Ultraschall-basierte Pulswellengeschwindigkeit Auswertung bei Mäusen

Arterielle Steifigkeit ist ein wichtiger Faktor bei der Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Pulswellengeschwindigkeit (PWV) als Surrogat-Index für die arterielle Steifigkeit berücksichtigt werden. Dieses Protokoll beschreibt Algorithmus eine Bildverarbeitung für die in Mäusen PWV Berechnung auf Ultraschallbildverarbeitung basieren, die an verschiedenen Standorten arteriellen anwendbar ist.

Arterielle Steifigkeit kann durch Berechnung der Pulswellengeschwindigkeit (PWV) ausgewertet werden, das heißt, die Geschwindigkeit , mit der die Pulswelle in einer Leitung Gefäß bewegt. Dieser Parameter wird zunehmend in Kleintiermodellen untersucht, in dem sie für die Beurteilung der Veränderungen in der vaskulären Funktion auf bestimmte Genotypen / Behandlungen oder zur Charakterisierung von kardiovaskulären Krankheitsprogression Zusammenhang verwendet wird. Dieses Protokoll beschreibt Verarbeitungsalgorithmus ein Bild, das bei Mäusen nicht-invasiven arteriellen PWV-Messung führt unter Verwendung von Ultraschall (US) Bilder nur. Die vorgeschlagene Technik verwendet worden ist PWV abdominalen Aorta bei Mäusen zu bewerten und ihre altersbedingten Veränderungen zu bewerten.

Abdominalen Aorta US Scans von Mäusen unter gasförmigem Anästhesie mit einer spezifischen US Gerät mit Hochfrequenz US Sonden ausgestattet ist. B-Modus und Pulse-Wave-Doppler (PW-Doppler) Bilder werden analysiert, um Durchmesser zu erhalten und die mittlere Geschwindigkeit Momentanwerte bzw.. Zu diesem Zweck Kantenerfassungs und Konturverfolgungstechniken verwendet werden. Die Single-beat mittlerer Durchmesser und Geschwindigkeitsverläufe sind zeitlich aufeinander abgestimmt und kombiniert, um den Durchmesser-Geschwindigkeit (lnD-V) Schleife zu erreichen. PWV Werte werden aus der Steigung des linearen Teils der Schleife erhalten wird, die der frühen systolischen Phase entspricht.

Mit dem vorliegenden Ansatz, anatomische und funktionelle Informationen über die Maus kann Bauchaorta nicht-invasiv erreicht werden. nur die Verarbeitung von US Bilder erfordert, kann es ein nützliches Werkzeug für die nicht-invasive Charakterisierung verschiedener arteriellen Stellen in der Maus in Bezug auf die elastischen Eigenschaften repräsentieren. Die Anwendung der vorliegenden Technik kann leicht auf andere Gefäßbezirke ausgedehnt werden, wie der Arteria carotis, wodurch die Möglichkeit Bereitstellen eines Multi-Site-arterielle Steifigkeit Beurteilung zu erhalten.

Mausmodelle werden in zunehmendem Maße für die Untersuchung von Herz - Kreislauf - Erkrankungen (CVD) verwendet , und besonders in Langzeitstudien eingesetzt , die die Charakterisierung der verschiedenen Phasen der Krankheitsentwicklung ¹ ermöglichen. Elastischen Eigenschaften von großen Arterien sind verschiedenen pathologischen Zuständen im Zusammenhang; Aus technischer Sicht kann arterielle Steifigkeit durch die Messung der Pulswellengeschwindigkeit (PWV) beurteilt werden, die die Geschwindigkeit , mit welcher repräsentiert reist die Pulswelle in einem Leitungsgefäß ^2. Wegen seiner klinische Bedeutung, wird es zunehmend auch in vorklinischen kleinen Tiermodellen ³ gemessen.

