Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Im letzten Jahrzehnt gab es ein Wiederaufleben in der Verwendung von Pflanzenprotoplasten gegeben, die von Modellarten reichen Spezies zu beschneiden, für die Analyse von Signalwegen, Transkriptionsregulationsnetzwerke, die Genexpression, Genom-Bearbeitung und Genin. Darüber hinaus wurden erhebliche Fortschritte bei der Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten hergestellt worden, die noch mehr Interesse an der Nutzung dieser Systeme für Pflanzengenom erzeugt hat. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Automatisierung der Isolierung von Protoplasten und Transformation von einem 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Tabaksuspensionskultur unter Verwendung einer Roboterplattform entwickelt. Die Transformationsverfahren wurden unter Verwendung eines orangefarbenen fluoreszierendes Protein (OFP) Reportergen (pporRFP) unter der Steuerung des Mosaikvirus 35S-Promotor Cauliflower validiert (35S). OFP-Expression in Protoplasten wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Analysen enthalten auch Protoplasten Produktionseffizienz Methoden propidium Jodid. Schließlich wurden Low-Cost-Lebensmittel-Grade-Enzyme für die Protoplasten-Isolierungsverfahren verwendet, wodurch die Notwendigkeit für Labor-Grade Enzyme zu umgehen, die im Hochdurchsatz automatisierte Isolierung von Protoplasten und Analyse zu kostspielig sind. Basierend auf dem Protokoll in dieser Arbeit entwickelt wurde, kann der gesamte Vorgang von Isolierung von Protoplasten zur Transformation durchgeführt werden, in weniger als 4 Stunden, ohne Eingabe vom Bediener. Während das Protokoll in dieser Arbeit entwickelte mit der BY-2-Zellkultur bestätigt wurde, sollten die Verfahren und Methoden auf jede beliebige Pflanze Suspensionskultur / Protoplasten System übersetzbar sein, die Beschleunigung von Pflanzengenomforschung ermöglichen soll.

In den letzten Jahren hat es erhebliche Impulse auf die Gestaltung von transgenen Kulturen gelegt worden , um verschiedene Krankheiten ^1, verleihen Herbizidresistenz ^2, verleihen Dürre ^3,4 und Salztoleranz ^5, verhindern Herbivorie ^6, erhöhen Biomasseertrag ⁷ und verringern Zellwand Widerspenstigkeit überwinden ^8. Dieser Trend wurde durch die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge zur Erzeugung transgener Pflanzen Aided, einschließlich Genom-Bearbeitung mit CRISPR und Talens ⁹ und Gen durch dsRNA - Silencing ^10, miRNA ¹¹ und siRNA ^12. Während diese Technologien die Erzeugung transgener Pflanzen vereinfacht haben, haben sie erstellt auch einen Engpass, wo die schiere Anzahl der transgenen Pflanzen erzeugt wird, nicht traditionellen Systemen mit gescreent werden, die auf die Pflanzenregeneration verlassen. Im Zusammenhang mit diesem Engpass, während zum Schweigen zu bringen und Genom-Editing-Konstrukte schnell in Pflanzen eingeführt werden kann, sind viele dergezielte Züge nicht den gewünschten Effekt zu erzeugen, die oft erst entdeckt, wenn Pflanzen im Gewächshaus analysiert werden. In dieser Arbeit haben wir ein Verfahren zur schnellen, automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenprotoplasten entwickelt, die speziell den aktuellen Engpass in der frühen Screening einer großen Anzahl von Genombearbeitung und Gen-Silencing Ziele zu adressieren.

Die Verwendung von Protoplasten zu intakten Pflanzenzellen gegenüber, hat mehrere Vorteile für die Entwicklung eines automatisierten Plattform. Zuerst Protoplasten werden aber nach Aufschluss der Pflanzenzellwand isoliert und mit dieser Barriere nicht mehr vorhanden ist , wird die Transformationseffizienz ¹³ erhöht. In intakten Pflanzenzellen gibt es nur zwei etablierte Methoden zur Transformation, Biolistik ¹⁴ und Agrobacterium -vermittelte Transformation ^15. Keines dieser Verfahren kann leicht an Liquid-Handling-Plattformen übersetzt werden, wie Biolistik erfordert spezielle Ausrüstung für transformation, während Agrobacterium -vermittelte Transformation erfordert Kokultur und anschließende Entfernung der Bakterien. Weder sind zugänglich für Hochdurchsatzverfahren. Im Falle von Protoplasten wird routinemßig Transformations ^16, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) -vermittelte Transfektion durchgeführt , die nur mehrere Lösungs Austausch erfordert, und ist ideal für Liquid - Handling - Plattformen geeignet. Zweitens, Protoplasten, per Definition, Single-Zellkulturen sind, und damit die mit Verklumpung und Kettenbildung verbundenen Probleme in pflanzlichen Zellkulturen, die nicht in Protoplasten beobachtet. Im Hinblick auf die schnelle Screening eine plattenbasierte Spektrophotometer, Verklumpung von Zellen, oder Zellen in mehreren Ebenen werden in den Erwerb konsistente Messungen zu Schwierigkeiten führen. Da Protoplasten auch dichter ist als die Kulturmedien sind, sedimentieren sie auf den Boden des Wells, um eine Monoschicht bilden, die für plattenbasierte Spektrophotometrie förderlich ist. Schließlich, während Pflanzenzellkulturen sind primarily aus Kallus ¹⁷ abgeleitet, Protoplasten können aus einer Anzahl von Pflanzengeweben geerntet werden, zu der Fähigkeit führt die gewebespezifische Expression zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, Wurzel- oder blattspezifische Expression eines Gens kann sehr wichtig sein, um Phänotyp Vorhersage zu analysieren. Aus diesen Gründen sind die in dieser Arbeit entwickelten Protokolle wurden validiert Protoplasten isoliert von der weit verbreiteten Tabak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Suspensionskultur mit.

