ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

يوصف منهجية الإنتاجية العالية، الآلي، إنتاج البروتوبلازم التبغ والتحول. النظام الآلي يمكن التعبير الجيني الموازي واسع والاكتشاف في نظام نموذجي BY-2 التي ينبغي أن تكون للترجمة للمحاصيل غير النموذجية.

على مدى العقد الماضي كان هناك تجدد في استخدام جبلة مجردة النباتية التي تتراوح بين الأنواع نموذج لاقتصاص أنواع، لتحليل مسارات نقل الإشارة والشبكات التنظيمية النسخي، التعبير الجيني، الجينوم التحرير، والجينات إسكات. وعلاوة على ذلك، تم إحراز تقدم كبير في تجديد النباتات من جبلة مجردة، التي ولدت المزيد من الاهتمام في استخدام هذه النظم لعلم الجينوم المصنع. في هذا العمل، وقد تم وضع بروتوكول لأتمتة العزلة البروتوبلازم والتحول من 2 (BY-2) ثقافة تعليق التبغ "الأصفر الساطع" باستخدام منصة الروبوتية. تم التحقق من صحة إجراءات التحول باستخدام البرتقال ببروتين (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) تحت سيطرة المروج القرنبيط فيروس تبرقش 35S (35S). وأكد التعبير النفط مقابل الغذاء في جبلة مجردة بواسطة المجهر epifluorescence. شملت التحليلات أيضا الأساليب كفاءة الإنتاج البروتوبلازم باستخدام propidiuم يوديد. وأخيرا، تم استخدام منخفضة التكلفة الإنزيمات للمأكولات لإجراء البروتوبلازم العزلة، التحايل على الحاجة إلى مختبر الصف الانزيمات التي هي في الإنتاجية العالية الآلي العزلة البروتوبلازم وتحليل باهظة التكلفة. على أساس بروتوكول المتقدمة في هذا العمل، ويمكن إجراء الإجراء الكامل من العزلة البروتوبلازم إلى تحول في أقل من 4 ساعات، من دون أي مساهمة من المشغل. في حين تم التحقق من صحة بروتوكول المتقدمة في هذا العمل مع ثقافة الخلية BY-2، وينبغي أن تكون الإجراءات والأساليب للترجمة إلى أي ثقافة تعليق مصنع / نظام بروتوبلازمي، والتي ينبغي تمكين تسريع الأبحاث الجينومية المحاصيل.

في السنوات الأخيرة كان هناك زخم كبير وضعت على تصميم المحاصيل المعدلة وراثيا للتغلب على الأمراض المختلفة ^1، منح مقاومة مبيدات الأعشاب ^2، منح الجفاف ^3،4 والتسامح الملح ^5، ومنع الحيوانات العاشبة ^6، وزيادة العائد الكتلة الحيوية ^7، وتقليل جدار الخلية عناد ^8. وقد ساعد هذا الاتجاه من خلال تطوير أدوات جزيئية جديدة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الجينوم التحرير باستخدام كريسبر وTALENs ^9، والجينات إسكات من خلال الرنا المزدوج الجديلة ^10، ميرنا ^11، وسيرنا ^12. في حين أن هذه التقنيات وتبسيط جيل من النباتات المعدلة وراثيا، أنها خلقت أيضا عنق الزجاجة، حيث ولدت العدد الهائل من النباتات المعدلة وراثيا لا يمكن عرضه باستخدام الأنظمة التقليدية التي تعتمد على تجديد مصنع. تتعلق هذه العقبة، في حين إسكات ويبني الجينوم التحرير يمكن إدراج بسرعة إلى النباتات، والعديد منفشلت الصفات التي تستهدف إحداث التأثير المطلوب، والتي غالبا ما تكون غير المكتشفة حتى يتم تحليل النباتات في الدفيئة. في هذا العمل، وقد وضعنا طريقة لسريع وتلقائي وفحص عالية الإنتاجية من جبلة مجردة النبات، وعلى وجه التحديد لمعالجة عنق الزجاجة الحالي في الفحص المبكر أعداد كبيرة من الجينوم التحرير والجينات إسكات الأهداف.