Verschiedene Techniken sind für PWV Beurteilung bei Mäusen. Invasive Ansätze basieren auf der Verwendung von Katheter-Spitze Drucksensoren basieren. PWV wird durch Erfassen von Drucksignalen an zwei unterschiedlichen Standorten arteriellen und Dividieren des Abstandes zwischen den beiden Mess s beurteiltites durch die Zeitverschiebung zwischen den Signalen ^4. Der Hauptnachteil dieser Arten von Techniken verwandt ist, dass sie Tieropfer zur Auswertung des Abstandes zwischen den beiden Messstellen erfordern und kann somit nicht in Langzeitstudien verwendet werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, nicht-invasive Ansätze, basierend auf verschiedenen bildgebenden Verfahren, sind entwickelt worden. Frühere Studien haben PWV Einschätzungen berichtet ⁶ bei Mäusen durch die Anwendung der Laufzeitverfahren auf Geschwindigkeit codierten Magnetresonanztomographie - Daten ⁵ und Pulsed-Doppler - Signale erhalten. Allerdings ist der PWV-Wert mit diesen Methoden erhalten eine regionale Auswertung der arteriellen Steifigkeit. Tatsächlich stellt es einen Mittelwert für verschiedene Arterien in Bezug auf Größe und elastischen Eigenschaften ausmachen. Darüber hinaus erfordern diese Arten von Auswertungen der Beurteilung der Abstand zwischen den beiden Messstellen, die eine Fehlerquelle ist, die inf könnteluence das Endergebnis.

PWV kann mit dem Durchmesser-Geschwindigkeit (lnD-V) Schleife ⁷ beurteilt werden. Dieses Verfahren basiert auf der gleichzeitigen Auswertung des Durchmessers und Strömungsgeschwindigkeitswerte in einem ausgewählten Gefäß. Nach diesem Ansatz wird die lnD-V-Schleife durch Auftragen natürlichen Logarithmus Durchmesser erhaltenen Werte vs bedeuten Geschwindigkeitswerte und PWV wird durch Berechnung der Steigung des linearen Teils der erhaltenen Schleife entsprechend der frühen systolischen Phase geschätzt. Im Hinblick auf die praktische Umsetzung dieser Methode haben frühere Arbeiten bereits berichtet , Ergebnisse über seine Anwendung in einem in - vitro - Set-up - System ⁷ und dessen Verwendung für die Beurteilung sowohl der Karotis und Oberschenkel PWV beim Menschen ^8.

Das Hauptziel der vorliegenden Studie ist eine detaillierte Beschreibung eines Bildverarbeitungsalgorithmus zur Verfügung zu stellen, die eine nicht-invasive arterielle PWV Messung in Mäusen unter Verwendung von U liefertS-Bilder. Der vorgeschlagene Ansatz ermöglicht die Auswertung der lokalen Arteriensteifigkeit mittels der Verarbeitung von sowohl B-Mode- und Doppler Pulsed-Wave (PW-Doppler) Bilder und kann auf Arterien von entscheidender Bedeutung, wie beispielsweise der abdominalen Aorta eingesetzt werden.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie (2010/63 / UE) und dem italienischen Gesetz (D.Lvo 26/2014) durchgeführt, und es folgte Prinzipien der Labortierhaltung. Die lokale ethischen Zulassung Gremium genehmigte die Studie.