Die BY-2 - Suspensionskultur wurde als "HeLa" Zelle von höheren Pflanzen beschrieben worden ist , wegen seiner allgegenwärtigen Einsatz in der molekularen Analyse von Pflanzenzellen ^18. Kürzlich wurden BY-2 - Zellen verwendet , um die Effekte der Pflanze zu untersuchen Stressoren ^19-22, intrazelluläre Proteinlokalisation ^23,24 und Grund Zellbiologie ^25-27 der breiten Verwendbarkeit dieser Kulturen in Pflanzenbiologie demonstriert. Ein zusätzlicher Vorteil der BY-2 Kulturen ist dieFähigkeit , die Kulturen mit Aphidicolin zu synchronisieren, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit für Genexpressionsstudien führen kann ^28. Darüber hinaus wurden für die Extraktion von BY-2 - Protoplasten unter Verwendung von Low-Cost - Enzyme ^29,30, als Enzyme traditionell verwendet zur Erzeugung von Protoplasten sind unerschwinglich für Hochdurchsatz - Systeme Methoden entwickelt. Als solches beschriebene Protokoll unter validiert wurde die BY-2-Suspensionskultur verwendet, aber es sollte auf jede Pflanzenzellsuspensionskultur abänderbar ist. Proof-of-Concept - Experimente werden mit einem Orange - Fluoreszenz - Protein (OFP) Reporter - Gen (pporRFP) von den Hartkorallen Porites ausgeführt Porites- ³¹ unter der Kontrolle des CaMV 35S - Promotors.

1. Einrichtung Suspension Zellkulturen

1. Bereiten Flüssigkeit BY-2 - Medien durch Zugabe von 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal Medium, 30 g Saccharose, 200 mg KH ₂ PO ₄ und 200 & mgr; g von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) zu 900 ml destilliertem Wasser und pH-Wert auf 5,8 mit 0,1 M KOH. Nach dem Einstellen des pH, passen auf 1000 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven Endvolumen. Medien können bei 4 ° C zu 2 Wochen gelagert werden.
2. Beimpfen eines 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der Flüssigkeit BY-2-Medien und einem einzigen Stück BY-2 Kallus (> 1 cm Durchmesser) gezüchtet auf festen BY-2-Medien (flüssig BY-2-Medien mit Zusatz von 1% Agar) und Dichtung mit Aluminiumfolie. Inkubiere Kultur bei 28-30 ° C unter Schütteln für 5 Tage.
   HINWEIS: BY-2-Kallus wird auf festen Medien zur Langzeitlagerung aufrechterhalten, wie Flüssigkulturen schnell überwuchern wird. Kultur Volumen kann je nach Bedarf eingestellt werden, in der Regel eine 100-ml-Kultur fähig sein wird, dreiunddreißig 6-w des Ladensell-Platten.
3. Transfer 2 ml log-Phase BY-2-Kultur zu 98 ml frischem BY-2-Medien und Inkubation für 5-7 Tage bei 28-30 ° C unter Schütteln.
   Hinweis: Sub-Kultivierung von etablierten Flüssigkulturen können regelmäßig durchgeführt werden, unter Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von 5-7 Tage alten Kulturen, anstatt Inokulation mit Kallus.
4. Mischen Sie die Kultur gründlich, wie Zellen sich schnell absetzen und Transfer 6 ml der Zellkultur zu einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Zellen für mindestens 10 min absetzen. Stellen Sie das gepackte Zellvolumen auf 50% des Gesamtvolumens von Überstand zu entfernen.
5. Shake Tube durch Umdrehen und pipettieren 500 ul in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Verdauung. Verwenden Sie weiter Bohrung Pipetten, die Zellen in diesem Stadium zu übertragen, da sie dicht sind und verstopfen Standard-Pipettenspitzen.