استخدام جبلة مجردة، بدلا من الخلايا النباتية سليمة، لديها العديد من المزايا للتطوير منصة الآلي. أولا، يتم عزل جبلة مجردة بعد هضم جدار الخلية النباتية، ومع هذا الحاجز لم تعد موجودة، وزيادة كفاءة تحويل ^13. في الخلايا النباتية سليمة لا يوجد سوى اثنين أساليب راسخة للتحول، biolistics ¹⁴ و الأجرعية التحول بوساطة ^15. أيا من هذه الأساليب يمكن ترجمتها بسهولة إلى منصات المعالجة السائلة، كما biolistics يتطلب معدات متخصصة لtransformation، في حين الأجرعية التحول بوساطة يتطلب ثقافة مشتركة وإزالة اللاحقة من البكتيريا. ولا هي قابلة لأساليب إنتاجية عالية. في حالة جبلة مجردة، يجري التحول بشكل روتيني باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ترنسفكأيشن بوساطة ^16، والتي تتطلب فقط عدة بورصات حل، ويعتبر مثاليا لمنصات المعالجة السائلة. ثانيا، جبلة مجردة، بحكم التعريف، هي ثقافات وحيدة الخلية، وبالتالي فإن المشاكل المرتبطة تشكيل تكتل وسلسلة في مزارع الخلايا النباتية، وليس لوحظ في جبلة مجردة. من حيث الفحص السريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي، القائم على لوحة تكتل من الخلايا أو الخلايا في الطائرات متعددة سوف يؤدي إلى صعوبة في الحصول على قياسات متناسقة. منذ جبلة مجردة هي أيضا الأكثر كثافة من وسائل الاعلام ثقافتهم، والرواسب في قاع الآبار، وتشكيل أحادي الطبقة، والتي تفضي للالطيفي القائم على طبق من ذهب. وأخيرا، في حين أن الثقافات تعليق خلية النبات PRIMARالمستمدة إيلي من الكالس ^17، جبلة مجردة يمكن حصاده من عدد من الأنسجة النباتية، مما يؤدي إلى القدرة على تحديد التعبير الأنسجة محددة. على سبيل المثال، القدرة على تحليل root- أو التعبير عن ورقة محددة من الجينات يمكن أن تكون هامة جدا للتنبؤ النمط الظاهري. لهذه الأسباب، ولم يتم التحقق من البروتوكولات وضعت في هذا العمل باستخدام جبلة مجردة معزولة عن التبغ تستخدم على نطاق واسع (النيكوتين تبغ L.) "برايت صفراء '2 (BY-2) ثقافة تعليق.

وقد وصفت ثقافة تعليق BY-2 باعتبارها الخلية "هيلا" من النباتات العليا، وذلك بسبب استخدام كل مكان في التحليل الجزيئي للخلايا النبات ^18. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت خلايا BY-2 لدراسة الآثار المترتبة على مصنع الضغوطات ^19-22، داخل الخلايا البروتين توطين ^23،24، وبيولوجيا الخلية الأساسية ^25-27 يدل على فائدة واسعة من هذه الثقافات في بيولوجيا النبات. ميزة إضافية لBY-2 الثقافات هيالقدرة على مزامنة مع الثقافات aphidicolin، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعزيز استنساخ للتعبير الجين دراسات ^28. وعلاوة على ذلك، تم تطوير طرق لاستخراج BY-2 جبلة مجردة باستخدام أنزيمات منخفضة التكلفة ^29،30، والإنزيمات التي تستخدم عادة لتوليد جبلة مجردة باهظة لأنظمة عالية الإنتاجية من حيث التكلفة. على هذا النحو، وقد تم التحقق من صحة البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام ثقافة تعليق BY-2، ولكن يجب أن تكون قابلة للتعديل إلى أي ثقافة مصنع التعليق الخلية. وتجرى التجارب إثبات صحة مفهوم باستخدام البرتقال البروتين مضان (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) من Porites المرجانية الصلبة porites ³¹ تحت سيطرة المروج CAMV 35S.

