesen von jedem Bohrloch abgezogen. Resorufin hat in den meisten Proben minimaler Autofluoreszenz. Diese Zahl wurde modifizierte 32. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-3276
Abbildung 2: Überblick über den Workflow für die Fluorochromeassay der Lipidperoxidation HDL.
Tag 0: Vorbereitung auf die Probe: A) 96-well-Platte-Layouts entwerfen, schätzen Volumen benötigt (Plasma/Serum) Proben und Reagenzien (HRP-Enzym, Fluorochrom Reagenz, Puffer, PEG-Reagenz), beschriften Sie Rohre
Tag1: Vorbereitung auf die Probe und HDL Isolierung: A) Vorbereitung der Steuerelemente (Studie spezifische gepoolt Kontrolle, Qualitätskontrolle, positive und negative Kontrollen) (B) HDL Niederschlag mit PEG-Reagenz.
Tag2: Vorbereitung für den Assay (wenn nicht in Tag1 getan) und Fluorochrom Assay: A) Vorbereitung der Steuerelemente (Studie spezifische gepoolt Kontrolle, Qualitätskontrolle, positive und negative Kontrollen) A) Zugabe von HDL Proben: experimentelle Variabilität zu minimieren und sicherstellen Sie, dass die Zugabe von Reagenzien und Proben wird konsequent und zeitnah wird empfohlen, dass alle Ergänzungen der Proben (z.B. 160 µL) zunächst in einem separaten 96 gut Rundboden, klar, Polystyrol oder Polypropylen-Platte (Platte 1) erfolgen. Dann eine Mehrkanal-Pipette verwendet werden, um bestimmte Mengen (z.B. 50 µL) in 3 96-Well-Platten übertragen (2-4 Platten: Polypropylen, flachen Boden, schwarze Platten) (das haben identische Layout). (B) Zugabe von HRP: Fügen Sie 50 µL 5 U/mL (0,25 U) zu jeder gut mit einer Mehrkanal-Pipette C) Inkubation bei 37 ° C für 30 min D) hinzufügen 50 µL 300 µM/gut Fluorochrom Reagenz zu jeder gut mit einer Mehrkanal-Pipette E) beurteilen das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) pro Minute mehr als 120 Minuten bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm-Filter).
3. Tag: Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: Repräsentative Gestaltung des 96-well-Platten, die in der Regel in der Fluorochrom HDL-Funktion Assay verwendet werden.
Unterschiede im Zeitpunkt der Zugabe von HDL Proben in Vertiefungen der Platte können zwischen verschiedenen Brunnen zu Unterschieden bei spontanen Oxidation führen. Zur Minimierung von experimentellen Variabilität vermeiden Sie Variable spontane Oxidation zwischen verschiedenen Brunnen zu und sicherzustellen Sie, dass die Zugabe von Reagenzien und Proben wird konsequent durchgeführt und in einer fristgerechten Weise, es wird empfohlen, dass alle Ergänzungen der Proben (z.B. 160 µL) sind zunächst durchgeführt in einem separaten 96 gut Rundboden, klar, Polystyrol oder Polypropylen-Platte (Platte 1). Dann eine Mehrkanal-Pipette verwendet werden, um bestimmte Mengen (z.B. 50 µL) in 3 96-Well-Platten übertragen (2-4 Platten: Polypropylen, flachen Boden, schwarze Platten) (das haben identische Layout). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4: Repräsentative Daten von HDL Lipid Peroxidation Assay.
Das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) wird dann jede Minute mehr als 120 Minuten bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm Filter) bewertet. Repräsentative Daten (willkürliche Einheiten) werden von Patienten bekannt, um dysfunktionale HDL (basierend auf zwei unabhängigen HDL-Funktion haben für leer (keine HDL; Negativkontrollen), Positivkontrolle (H2O2), gepoolte HDL-Kontrolle und HDL angezeigt. Assays-Cholesterin Ausfluss und Monocyte Chemotaxis-Assays). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 5: Die Lipid-Peroxid-Assay HDL-Funktion erkennt hohen Lipid-Peroxid Inhalt pro spezifische Menge an HDL-C in Vivo.
HDL wurde isoliert und HDLox wurde ermittelt, wie im Protokoll 50 gesunde Probanden/innen und 100 Patienten mit HIV-Infektion beschrieben. Der HIV-infizierten Personen hatten höhere HDLox (1.59±0.53) im Vergleich zu den Kontrollen (1.01±0.31) (p < 0,001). Diese Zahl wurde modifizierte 32. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet ein robustes Werkzeug um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion bei Arteriosklerose und menschliche Krankheit zu beantworten. Der Assay quantifiziert den HDL Lipid Peroxid Inhalt pro mg HDL-C enzymatische Verstärkung (HRP). Dieser Ansatz vermeidet bekannte Einschränkungen der vorherige HDL-Funktion-Assays (z. B. Cholesterin-Efflux-Assay) einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Standardisierung und verwirrende Wirkung von Triglyceride7,15,32. Bestimmung des biochemischen anstatt biologische Eigenschaften (z.B. Cholesterin Efflux) HDL kann mehr reproduziert werden. Die Inter-Assay experimentelle Variabilität des < 10 % im Vergleich mit der zellbasierte Assays der HDL-Funktion, wo experimentelle interassay Variabilität oft ist > 15 % (oder nicht gemeldet). Darüber hinaus dieses Ansatzes kann biochemische Wechselwirkungen zwischen Lipiden begrenzen und fluoreszierende Sonden32. Bestimmung des HDL-Oxidation ist relevant im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Krankheiten, eingedenk der zentralen Bedeutung des oxidativen Stresses in der Arterienwand in der Pathogenese der Atherogenese 46. Wir haben die Fluorochrom-HDL-Funktion-Assay verwendet, um eingeschränkter HDL-Funktion in Staaten des chronischen oxidativen Stress wie Arteriosklerose und humanen Immundefizienz-Virus-Infektion (HIV)32zu erkennen. Biochemische Tests der HDL-Funktion verwenden, haben mehrere Studien die Vereinigung der HDLox mit Übergewicht und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 19,21,27,34,35 bestätigt ,36,47. In menschlichen Pilotstudien haben wir deutlich gezeigt Vereinigungen von HDLox mit validierten zellbasierte Assays, surrogate Maßnahmen von kardiovaskulären Erkrankungen, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und die damit verbundenen Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen32,36. Obwohl dieser Test in mehreren Studien verwendet wurde, um die Rolle von HDL-Funktion bei verschiedenen Erkrankungen wie chronische HIV-Infektion32,38, Atherosklerose 32 und Adipositas36, es bleibt in groß angelegte Studien mit verfügbaren klinischen Endpunkten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z.B. Herzinfarkt) validiert.