2. Isolierung von Protoplasten

1. Schalten Sie alle Komponenten des Robotersystems (Abbildung 1A) und öffnen Sie die Platte mover Prüfvorgänge planen weichWare. Die Task-Scheduling-Programm integriert die Mikromaschine mit den anderen Geräten Übertragung von Platten zwischen den einzelnen Geräten zu ermöglichen.
2. Vor dem Experimentieren, definieren Sie die technischen Spezifikationen für die Laborgeräte (zB Platten, Deckel) in das verwendete Protokoll sowie Start- und Endposition für jedes Stück labware, in der Platte Mover Software wie folgt:
   1. Klicken Sie auf Setup aus dem Hauptwerkzeugleiste in der Platte Mover Software und wählen Sie das Verwalten von Containertypen Befehl.
   2. Wenn der Behältertyp wird in der bestehenden Containertyp Bibliothek aufgeführt, dann wählen Sie den entsprechenden Container.
   3. Wenn der Behältertyp nicht in der vorhandenen Container Typbibliothek aufgeführt wird und klicken Sie auf Hinzufügen eines neuen Containertyp angeben.
   4. Einen neuen Behältertyp, legen Sie die Dimensionen des neuen Behälters (Höhe, Breite, Stapelabmessungen und Greifer Offset) in den entsprechenden Registerkarten und klicken Sie auf Speichern Nach dem Hinzufügen.
      1. Wenn die richtigen Abmessungen des Herstellers nicht verfügbar sind, dann genau bestimmen alle Dimensionen auf den Millimeter genau Sätteln mit. Fehler, die die Behälterabmessungen bei der Messung wird zu einem Ausfall der Platte Mover führen.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4.1 für alle Containertypen, die die Platte Mover begegnen. Nach Abschluss dieses Schrittes für alle Labware, ist es notwendig, den Anfang und das Ende Position für jeden Behälter (Schritt 2.2.6) zu definieren.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll die labware beinhaltet die 6-Well-Platte, die Deep-Well-Platte, und die 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte.
   6. Um die Start- und Endposition jedes Behälters zu definieren, klicken Sie auf die Start / Ende Registerkarte in einem bestimmten Protokoll. Wählen Sie zuerst die Startposition jedes Behälters. Als nächstes überprüfen Sie die Box für Lidded / Unlidded sowohl an der Start- und Endposition. Wiederholen Sie dies für alle Container.
      HINWEIS: Wenn der Behälter auf einem anderen Stück EQU gelassen werdenipment (anstelle der Platte Mover) der Endstelle kann leer gelassen werden.
3. Zu diesem Zeitpunkt manuell laden alle Platten in die Ausgangsposition für den gesamten Workflow. Laden Sie die 96-Well-fluoreszierenden Abschirmplatten in Hotel 2, 6-Well-Platten mit BY-2-Zellen in Hotel 3, eine 96 Deepwell-Platte, die für die Transformation verwendet wird, auf die Platte Heizung / Kühler Nest 2 und eine 50 ml konischen Rohr die Enzymlösung (siehe Supplemental Datei, Abschnitt 1.2.2) auf den Multimode Spender enthält.
   1. Wenn Transformation in dem Protokoll durchgeführt wird, vorge laden die 96 Deepwell - Platte mit 10 ul von Plasmid - DNA pro Well (1 ug / ul, A _260/280> 1,8), das die OFP - Reporterkonstrukt und brüten auf der Platte Heizer / Kühler bei 4 ° C. Jede Vertiefung wird für eine einzige Transformation verwendet werden, wodurch die Anzahl von Vertiefungen auf der Versuchsaufbau gefüllt abhängen.
4. Laden Sie alle Lieferungen und Platten auf dem Automated Liquid - Handling - Plattform in den dafür vorgesehenen Stellen und die Position der einzelnen Elemente in der Automatisierungssteuerungssoftware (Abbildung 1B) definieren.
   1. Legen Sie eine 96-Well - Platte vorbelastet mit 200 ul 40% PEG in MMg (0,4 M Mannit, 100 mM MgCl _2, 4 mM MES, pH 5,7) in Spalte 1, 200 & mgr; l Propidiumiodid (PI, 1 ug / ml) in Spalte 2, und 200 ul Ethanol in Spalte 3 (Nest 2), und eine Schachtel mit Pipettenspitzen im Nest 8.
   2. Die Lage des Labware in der automatisierten Liquid - Handling - Plattform - Software, wählen Sie Extras aus dem Menü und klicken Sie auf Labware Editor zu definieren.
   3. Wählen Sie die Art von labware aus dem Pull - Down - Menü oder definieren einen neuen labware geben Sie die neue Labware - Taste.
   4. Definieren Sie die Position jedes Stück labware ausgewählt durch das Hauptprotokoll Registerkarte auswählen und auf Konfigurieren Labware. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück von Labware auf der automatisierten Liquid-Handling-Plattform platziert istdefiniert, bevor das Protokoll läuft.
   5. Um die automatisierten Protokolle auslösen, klicken Sie auf das Profil Explorer - Fenster und wählen Sie den Namen des Protokolls ausgeführt werden (Isolierung von Protoplasten, Zellzahl und PEG-vermittelte Transformation).
   6. Klicken Sie auf Ausführen , um alle Geräte zu initialisieren, die in dem Protokoll verwendet wird.
   7. Schließlich wird in dem Fenster Arbeits Explorer, klicken Sie auf Arbeitseinheit hinzufügen alle Container / labware im System zu überprüfen und das automatisierte Protokoll beginnen.
      HINWEIS: Vollständige Beschreibungen der automatisierten Protokolle sind in der Supplemental-Datei enthalten.