1. إنشاء الثقافات خلية تعليق

1. تحضير السائل BY-2 وسائل الاعلام من خلال إضافة 4،43 ز Linsmaier وسكوغ وسائل الإعلام بصل، 30 غرام من السكروز، 200 ملغ KH ₂ PO _4، و 200 ميكروغرام من 2،4-ثنائي كلورو فينوكسياسيتين حمض (2،4-D) إلى 900 مل من المقطر المياه ودرجة الحموضة إلى 5.8 مع 0.1 M KOH. بعد تعديل درجة الحموضة، وضبط الحجم النهائي إلى 1000 مل بالماء المقطر والأوتوكلاف. وسائل الاعلام ويمكن تخزين تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
2. تطعيم قارورة 250 مل مخروطي مع 100 مل من السائل BY-2 وسائل الإعلام وقطعة واحدة من BY-2 الكالس (> 1 سم في القطر) نمت على الصلبة وسائل الاعلام BY-2 (السائل BY-2 وسائل الاعلام مع إضافة 1٪ أجار) وختم بورق الألمنيوم. احتضان الثقافة في 28-30 درجة مئوية مع الهز لمدة 5 أيام.
   ملاحظة: BY-2 هو الحفاظ على الكالس على وسائل الاعلام الصلبة للتخزين على المدى الطويل، والثقافات السائلة واكتسى بسرعة. يمكن تعديل حجم الثقافة عند الضرورة، وعادة ثقافة مل 100 سوف تكون قادرة على تحميل الثلاثة والثلاثين 6-ثلوحات الذراع.
3. نقل 2 مل من مرحلة سجل BY-2 ثقافة إلى 98 مل من وسائل الإعلام الجديدة BY-2 واحتضان لمدة 5-7 أيام في 28-30 درجة مئوية مع اهتزاز.
   ملاحظة: زراعة الفرعية الثقافات السائل أنشئت يمكن القيام بها بانتظام باستخدام 1: 100 التخفيفات من الثقافات القديمة 5-7 يوم، بدلا من التلقيح مع الكالس.
4. مزيج من الثقافة بدقة، وخلايا سوف يستقر بسرعة، ونقل 6 مل من ثقافة الخلية إلى أنبوب أسفل الطرد المركزي 15 مل مخروطي الشكل، والسماح للخلايا تسوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. ضبط حجم الخلية معبأة إلى 50٪ من الحجم الكلي عن طريق إزالة طاف.
5. هز أنبوب من قلب والماصة 500 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 6 جيدا لعملية الهضم. استخدام pipets على نطاق تتحمل لنقل الخلايا في هذه المرحلة، لأنها كثيفة وسوف تسد نصائح الماصة القياسية.