Die Reaktion der Fluorochrom mit Peroxid in Anwesenheit von HRP, stark fluoreszierenden Resorufin zu produzieren ist gut etablierte 48,49. HRP katalysiert die Oxidation von nicht-fluoreszierende Fluorochrom zu fluoreszierenden Resorufin rot50,51. Diese Oxidation werden von endogenen Peroxide vorhanden in der Reaktion (Oh-) und HDL-Lipid-Peroxide (LOOH-) angetrieben kann. Ohne Cholesterin Oxidase kann Resorufin (mit HRP) die intrinsische HDL Peroxid Lipidgehalt der eine bestimmte Menge an HDL-Cholesterin quantifizieren. Die Hintergrund-Produktion von OH - durch Luftoxidation des Puffers wird von fluoreszierenden Auslesen von jedem Bohrloch abgezogen. Resorufin hat in den meisten Proben minimaler Autofluoreszenz. Zugabe von Katalase (1-4 U/mL) im Puffer Reaktion kann schnell endogenen Peroxide dämpfen, so dass die Zunahme der Fluoreszenz-Anzeige im Laufe der Zeit durch HDL-Lipid-Peroxide angetrieben wird. Der Test ist vielseitig und Peroxid Fettgehalt in HDL Cholesteryl Ester im Vergleich zu kostenlosen HDL Cholesterin32,48,49 beurteilen kann.