3. Stellen Sie Standardkurve für Zellzahlen

1. Manuell konzentrieren Protoplasten in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Protoplasten / ml in einem Volumen von 1 ml. Zentrifuge Protoplasten bei 1.000 xg für 10 min, und entfernt den Überstand.
2. manuell hinzufügen 900 & mgr; l 70% Ethanol zu der Protoplastenpellet (bei 4 ° C gehalten)und resuspendieren Sie das Pellet. Inkubieren für 10 Minuten auf Eis Zellen zu fixieren.
3. Füge 100 ul PI (1 ug / ml) zu den Protoplasten, die Kerne zu kennzeichnen und den Nachweis durch den Plattenleser.
4. Last 80 & mgr; l Flüssigkeit BY-2-Medien in jeder Spalte und Zeile der 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte ab Spalte 2.
5. In der Spalte 1 einer 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte, fügen Sie 70 ul Protoplasten und 50 ul BY-2-Medien in jede Vertiefung in der Spalte.
6. Die Platte wird in Nest 6 der automatisierten Liquid-Handling-Plattform und führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung.
   1. Um eine serielle Verdünnung auf die automatisierten Liquid - Handling - Plattform durchzuführen, klicken Sie auf Wizard Serielle Verdünnungs starten und das Transfervolumen (60 ul), die Anzahl der Mischungen und Volumen (2, 70 & mgr; l), anfängliche Brunnen (Spalte 1, Zeilen AF) einstellen, Verdünnung Brunnen (Spalten 2-11, Reihen AF) und ansaugen und abgeben Eigenschaften (0,5 mm von gut unten).
   2. Nach der Einstellung der Parameter speichern eind das Protokoll führen.
      HINWEIS: Da alle Protoplasten mit PI (aufgrund Fixierung von Zellen) markiert sind, wird die Fluoreszenz ist proportional zur Konzentration Protoplasten.
   3. Nachdem die serielle Verdünnung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus Nest 9 und in den Plattenleser ein und die Standardkurve Protokoll in der Plattenleser Software.
      HINWEIS: Eine Standardkurve wird dann durch einen Vergleich der Fluoreszenz von PI (Anregung 536 nm / Emission 620 nm) in jeder Vertiefung mit der bekannten Protoplasten Konzentration erzeugt werden.
7. Nach Abschluss der Leserprotokoll Platte, entfernen Sie die Platte und sammeln Sie alle transgenen Zellen für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren wie in Biosicherheit Protokolle definiert ".

4. Die mikroskopische Analyse der Transformation

1. Entfernen Sie Platte mit transformierten Protoplasten (das Produkt der automatisierten Protokolls 3, Supplemental - Datei) von Hotel 1 des Robotersystems.
2. Wendeauf inverses Mikroskop, Kamera und Leuchtstofflampe.
3. Wählen Sie das 10X-Objektiv für die erste auf den Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und schließen Sie den Auslöser für die Leuchtstofflampe.
4. Lastplatte auf mikroskopisches System und Fokus auf den Protoplasten Hellfeld-.
5. Nachdem auf Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und öffnen Sie den Auslöser für die Fluoreszenzlampe ausgeschaltet.
6. Wählen Sie das CY3 / TRITC-Filter-Set für die Visualisierung des pporRFP Proteins durch den transgenen Protoplasten zum Ausdruck gebracht.
7. Scannen Sie jede Vertiefung die Anzahl der Protoplasten zur Bestimmung der pporRFP Fluoreszenzmarker exprimieren.
8. Berechnen der Transformationseffizienz als die Gesamtanzahl der Protoplasten, die fluoreszierenden Markierung, um die Gesamtanzahl der Protoplasten exprimiert.
9. Sammeln Sie alle Platten transgenen Zellen in zugelassenen Biosicherheit Beutel für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren enthalten, wie in Biosicherheit Protokolle "definiert.

In der gegenwärtigen Studie variierte die Verdopplungsrate des BY-2 14 bis 18 h in Abhängigkeit von der Temperatur, bei der die Kulturen wurden, im Einklang mit früheren Berichten einer mittleren Zellzykluslänge von 15 Stunden inkubiert. Mit dieser Verdopplungsrate, eine 1: 100 Ausgangs Inokulum wurde verwendet, um Kulturen zu starten, was zu Kulturen mit einem gepackten Zellvolumen (PCV) von 50% in 5-7 Tagen. In dem aktuellen Protokoll, in denen Kulturen in 200 ml Medium gezüchtet wurden, eine PCV von 100 ml wurde in 7 Tagen, die genug Zellen 33 versehen, Platten mit 6 Vertiefungen zu füllen. In Bezug auf die Protoplasten Ausbeute, die Verdauung an den im Protokoll festgelegten Bedingungen erzeugt 4,70 x 10 ⁵ ± 5,77 x 10 ³ Protoplasten pro Vertiefung, was zu 2,82 x 10 ⁶ Protoplasten pro 6-Well - Platte (2A). Basierend auf diesen Daten, 214 96-Well-Platten (70 & mgr; l Protoplasten pro Vertiefung) könnte aus einer einzigen Platte mit 6 Vertiefungen Verdauung, mit dem Potential geladen werden for zwei 6-Well-Platten gleichzeitig verdaut werden, wobei die beiden Plattenheizung / Chiller Stationen verwendet. Somit ist die maximale Anzahl von Protoplasten , die während einer einzigen dreistündigen Aufschluss Protokoll erzeugt werden kann , 5.64 x 10 ^6.