2. البروتوبلازم عزل

1. بدوره على جميع مكونات النظام الآلي (الشكل 1A) وفتح مهمة لوحة المحرك جدولة ناعمةوير. يدمج برنامج جدولة المهام المحرك صفيحة مع معدات أخرى لتمكين نقل لوحات بين كل قطعة من المعدات.
2. قبل التجريب، وتحديد المواصفات الفنية للمعدات المختبرات (على سبيل المثال، لوحات، والأغطية) المستخدمة في بروتوكول، وكذلك الانطلاق والمواقف النهاية لكل قطعة من معدات المختبرات، في البرنامج لوحة المحرك، على النحو التالي:
   1. انقر فوق إعداد من شريط الأدوات الرئيسي في البرنامج لوحة المحرك واختيار إدارة الحاويات أنواع الأوامر.
   2. إذا تم سرد نوع الحاويات في مكتبة نوع الحاويات القائمة، ثم حدد حاوية المناسبة.
   3. إذا لم يتم سرد نوع الحاويات في مكتبة نوع الحاويات القائمة ثم انقر فوق إضافة إلى تحديد نوع الحاوية جديد.
   4. بعد إضافة نوع الحاوية جديد، إدراج أبعاد جديدة للحاويات (الطول، العرض، أبعاد التراص، والقابض الإزاحة) في علامات التبويب المناسبة ثم انقر فوق حفظ.
      1. إذا كانت أبعاد الصحيحة غير متوفرة من الشركة المصنعة، ثم تحدد بدقة جميع الأبعاد إلى أقرب ملليمتر باستخدام الفرجار. سوف أخطاء في قياس أبعاد الحاويات يؤدي إلى فشل المحرك لوحة.
   5. كرر الخطوات من 2.2.2 من خلال 2.2.4.1 لجميع أنواع الحاويات أن المحرك لوحة ستواجه. بعد الانتهاء من هذه الخطوة لجميع المختبرات، فمن الضروري تحديد بداية ونهاية الموقع لكل حاوية (الخطوة 2.2.6).
      ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول يتضمن معدات المختبرات لوحة 6 جيدا، لوحة في آبار عميقة، ولوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا.
   6. لتحديد بداية ونهاية الموقف من كل حاوية، انقر فوق علامة التبويب البداية / النهاية في بروتوكول معين. أولا، تحديد موقف بداية كل حاوية. بعد ذلك، ضع علامة في المربع للبغطاء / Unlidded في كل بداية ونهاية الموقف. أكرر لجميع الحاويات.
      ملاحظة: إذا كان سيتم ترك الحاوية على آخر قطعة من EQUipment (بدلا من المحرك لوحة) الموقع نهاية يمكن تركها فارغة.
3. في هذه المرحلة تحميل يدويا جميع لوحات في نقطة الانطلاق لسير العمل بأكمله. تحميل لوحات فحص الفلورسنت جيدا 96 في فندق 2، 6 لوحات بشكل جيد مع BY-2 الخلايا في فندق 3، لوحة 96 آبار عميقة التي سيتم استخدامها للتحول إلى سخان لوحة / مبرد عش 2، والمخروطية 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على حل انزيم (انظر الملف التكميلي، القسم 1.2.2) على موزع متعدد الأوضاع.
   1. إذا كان سيتم تنفيذ التحول في البروتوكول، قبل تحميل لوحة في آبار عميقة 96 مع 10 ميكرولتر من البلازميد لكل بئر (1 ميكروغرام / ميكرولتر، A _260/280> 1.8) التي تحتوي على مراسل بناء OFP واحتضان على لوحة سخان / المبرد عند 4 درجات مئوية. وسوف تستخدم كل بئر لتحويل واحد، وبالتالي فإن عدد الآبار شغل سيعتمد على الإعداد التجريبية.
4. تحميل جميع اللوازم وألواح على أتمتةد منصة تداول السائلة في مواقع معينة، وتحديد موقف كل بند في البرنامج التحكم الآلي (الشكل 1B).
   1. تحميل لوحة 96-جيدا مسبقة مع 200 ميكرولتر من 40٪ PEG في مجموعة محمد المعجل (0.4 M مانيتول، 100 ملي MgCl ₂ و 4 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.7) في العمود 1، 200 ميكرولتر من يوديد propidium (PI، 1 ميكروغرام / مل) في العمود 2، و 200 ميكرولتر من الايثانول في العمود 3 (عش 2)، وعلبة من نصائح ماصة في عش 8.
   2. لتحديد مكان وجود معدات المختبرات في مجال البرمجيات وسائل التعامل مع منصة الآلي، واختر Tools من القائمة وانقر فوق محرر المختبرات الطبية.
   3. حدد نوع من معدات المختبرات من القائمة المنسدلة أو تحديد نوع معدات المختبرات جديد باستخدام زر جديد المختبرات الطبية.
   4. تحديد موقف من كل قطعة من معدات المختبرات التي اختارها اختيار علامة التبويب بروتوكول الرئيسية والنقر تكوين المختبرات الطبية. تأكد من أن كل قطعة من معدات المختبرات وضعت على منصة الآلي التعامل مع السائلتعرف قبل تشغيل البروتوكول.
   5. لتحريك بروتوكولات الآلية، انقر فوق إطار مستكشف الملف وحدد اسم البروتوكول ليتم تشغيلها (البروتوبلازم عزل، كونت الخلية، والتحول بوساطة PEG).
   6. انقر فوق تشغيل لتهيئة كافة الأجهزة التي سيتم استخدامها في البروتوكول.
   7. وأخيرا، في إطار مستكشف العمل، انقر فوق إضافة وحدة العمل للتحقق من جميع الحاويات / معدات المختبرات في النظام وبدء بروتوكول الآلي.
      ملاحظة: الوصف الكامل للبروتوكولات الآلي الموجودة في الملف التكميلي.