1. Imaging Verfahren

1. Platzieren Sie die Maus in einer Anästhesieinduktionskammer gefüllt mit 2,5% Isofluran in 1 l / min reinem Sauerstoff. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Teilnahmslosigkeit bis Fuß Prise.
2. Legen Sie das Tier auf einer temperaturgeregelten Bord in Rückenlage. Befeuchten Sie die Augen des Tieres mit Augensalbe, um zu vermeiden, dass sie trocken läuft. Versorgen Anästhesiegasstrom (1,5% Isofluran) mit der Maus die Nase in der speziellen Nasenkegel platzieren. Falls nötig, den Prozentsatz von Isofluran von Fall zu Fall in Abhängigkeit von dem Tier untersucht. Befestigen Sie die Platinentemperatur bei 40 ° C.
3. Bestreichen Sie die vier Gliedmaßen des Tieres mit einer leitfähigen Paste und klebt sie auf den EKG-Elektroden in den eingebettetenTafel. Messen der Körpertemperatur mit einer rektalen Sonde mit Vaseline geschmiert. Überprüfen Sie, ob alle physiologischen Messungen (EKG und Atmungssignal sowie Temperatur) korrekt erfasst und angezeigt.
4. Entfernen Sie Haare chemisch aus dem Bauch mit Enthaarungscreme und streicht es mit akustischer Kopplung Gel.
5. Setzen Sie den (13-24 MHz) US-Sonde in dem mechanischen Arm.
6. Befestigen Sie die US-Sonde parallel zum Tier und stellen Sie ihre Position, um Längs Bilder der Bauchaorta mit der Region von Interesse in der Fokuszone zu erhalten.
7. Sammeln Sie anatomischen Informationen.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche ermöglicht die hohe Bildrate EKG-getriggerte Akquisition ^9, wählen Sie eine Bildrate Erwerb gleich 700 fps und die Übernahme starten. Anmerkung: Auf diese Weise anatomischer Bilder des Behälters zu einem einzigen Herzzyklus bezogen erworben werden.
8. Sammeln Sie Strömungsgeschwindigkeit Informationen. </ Strong>
   1. Mit dem gleichen Scan-Projektion, klicken Sie auf den PW-Doppler-Taste, legen Sie das Probenvolumen in der Mitte des Schiffes und Bilder aufzunehmen, um sicherzustellen, dass die Filmschleife nicht kürzer als 3 s ist. Erhalten diese Daten die Winkelkorrektur so klein wie möglich gehalten wird, es von Fall Einstellung erhalten auf der Basis des US Projektions zu Fall verschieden.
9. Nehmen Sie das Tier von der Temperatur gesteuert Bord und warten auf vollständige Genesung.
   HINWEIS: Nach unserer Erfahrung dieses etwa 10 min dauert. verlassen und Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.