Während die Gesamtanzahl der Protoplasten pro Verdau Protokoll erzeugt eine Metrik für das System bereitstellt, ist es auch notwendig, den Verlust in Protoplastenkonzentration zu bewerten als die Protoplasten durch die verschiedenen Schritte des Protokolls übertragen werden. Als solche wurde die Konzentration der Protoplasten nach jedem Übertragungsschritt in dem Protokoll ausgewertet. Nach der Verdauung Protokoll, 1,15 x 10 ⁴ ± 1,35 x 10 ² Protoplasten wurden in jede Vertiefung der 96 tief-Well - Platten übertragen, wenn das Transformationsprotokoll durchführt oder die 96-Well - Fluoreszenzschirmplatte (2B). Sobald das Transformationsprotokoll abgeschlossen wurde, 1,23 x 10 ³ ± 4,66 x10 ¹ Protoplasten wurden auf die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen Fluoreszenzscreening (Abbildung 2C). Neben der Anzahl der Protoplasten übertragen, war es wichtig, die Lebensfähigkeit der Protoplasten, um zu bestimmen, um sicherzustellen, dass mehrere Pipettieren Stufen hat der Protoplasten nicht beschädigen.

Basierend auf den Ergebnissen aus der Lebensfähigkeitstest, 95,1 ± 0,04% der Protoplasten nach dem Verdau, 92,1 ± 0,06% nach der Übertragung auf den 96-well Fluoreszenz Abschirmblech lebensfähig waren, und 91,7 ± 16,67% nach dem Transformationsprotokoll. Trotz mehreren Pipettierschritten, gab es keinen signifikanten Unterschied (p> 0,44) zwischen irgendeiner der Proben. Zusätzlich zu dieser Maßnahme der Lebensfähigkeit wurde ein Protokoll zur Bestimmung der Konzentration von Protoplasten in jedem Stadium des Verfahrens durch Messen der Gesamtanzahl der Protoplasten, gefärbt mit PI. Wie in 3 gezeigt, wurde eine Standardkurve generated durch die Fluoreszenzintensität für bekannte Konzentrationen von Protoplasten aus dem System zu messen. Die Standardkurve war eine gute Passform (R ² = 0,967) mit der Gesamtanzahl der Protoplasten , um den Bereich von 0 bis 30.000 Protoplasten pro Vertiefung überspannt. Um die Standardkurve zu validieren, die Fluoreszenzintensität von Proben mit einer bekannten Anzahl von Protoplasten (8.125 und 24.375, berechnet unter Verwendung eines Hämozytometers) erhalten wurde, und die Anzahl von Protoplasten aus der Gleichung der Standardkurve berechnet. Basierend auf diesen Ergebnissen, prognostizierte die Standardkurve 9560 und 28.200 Protoplasten in jeder Vertiefung, 15 und 14% Fehler. Bedenkt man, dass es bei der Messung der Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer auch Variabilität ist, wurde dieser Fehler als akzeptabel erachtet.

Zusätzlich zu den Ergebnissen der Zellzahl und Lebensfähigkeit wurde das Transformationsprotokoll erfolgreichen transgenen Zellen in generieren , die OFP exprimieren (Figur 2D - F). Leider verwendet das Protokoll führte zu niedrig, ~ 2%, Transformationseffizienz, aufgrund der großen 16.028 bp binäres Plasmid in dieser Studie verwendet und da das Protokoll nicht spezifisch für die BY-2-Protoplasten optimiert. Optimierung des Transformationsprotokolls, in Bezug auf die Reagentien und Reaktionsbedingungen speziell für die BY-2-Protoplasten, wird erwartet, dass die Transformationseffizienz zu erhöhen, wie in der Diskussion erläutert. In Bezug auf dieses Protokoll wurde das Transformationsverfahren entwickelt, um die Proof-of-Concept-Weg von Isolierung von Protoplasten zur Transformation zu demonstrieren, und war erfolgreich bei der Erreichung dieses Ziels.