Es gibt viele Variationen der Fluorochrom HDL Funktion Assay32. Kurz, es gibt mindestens 3 wichtige Ansätze: eine) fügen Sie ein spezifisches Volumen von HDL (z. B. 50 µL) pro Bohrloch und später normalisieren den HDL Lipid Peroxidation Wert von der Höhe des HDL-C wie im klinischen Labor; (b) bestimmen Sie die Konzentration von HDL-C in jeder Probe basierend auf standard farbmetrischen Cholesterin-Assays und fügen Sie dann eine bestimmte Menge an HDL-C (z. B. 1 µg) pro Bohrloch; und c) normalisieren das HDL-Funktion Auslesen von HDL oder ApoA-ich Protein Inhalt32. Es gibt auch mindestens 3 wichtige Ansätze, wie HDL für HDL Lipid Peroxidation Assays zu isolieren: a) HDL-Cholesterin Niederschlag z.B. mit Polyethylenglykol; (b) Immunoaffinitäts erfassen; und c) andere standard nicht Hochdurchsatz-Methoden für HDL isoliert wie µLtracentrifugation32. Darüber hinaus der Assay ist vielseitig und Peroxid Fettgehalt in HDL Cholesteryl Ester im Vergleich zu kostenlosen HDL Cholesterin 32beurteilen kann. Es gibt mehrere Möglichkeiten zu berichten, dass die Ergebnisse z.B. willkürliche Fluoreszenz Einheiten, standardisierte Resorufin Fluoreszenz Einheiten, Verhältnis zu einer gepoolten Control32normalisiert. Hier präsentieren wir Ihnen die meisten reproduzierbaren Ansatz.

Wenn Plasma verwendet wird, es ist wichtig, Plasma in Tuben vorzubereiten, die Natrium-Citrat als Antikoagulans 27,28. EDTA-40 und Heparin-Sulfat kann Oxidation Reaktionen 41,42stören. Heparin-Sulfat stören biochemische Tests von HDL-Funktion 27,28. Obwohl kryokonservierten Serum- und Plasmaproben zur Bestimmung von Lipiden, HDL-Funktion und HDL Lipidperoxidation suboptimal sind, können kryokonservierte Proben relative Unterschiede in HDL Lipidperoxidation pro mg von HDL quantifizieren. Es ist wichtig, alle Proben innerhalb einer bestimmten Studie in genau der gleichen Weise (z.B. gleiche Frost-Tau-Zyklen) zu verarbeiten und umfassen eine gepoolte Kontrolle in jeder Platte, um potentielle Confounder bezogen auf Unterschiede in der Probenverarbeitung unter verschiedenen Studien zu berücksichtigen. Langfristige Kryokonservierung kann die Ergebnisse der HDL-Funktion Assays43 gefährden aber relative Unterschiede in HDL Lipidperoxidation bei Proben im Rahmen einer Studie können noch bewertet werden, wenn eine entsprechende gepoolten Steuerelement verwendeten 27ist, 28.

Wichtig ist, sind vorherige HDL-Funktion-Assays nicht standardisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, wo Einsatz geeigneter Kontrollen Standardisierung von der Anzeige gewährleistet. Mehr speziell gibt es mehrere bekannte Parameter, die das Auslesen von biochemischen Assays HDL beeinträchtigen können funktionieren wie Matrixeffekte (Serum Vs Methode der Plasma-Vorbereitung), Vorhandensein von Albumin und andere Proteine, Kryokonservierung, Einfrieren-Auftauen 32. der HDL-Funktion Fluorochrom Assay kann mit dem Einsatz von handelsüblichen Standards und experimentelle Reagenzien32standardisiert werden. Allerdings gibt es auchmehrere unbekannte (oder schlecht gekennzeichnet) Confounder in jedem studieren und unter verschiedenen Personen, die Bestimmung von HDL beeinträchtigen können Funktion Ergebnisse. So verwenden wir in jede Platte ein gebündeltes HDL-Steuerelement aus bestimmten Exemplare des Interesses innerhalb einer bestimmten Studie (die identisch verarbeitet wurden), die Artefakte und Confounder32minimiert vorbereitet. Verwendung von Plasmaproben Blutbank und HDL-C-Werte aus dem klinischen Labor kann die Assay-32weiter standardisieren.