2. Post-Processing

1. Export B-Modus und PW-Doppler-Bilder als DICOM-Dateien und sie auf einem PC speichern. Trans PW-Doppler-DICOM-Dateien in TIFF-Bilder.
2. Verfahren B-Modus - Bilder.
   1. Importieren Sie die entsprechenden DICOM-Datei die dedizierte Graphical User Interface (GUI).
   2. Um Konturen initialisieren, eine Linie in der Nähe der gegenüberliegenden Wand des Schiffes ziehen (Klick es für den Start und doppelklicken Sie zum Beenden it) und doppelklicken Sie nahe an der nahen Wand. Eine Linie, die parallel zu dieser nahe an der gegenüberliegenden Wand wird automatisch angezeigt. Wenden Sie den Algorithmus auf einem einzigen Frame mit der "Analyse" Taste drücken.
   3. Überprüfen Sie das Ergebnis. Wenn die Kanten korrekt identifiziert wurden (dh., Die Entwicklung der initialisierten Punkte erkannt haben sowohl die hintere und die vordere Wand), wenden Sie den Algorithmus , der auf der ganzen cine-Schleife , indem Sie auf die Schaltfläche "GO" klicken. Wenn die Kanten nicht richtig erkannt werden, deaktivieren Sie sie auf "Clear Contour" durch Klicken und initialisieren sie wieder nach Punkt 2.2.2 zu wiederholen.
      HINWEIS: Der Algorithmus auf Flankendetektions und Konturverfolgungstechniken basieren und im Detail ¹⁰ zuvor beschrieben wurde.
   4. Beziehen Sie das Endergebnis auf den "RECORD" Taste drücken und speichern Sie die korresponding .mat-Datei, die auf einem einzigen Herzzyklus im Zusammenhang mit Momentandurchmesserwerte enthält.
3. Öffnen Sie die GUI für die lnD-V Schleife Umsetzung.
4. Klicken Sie auf die "Geschwindigkeit" Taste , um PW-Doppler - Bildverarbeitung zu beginnen , die zu einem einzigen Schlag führt Geschwindigkeitskurve bedeuten.
   1. Identifizieren Sie die PW-Doppler-Kurve und die Zeile auf einen Geschwindigkeitswert entspricht, gleich Null ist durch die "WHITE LINE" -Taste drücken.
   2. Führen Geschwindigkeitskalibrierung und Zeitkalibrierung durch die "Geschwindigkeit" mit und "TIME" Tasten (im Kalibrier-Panel) sind. Durch Drücken auf diesen Tasten ermöglicht man eine Linie, deren Länge entspricht der Kalibrierungsfaktor eingefügt zu ziehen.
   3. Manuell einen ROI wählen die physiologischen Signale mit dem "ROI PHYSIO" Button enthält.
   4. Manuell einen ROI wählen Sie das PW-Doppler-Kurve durch Drücken der "ROI SIGNAL" Button enthält.
   5. click auf der "Analyse" und prüfen Sie, ob der Umschlag identifiziert wird. Wenn das Ergebnis nicht zufriedenstellend ist, ändern die Schwelle (durch den neuen Wert in der "Geschwindigkeitsschwelle" editierbares Textfeld eingeben) und drücken Sie die "Analyse" -Taste erneut. Tune die Schwelle von Fall zu Fall in Abhängigkeit von der Qualität der Bilder. Drücken Sie die "AUSARBEITUNG" -Taste.
   6. Suchen Sie die R-Zacken des EKG-Signals und teilen Sie die Geschwindigkeit Hüllkurvensignal entsprechend durch die Schaltfläche "Aktualisieren" klicken. Wählen Sie Beats, die durch Lärm nicht beschädigt sind oder in der Inspirationsphase befindet, indem Sie auf "Choose BEATS" klicken. Auf diese Weise erhalten ein Single-Beat Geschwindigkeitswellenform bedeuten.
5. Verwenden Sie die Fast - Fourier - Transformation - Methode die ausgewählten Beats in der Frequenzdomäne zu interpolieren und sie alle die gleiche Anzahl von Punkten zusammengesetzt, wie in Referenz ¹¹ beschrieben. Führen Sie diesen Vorgang automatisch, indem einfach die ret drückenUrne Taste auf der PC-Tastatur, sobald die Beats ausgewählt wurden. Wenn die "VELO MEAN" , um das einzelne Takt geprüft bedeuten Geschwindigkeitssignal durch Division der maximalen Geschwindigkeitskurve durch zwei erreicht wird, eine parabolische Geschwindigkeitsprofil hypothesizing ^12. Drücken Sie die Taste "OK".
6. Klicken Sie auf den "Diameter" -Taste. Interpoliert die Single-Takt Durchmesser Wellenform in der Zeitdomäne, um einen einzigen Schlag Durchmessersignal mit der gleichen Abtastfrequenz wie die Single-Beat Geschwindigkeitssignal durch Drücken der "INTERPOLATE" Taste zu erhalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK".
   HINWEIS: Um die Single-Takt Durchmesser und Geschwindigkeitskurven mit der gleichen Samplefrequenz und die gleiche Anzahl von Datenpunkten bedeuten, sie in der Frequenzdomäne interpoliert werden.
7. Wählen Sie die "zweite Ableitung" Ansatz als Ausrichtungsmethode (über dem Diagramm die Darstellung der Durchmesser und die Geschwindigkeit Wellenformen) und klicken Sie auf den "UPDATE" button. Die beiden Kurven werden automatisch zeitlich ausgerichtet die zweite Ableitung Verfahren ¹⁴ verwendet wird .
8. Erstellen Sie die endgültige lnD-V-Schleife durch den natürlichen Logarithmus der einzelnen Schlag Durchmesserwerte gegenüber dem Einzelschlag Plotten Geschwindigkeitswerte bedeuten. Dies geschieht automatisch, wenn die beiden Wellenformen ausgerichtet sind. Anmerkung: Die Punkte zwischen 5% und 90% des Maximalwertes des Einzelschlag bedeuten Geschwindigkeitskurve eingeschlossen werden automatisch und in eine lineare Interpolation auf diese Punkte wird angewendet, um die Neigung des linearen Teils der Schleife zu bewerten.
9. Berechnen PWV gemäß der folgenden Gleichung ⁷
   