Nach dem erfolgreichen alle einzelnen Verfahren der Validierung, Metriken wurden für den Zeitverlauf des Protokolls von Isolierung von Protoplasten zur Transformation erhalten. Wie in Figur 4 gezeigt, ist die große Investition von Zeit während der Verdauung der Bühne verbracht, in denen 3 Stunden erforderlich war , for vollständige Verdauung der Zellwand und die Freisetzung der Protoplasten. Während dieses Vorgangs sind 18 Schleifen zwischen dem Plattenschüttler und Plattenheizung / Chiller 1 Inkubationsstation, mit der Platte Mover Bewegen der Platte zwischen den beiden Stationen laufen. Die Transferzeit zwischen dem Plattenschüttler und Plattenheizung / Kühler 1 dauert nur 8,9 Sekunden, und stellt sicher, dass die Mehrheit der Verdauung Verfahren ausgegeben Inkubation und Schütteln. Die Gesamtzeit vom Beginn des Verfahrens Laden der Enzyme durch die Multi-mode Spender abzuschließen beträgt 2,2 min. Insgesamt ist die vollständige Isolierung von Protoplasten Protokoll in 3 Stunden und 22,8 Minuten beendet. Basierend auf diesen Ergebnissen, 88% der Protoplasten-Isolierungsprotokoll ausgegeben verdauen. Nach Beendigung der Protoplasten-Isolierungsprotokoll wird das Transformationsprotokoll begonnen und innerhalb von 27,5 min abgeschlossen. Ähnlich wie bei der Isolierung von Protoplasten-Protokoll, 72% des Transformationsverfahren wird die Reaktion ausgegeben Inkubation. Der einzige andere Schritt in dem Protokolldass eine signifikante Zeitkomponente (> 10% der Gesamtverfahrenszeit) ist die Initialisierung des Protokolls durch das automatisierte Flüssigkeitshandhabungsplattform, die für 14% der Gesamtzeit in dem Verfahren entfallen. Auf diese Weise wird 86% des Protokolls bei der Initialisierung und Inkubation ausgegeben, mit nur 14% der Zeit auf Pipettieren und Transferschritte ausgegeben. Die gesamte Dauer der Isolierung von Protoplasten und Transformation war 3 Stunden, 50 Minuten und 53 Sekunden, ohne externe Eingabe vom Bediener erforderlich.

Abb . 1: Schematische Darstellung der Roboter - Plattform und die Konfiguration der automatisierten Liquid - Handling - Plattform während des Protokolls (A) Das Robotersystem besteht aus drei Plattenstapel / Hotels, die von der Plattenmaschine zugegriffen werden kann. Hotel 1 ist der designierte lidding / delidding Station, 2 Hotel ist die 96-Well-FluoreszenzPlattenstapel und Hotel 3 ist der 6-Well-Plattenstapel. Das System hat zwei Flüssigkeitslader, eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungsplattform, und eine Düsenbasis Multimode-Dispenser. Zum Heizen / die Roboterplattform Kühlung hat zwei Platten Heiz- / Kühleinheiten, zusammen mit einem Plattenschüttler, um die Platte zu mischen. Schließlich weist das System einen Monochromator-basierten Plattenlesegerät für die Fluoreszenzmess. Alle Komponenten sind in einem speziell angefertigten Sicherheitswerkbank untergebracht. (B) Startkonfiguration der automatisierten Liquid - Handling - Plattform mit Nest 2 durch das Reagenz Platte belegt und der Spitze Kasten gelegt auf Nest 8. (C) Konfiguration von automatisierten Liquid - Handling - Plattform vor dem Aufruf ein experimentelles Protokoll. Ein Deepwell - Platte auf Nest 4, eine 96-Well - Fluoreszenzschirmplatte befindet sich auf Nest 6 und die 6-Well - Platte , die Protoplasten befindet sich am Nest 5. befindet Bitte klicken Sie hier , um v IEW eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder von BY-2 - Protoplasten nach jeder Übertragung und nach der Transformation mit dem orangefarbenen fluoreszierenden Protein - Reportergens (A - C) Mikroskopische Aufnahmen von BY-2 - Protoplasten Dichte in 6-Well - Platte, 96-Well - Platte nach der Übertragung von 70. ul aus der 6-Well-Platte, und 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte nach der Transformation. (D) Hellfeldmikroskopische Aufnahme von BY-2 - Protoplasten nach der Transformation. (E) Fluorescent BY-2 - Protoplasten die OFP - Gen exprimiert visualisiert ein Cy3 / TRITC - Filtersatz verwendet wird . (F) Überlagerung von Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der geringen Effizienz der Transformation zu demonstrieren. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig . 3: Standardkurve zur Berechnung der Anzahl von Protoplasten Die Anzahl der Protoplasten in ein gut gegeben kann durch Vergleich der Fluoreszenzintensität in willkürlichen Einheiten (AU), um die Gleichung für die Standardkurve berechnet werden. Validierung der Protoplastenzahl wurde zwischen der Standardkurve und Hämozytometer an dem Punkt auf dem Diagramm angegeben, verglichen mit 9561 Protoplasten aus dem Plattenlesegerät identifiziert und 8125 auf dem Hämocytometer gezählt. Insgesamt wurde ein Fehler von 15% zwischen den beiden Techniken gefunden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abb . 4: Gantt - Diagramm für das beschriebene Verfahren zur Herstellung von BY-2 - Protoplasten und genetische Transformation Die Mehrheit des Protokolls, ~ 3 h wird auf die Verdauung der BY-2 - Zellen waren die Protoplasten zu erzeugen. Laden der Enzymlösung und Inaktivierung erfordern nur 12% der Gesamtverfahrenszeit. In ähnlicher Weise Inkubation der Transformationsreaktion auf dem Plattenschüttler entfallen 72% des Transformationsprotokolls. Insgesamt wird das Verfahren von Isolierung von Protoplasten bis genetische Transformation erreicht ist unter 4 Stunden (3 Stunden, 50 Minuten und 53 Sekunden). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende Datei: Automatisierte Protokolle für die Isolierung von Protoplasten, Zellzählung und PEG-vermittelte Transformation <./ strong> Komplett für den Einsatz in der Roboterplattform entwickelt Protokolle jeder der Aufgaben der oben aufgeführten erreichen in dieser Datei enthalten sind. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Das oben beschriebene Protokoll wurde für Isolierung von Protoplasten, Aufzählung und Transformation mit der BY-2 Tabaksuspensionszellkultur erfolgreich validiert; jedoch könnte das Protokoll leicht an jede Pflanzensuspensionskultur erweitert werden. Derzeit Isolierung von Protoplasten und Transformation wurde in zahlreichen Pflanzen, darunter Mais (Zea Mays) ^10, Karotte (Daucus carota) ^32, Pappel (Populus euphratica) ^33, Traube (Vitis vinifera) ^34, Ölpalme (Elaeis guineensis) ³⁵ erreicht , Kopfsalat (Lactuca sativa) ^36, Senf (Brassica juncea) ^37, Reis (Oryza sativa) ³⁸ und Rutenhirse (Panicum virgatum) ^39,40. Während Veränderung der Kultur und Aufschlussbedingungen auftreten von Spezies zu Spezies, in Bezug auf das Protokoll in dieser Arbeit entwickelt, Kulturmedien zu ersetzen oder die Bedingungen für die Grabung zu verändernestion sollte nicht das grundlegende Protokoll ändern. Einzustellen, um die Verdauung erforderlich auf unterschiedliche Arten, Kulturmedien und Enzyme geladen sind durch den Bediener vor der Initialisierung des Protokolls, wodurch diese Komponenten Swapping trivial. Als zusätzlichen Vorteil, ist das Protokoll mehrere Aufschlussbedingungen mit der Ausbeute an Protoplasten durch das System auch auf das Screening gemessen abänderbar. Dies ist ein wesentlicher Bestandteil, da die Verwendung von Low-Cost-Enzyme für die Hochdurchsatz-Anwendungen erforderlich sind, so ist es wichtig, die Menge an Enzymen in Verdauung verwendet zu minimieren.