Wir haben bereits gezeigt, dass verschiedene Methoden der HDL Isolation das Auslesen der biochemischen Assays von HDL-Funktion 27,28,32 erheblich beeinträchtigen können aber die Fluorochrom zuverlässig HDLox unabhängig messen kann der HDL Isolierung 32. HDL-Isolationsmethoden sind ein wichtiger Begrenzungsfaktor für Hochdurchsatz-Studien der HDL-Funktion. Ultrazentrifugation gilt heute die Referenzmethode bleibt jedoch eine Zeit raubende Methode52. Elektrophorese ist ungenau und nicht standardisiert 53. HDL Niederschlag Methoden beinhalten die Verwendung von Polyanions wie Polyethylenglykol (PEG), geringer Dichte Lipoproteine verlassen die HDL überstand 54auszufällen. Obwohl diese Methoden auf bestimmte Nachteile wie Variable Ergebnisse mit Lipämische Seren und Interferenzen mit enzymatischen Cholesterin Verfahren 55 vorherige Änderungen angezeigt standardisiert das ursprüngliche Verfahren mit handelsüblichen Reagenzien ergeben eine einfache, zuverlässige und genaue Verfahren56. Zwar PEG Niederschläge häufig verwendete Methode, HDL21,57 aus Patientenserum zu isolieren, ist ein wichtiges Thema-HDL Proteine wie Albumin58. Immunoaffinitäts Isolierung kann verwendet werden, um die Wirkung von Albumin auf HDL-Funktion 32zu minimieren. Obwohl relative Unterschiede in HDLox für eine bestimmte Capture-Methode bewertet werden können, können spezifische Antikörper gegen HDL HDL Strukturen nicht vollständig erfassen. Mit Hilfe geeignete Kontrollen, wie in diesem Protokoll beschrieben, können relative Unterschiede im HDLox zwischen HDL Exemplare (isoliert durch PEG-Fällung) zuverlässig ermittelt werden.

Dieser Assay, wie alle anderen Tests der HDL-Funktion, hat wichtige Einschränkungen. In Vivo Oxidation von HDL in der Arterienwand ist sehr komplex und heterogen und Peroxid Lipidgehalt spiegeln nur teilweise HDLox46. HDL-Struktur und Funktion ändert sich kontinuierlich in Vivo und Messung der HDL-Funktion auf einem Timepoint spiegeln nicht die Auswirkungen der HDL Dysfunktion bei Ende Orgel Krankheit über Zeit59. Es ist nicht bekannt, ob das HDLox Auslesen von HDL-Cholesterin und HDL Protein 22normalisiert werden sollen. Zukünftige Studien sollten wie wichtig es ist, dass das Auslesen des Assays (HDL Peroxid Fettgehalt pro mg HDL-C) validieren.

Zusammenfassend ist die Fluorochrom HDL-Funktion Test eine zuverlässige Methode zur Bestimmung des HDL Lipidgehalts Peroxid pro spezifische Menge an HDL (HDLox). Höhere HDLox Werte sind verringerte HDL antioxidative Funktion zugeordnet. Das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen der Herz-Kreislauf-Krankheit, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. diese Methode bietet eine günstige und dennoch robuste Werkzeug zur Untersuchung der Rolle von HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit.

Offenlegungen

Dieses Protokoll und Test sind relevant für das patent PCT/US2015/018147.

Danksagungen

Die Autoren erkennen dankbar die Arbeit von Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman und Srinivasa Reddy für ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung der früheren Iterationen dieses Modells. T.A.A. wird unterstützt durch eine RMIT University Vice-Chancellor Postdoctoral Fellowship. AJ und AH werden durch NHMRC Projekt Grant 1108792 unterstützt. TK stützt sich auf NIH gewährt NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating ReagentPointe ScientificH7511
Amplex Red reagent.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated ReagentThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).Sigma AldrichM0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).Sigma AldrichM9936
1.5 mL Eppendorf tubesEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, sterileThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-387--955
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
Gen5 2.01 softwareBiotek, Vermont, USANA
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Gen5 Plate readerBiotek, Vermont, USANA

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