Der vorgeschlagene Ansatz wurde an Mäuse abdominalen Aorta in einer früheren Studie ¹¹ angewendet. Die folgenden Abbildungen zeigen die Ergebnisse der Anwendung der beschriebenen Ansatz auf realen Mäuse Bilder. Diese Daten stammen aus einem einzigen Tier (Wildtyp - Mäuse, 13 Wochen alt, Stamm: C57BL6, Gewicht: 33 g) Insbesondere Abbildung 1 zeigt das Ergebnis der Analyse der US - Bildern. Kantenerkennung und Konturverfolgungstechniken angewendet, um B-Modus-Bilder mit der hohen Bildrate EKG-getriggerte erworben Modalität der Durchmesser Wellenform bereitzustellen; auf der anderen Seite führt die Identifizierung des PW-Doppler-Signal Umschlag in den Einzelschlag bedeuten Geschwindigkeitskurve Beurteilung. Die Auswertung der einzelnen Schlag mittlere Geschwindigkeit Wellenformen den Durchschnitt der Daten aus unterschiedlichen Herzzyklen umfasst. Für die Daten der Standardabweichung der Geschwindigkeitskurven dargestellt (als Mittelwert der Standardabweichung erhalten werden mitjeder Zeitpunkt) ist 0,0137 m / sec.

Einzel-Beat - Durchmesser und die mittlere Geschwindigkeit Wellenformen interpoliert werden , sowohl in der Frequenz- und Zeitbereich und dann Zeit ausgerichtet (Abbildung 2A). Die lnD-V - Schleife wird durch Auftragen der natürlichen Logarithmus Durchmesserwerte im Vergleich zu den Durchschnittsgeschwindigkeitsmessungen erhalten wird , wie in 2B gezeigt. PWV wird durch Berechnung der Steigung des linearen Teils der Schleife beurteilt, die der frühen systolischen Phase entsprechen, bekannt ist. Dieser Teil wird als die entsprechend der Steigung der mittleren Geschwindigkeitskurve automatisch identifiziert. Diese Zahlen zeigen , dass die Bildverarbeitungsoperationen für die Durchführung des vorgeschlagenen Technik erforderlich führt zu einer endgültigen lnD-V - Schleife, die derjenigen beim Menschen erhaltenen ähnlich ist unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes ^7. Dies legt nahe, dass diese Technik eine gültige Alternative für nicht-invasive Beurteilung PWV in Mäusen darstellen.

Abbildung 2: Die Umsetzung der lnD-V - Schleife für PWV Berechnung. Durchmesser und mittlere Geschwindigkeit Wellenformen aus dem B-Modus und PW-Doppler-Bildverarbeitung erhalten. (A). Die lnD-V-Schleife wird durch Auftragen der natürlichen Logari erhaltenthm der Durchmesserwerte gegen die mittlere Geschwindigkeitswerte (b). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

In dieser Studie Algorithmus eine Bildverarbeitung auf der Schleife lnD-V-Basis für PWV Beurteilung in Mäusen wurde im Detail beschrieben. Der vorgeschlagene Ansatz beruht auf der Verarbeitung von Bildern US basierend nur und somit ⁶ eine gültige Alternative zu bestehenden Techniken darstellen ^{könnten, 13} zur Beurteilung der arteriellen Steifigkeit in Mausmodellen. In der Tat umgekehrt zu invasive Methoden ⁶ , die auf den Erwerb von intraarterieller Drucksignale und erfordern das Tier geopfert werden basieren, ist diese Technik vollständig nicht-invasiv und können somit als besonders geeignet im Falle von Langzeitstudien. Darüber hinaus bietet es eine Bewertung der arteriellen Steifigkeit, die lokalen und nicht regional ist. Obwohl das vorgeschlagene Verfahren ist bekannt durch die reflektierte Welle ¹⁵ beeinflusst zu werden, kann es eine genauere PWV Beurteilung in Bezug auf andere US-basierte Ansätze für lokale PW liefernV Beurteilung, wie die auf der Grundlage der Strömungsbereich Technik ^13, der die Übernahme von Farbflussdaten in der Querschnittsprojektion erfordert. Der PWV - Wert im "Repräsentative Ergebnisse" Abschnitt gezeigt wird , gleich 1,69 m / sec, steht im Einklang mit dem, was in Bezug berichtet wird , ^11: in der Tat, in dieser Studie PWV abdominalen Aorta war gleich 1,91 ± 0,44 m / sec in erwachsenen Mäusen und 2,71 ± 0,63 m / sec bei alten Tieren.