Ähnlich wie bei der Kultur und Verdauung, Modifikationen an dem Transformationsprotokoll würde erforderlich sein, wenn das System für die Transformation von Protoplasten aus verschiedenen Pflanzenarten isoliert Annahme. Eine bedeutende Arbeit wurde auf die Optimierung von PEG-vermittelte Transformation in Pflanzenprotoplasten ^16,35, mit einer Vielzahl an Faktoren durchgeführt worden , um die Effizienz der Transformation zu beeinflussen. In der aktuellen work ein limitierender Faktor die Transformationseffizienz war die Größe des binären Testplasmids beeinflussen, 16.028 bp, die für die Zwecke der Modellierung einer genom Bearbeitung Plasmidgröße verwendet wurde. In früheren Studien über PEG-vermittelte Transformation von BY-2-Protoplasten wurde 40-60% Umwandlung erreicht; jedoch verwendet diese Studien kleine 5.000 bp Plasmide ^41,42. Die primären Änderungen an PEG-vermittelte Transformation zwischen den Arten gehören , die Konzentration von PEG und MgCl _2, Menge und Konzentration der DNA und Reaktionsdauer. Da die PEG und MgCl & _sub2 ; -Lösungen in das System auf der Reagensschicht Platte eingeführt werden, und die DNA wird vorinstalliertes in die Deepwell - Platte können diese Bedingungen leicht modifiziert werden , in dem oben beschriebenen Protokoll. Zusätzlich zu erhöhen oder die Inkubationszeit abnimmt, bei gleichzeitiger Änderung der Mischgeschwindigkeiten können präzise durch die Roboter-Plattform gesteuert werden. Die Strombegrenzung des Transformationsprotokolls ist das FehlenScreenen der Plattenlesegerät unter Verwendung der fluoreszierenden Reporter zu erfassen, aufgrund der geringen Effizienz der PEG-vermittelte Transformation in BY-2-Protoplasten. In anderen Arten, wie Arabidopsis thaliana und Mais ^16, PEG-vermittelte Transformation ist 40-90% effizient. In solchen Systemen Trans schnell charakterisiert werden, um den Plattenleser auf dem Roboter. Somit wäre es möglich, Vertiefungen mit positiven Transformanten zu identifizieren, und auch das Niveau der Expression zu quantifizieren. Für Anwendungen, wie beispielsweise Promotor-Screening, würde dieses Merkmal die Nützlichkeit des aktuellen Protokolls zu erhöhen, und wird in späteren Iterationen des Systems hinzugefügt werden.