Um Fehler bei PWV Einschätzungen zu minimieren, hat große Aufmerksamkeit geschenkt werden, wenn US Bilder zu erwerben. Insbesondere wird eine Durchmesserlinie zu erreichen erworben, die beschädigt ist nicht durch Rauschen B-Modus-Bilder mit sehr klaren vorderen und hinteren Wände in Ordnung sein sollte. Im Hinblick auf die PW-Doppler-Bilder, sollte die Winkelkorrektur minimiert werden. Der Wert von 60 Grad darstellen kann, in den meisten Fällen ein guter Kompromiss zwischen einer guten langen Achse und eine gute Annäherung der Geschwindigkeitskomponenten. FurthermoRe, sollte im Falle von Langzeitstudien mit wiederholten Messungen, Pflege in Abbilden des Gefäßes in der gleichen Weise entnommen werden, also mit der gleichen Scan - Projektion.

Die wichtigste Einschränkung der vorgestellte Ansatz bezieht sich auf die Tatsache, dass die Bilder für den Durchmesser erforderlich und mittlere Geschwindigkeit Wellenform Bewertungen werden nicht gleichzeitig erfasst. Dieser Mangel an Gleichzeitigkeit kann eine Fehlerquelle für PWV Beurteilung darstellen und die Messung weniger genau machen. Darüber hinaus würde garantieren eine echte simultane Erfassung eine bessere zeitliche Ausrichtung zwischen den beiden Kurven und auf die Herzfrequenzvariabilität verbundenen Probleme zu vermeiden. Aus praktischer Sicht könnte eine weitere Einschränkung der Mangel an Verfügbarkeit der hohen Bildrate EKG-getriggerte Modalität sein. Dieses Problem kann teilweise durch den Erwerb von Bildern in den Parametern B-Modus-Modalität und die Anpassung der Akquisition überwunden werden, um die höchste zeitliche Auflösung zu erreichen. In diesem Fall sollte der Durchmesser Signaldurch die ECG Basis und verarbeitet in der gleichen Weise wie das Geschwindigkeitssignal zu teilen, um ein einzelnes Schwebungswellenformdurchmesser zu erhalten. Jedoch kann in einigen Bedingungen wird der erhaltene zeitliche Auflösung nicht geeignet sein, ein gültiges Signal Durchmesser zu erreichen. Zukünftige Änderungen der Bildverarbeitungskette zu unterstützen, diese Einschränkungen zu überwinden, die Technik zu verbessern und zu einer genaueren Einschätzung der lokalen arteriellen Steifigkeit führen.

Zukünftige Anwendungen der vorgestellte Ansatz würde andere arterielle Bezirke betreffen. Wirksam, dank der Tatsache, dass es die Übernahme der B-Modus und PW-Doppler-Bilder nur erfordert, kann dieses Verfahren leicht auf andere arteriellen Stellen, wie der Arteria carotis angewendet werden, wodurch eine Multisite-Steifigkeits arteriellen Beurteilung bereitstellt. Eine höhere Frequenz Sonde sollte für mehr oberflächlichen Arterien, wie der Arteria carotis communis gewählt werden; in jedem Fall eine korrekte Wiedergabe der Arterie für t sicherzustellen, die Wahl der Sonde sollteer Tiere in der Studie. Abschließend kann das beschriebene System eine einfache Möglichkeit bieten, um funktionelle Eigenschaften verschiedener Arterien in Mausmodellen zu bewerten.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Keiner.