Neben der Optimierung der Transformationseffizienz für die BY-2-Protoplasten, mehrere Modifikationen möglich, die Effizienz und den Gesamtdurchsatz des Systems zu erhöhen. Frühere Studien über die Automatisierung der Protoplasten-Transformation von Protoplasten erlaubt, auf den Boden von Vertiefungen vor der Zugabe zu begleichen warh Lösungen ^43. In der aktuellen Protokoll, Protoplasten wurden auf dem Plattenschüttler gemischt, um ein Absetzen zu verhindern und die Protoplasten in der Schwebe halten flachen Boden-Well-Platten verwendet wird. Ferner wird während der Transformation wurden Protoplasten nicht erlaubt in den Deep-Well-Platten zu regeln, um die Belichtung zu PEG zu reduzieren, die toxisch über längere Exposition sein kann. Als solche wurden die Protoplasten ~ 10-fach mit W5 - Lösung verdünnt , wenn sie aus dem Deep-Well - Platte mit dem 96-Loch - Fluoreszenzschirmplatte übertragen, was zu 1,23 x 10 ³ ± 4,66 x 10 ¹ Protoplasten pro Vertiefung. Um die Anzahl von Protoplasten nach der Transformation ein Inkubationsschritt die Protoplasten zu regeln, und der Überstand entfernt, gefolgt von der Zugabe einer kleineren Flüssigkeitsvolumen BY-2-Medien zu ermöglichen, könnte übertragen zu erhöhen zugegeben. Außerdem, wenn eine Plattenbasis Zentrifuge zu dem System hinzugefügt wurde, konnte dieser Schritt schneller erreicht werden. Eine weitere Modifikation, die Funktionalität hinzufügen könnte zu ter System würde die Verwendung eines lebenden / toten Fluoreszenzassay sein, um die Lebensfähigkeit der isolierten Protoplasten vor der Transformation zu bestimmen. In dem aktuellen Protokoll wurde Fluoreszeindiacetat (FDA) als Live-Farbstoff getestet; jedoch verdeckt die BY-2-Protoplasten Hintergrundfluoreszenz der FDA-Signal. Wenn ein stabiler Lebensfähigkeit Farbstoff verwendet wurde, dann könnte die Protoplasten Lebensfähigkeit als das Verhältnis der roten bestimmt werden (PI) zu grün (Calcein AM, etc.) Fluoreszenz und standardisiert ähnlich der Zellzählung Protokoll. Diese Änderungen würden fügen weitere Funktionalität in das System und wird in Zukunft Protokolle aufgenommen werden.

Im Hinblick auf die aktuelle Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte, die den Erfolg des Protokolls zu gewährleisten, die befolgt werden müssen. Erstens ist das Alter / Gesundheit der BY-2-Kulturen wesentlich, dass tragfähige Protoplasten zu garantieren für den nachfolgenden Schritten isoliert werden. in Schritt 1.3, Wie von einer log-Phase Kultur in einen frischen Kolben auf eine Übertragung01.50-Verhältnis von Zellen in frisches Medium, und man die Kultur für 5-7 Tage, die maximale Anzahl an lebensfähigen Protoplasten zu wachsen, isoliert werden. Erlauben die Kulturen für kürzere oder längere Laufzeiten mit dem angegebenen Inokulums wachsen wird die Protoplasten-Ausbeute deutlich zu reduzieren, und Versagen der nachfolgenden Protokolle führen. Ein zweiter wichtiger Schritt ist Schritt 1.5, da die Verwendung von Standard-Pipettenspitzen, anstelle der Breit Bohrung Pipettenspitzen angegeben, werden die Spitzen führen zu verstopfen und auf die falsche Volumina führen übertragen werden. Im Hinblick auf den Aufbau des Robot-Systems, die Anordnung der Platten auf dem automatisierten Liquid-Handling-Plattform, Schritt 2.4, ist von entscheidender Bedeutung, mit einem modifizierten Setup den Kopf des Liquid Handler verhindert Erreichen alle Vertiefungen auf der 6-Well-Platte. Aufgrund der Konstruktion der Flüssigkeitshandhabungsplattform automatisiert, muß die Platte mit 6 Vertiefungen in Nest 5, oder Protokolle für dieses Instrument fehl ausgewählt platziert werden. In ähnlicher Weise nicht korrekten Labware in der Platte definierenMover-Software, Schritt 2.2, führt dazu, dass das Instrument zu greifen zu versagen, oder die labware in Beendigung des Protokolls resultierenden fallen. Für den Zellzahl-Protokoll beinhaltet die kritische Schritt der Fixierung der Zellen mit Ethanol, Schritt 3.2. Wenn Zellen, die nicht mit PI vor der Markierung fixiert sind, werden nur nicht lebensfähige Zellen markiert, statt der gesamten Population von Protoplasten werden, und es wird nicht möglich sein, die Anzahl von Protoplasten isoliert zu zählen. Die endgültige kritischer Schritt, Schritt 4.6 beinhaltet die Auswahl der Leuchtstofffilter für die mikroskopische Analyse der Expression des pporRFP Fluoreszenzmarker. Die Verwendung anderer "red" Filtersätze können für die Hintergrundfluoreszenz von Chlorophyll, signifikant das Signal in allen Chloroplasten enthaltenden Protoplasten Erhöhung Berechnung der Transformationseffizienz verhindert wird. Sorgfältig in diesen kritischen Schritte zu den Spezifikationen Einhaltung garantiert die größte Chance für den Erfolg und die Erzeugung der reproduzierbaren Datenet.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interesse haben.

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.