3. إنشاء ستاندرد Curve للتعداد خلايا

1. التركيز يدويا جبلة مجردة بتركيز 1 × 10 ⁶ جبلة مجردة / مل في حجم 1 مل. الطرد المركزي جبلة مجردة في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف.
2. يدويا إضافة 900 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول (الحفاظ على 4 درجات مئوية) لبيليه البروتوبلازموإعادة تعليق بيليه. احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد لإصلاح الخلايا.
3. إضافة 100 ميكرولتر من PI (1 ميكروغرام / مل) إلى جبلة مجردة لتسمية نوى والسماح الكشف من قبل قارئ لوحة.
4. تحميل 80 ميكرولتر من السائل BY-2 وسائل الإعلام في كل الصفوف والأعمدة من لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا بدءا من العمود 2.
5. في العمود 1 من لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا، إضافة 70 ميكرولتر من جبلة مجردة و 50 ميكرولتر BY-2 وسائل الإعلام إلى كل بئر في العمود.
6. وضع لوحة في عش 6 من منصة الآلي التعامل مع السائل، وتشغيل التخفيف المتسلسل 2 أضعاف.
   1. لإجراء التخفيف المتسلسل على منصة الآلي التعامل مع السائل، انقر فوق تشغيل معالج التخفيف المسلسل وضبط حجم نقل (60 ميكرولتر)، وعدد من أمزجة وحجم (2، 70 ميكرولتر) والآبار الأولية (العمود 1، الصفوف AF)، تخفيف الآبار (أعمدة 11/02، الصفوف AF)، ونضح والاستغناء عن خصائص (0.5 ملم من أسفل أيضا).
   2. بعد إعداد المعلمات، حفظد تشغيل البروتوكول.
      ملاحظة: منذ وصفت كل جبلة مجردة مع PI (بسبب تثبيت الخلايا)، ومضان غير متناسبة مع تركيز البروتوبلازم.
   3. بعد الانتهاء من التخفيف المتسلسل، وإزالة لوحة من عش 9 وإدراجه في قارئ لوحة وتشغيل بروتوكول المنحنى القياسي في البرنامج لوحة القارئ.
      ملاحظة: سيتم بعد ذلك إنشاء منحنى القياسية من خلال مقارنة مضان من PI (الإثارة 536 نانومتر / انبعاث 620 نانومتر) في كل بئر مع تركيز البروتوبلازم المعروفة.
7. عند الانتهاء من بروتوكول قارئ لوحة، وإزالة لوحة وجمع أي خلايا معدلة وراثيا لالتعقيم أو غيرها من إجراءات اجتثاث إنعاش كما هي محددة في بروتوكولات السلامة الأحيائية.

4. تحليل مجهري للتحول

1. إزالة لوحة مع جبلة مجردة تتحول (نتاج بروتوكول الآلي 3، الملف التكميلي) من فندق 1 من النظام الآلي.
2. منعطفعلى مجهر مقلوب، وكاميرا، ومصباح الفلورسنت.
3. حدد الهدف 10X للعسل مع التركيز على جبلة مجردة، تشغيل مصابيح الهالوجين، وإغلاق مصراع للمصباح الفلورسنت.
4. لوحة الحمل على نظام المجهري والتركيز على جبلة مجردة باستخدام brightfield.
5. بعد التركيز على جبلة مجردة، إيقاف لمبة الهالوجين وفتح مصراع لمبة الفلورسنت.
6. حدد مرشح CY3 / TRITC وضع التصور من البروتين pporRFP التي أعرب عنها جبلة مجردة المعدلة وراثيا.
7. مسح كل بئر لتحديد عدد من جبلة مجردة تعبر عن pporRFP علامة فلوري.
8. حساب كفاءة التحول حيث بلغ إجمالي من جبلة مجردة تعبر عن علامة فلوري إجمالي عدد جبلة مجردة.
9. جمع أي لوحات تحتوي على خلايا معدلة وراثيا في أكياس السلامة الأحيائية الموافقة على التعقيم أو غيرها من إجراءات اجتثاث إنعاش كما هي محددة في بروتوكولات السلامة الأحيائية.

في الدراسة الحالية، فإن معدل مضاعفة BY-2 تباينت 14-18 ساعة تعتمد على درجة الحرارة التي حضنت الثقافات، بما يتفق مع التقارير السابقة لطول دورة الخلية متوسط ​​من 15 ساعة. مع هذا المعدل مضاعفة، 1: تم استخدام 100 ابتداء من اللقاح لبدء الثقافات، مما يؤدي إلى الثقافات مع حجم معبأة الخلية (PCV) من 50٪ في 5-7 أيام. في البروتوكول الحالي، والتي كانت تزرع الثقافات في 200 مل من وسائل الاعلام، فقد تولدت PCV من 100 مل في 7 أيام، والتي تقدم خلايا كافية لملء 33 6 لوحات جيدة. من حيث العائد بروتوبلازمي، والهضم في الشروط المحددة في بروتوكول إنشاء 4.70 × 10 ⁵ ± 5.77 × 10 ³ جبلة مجردة لكل بئر، مما أدى إلى 2.82 × 10 ⁶ جبلة مجردة في لوحة 6 جيدا (الشكل 2A). وبناء على هذه المعطيات، 214 لوحات 96-جيدا (70 ميكرولتر من جبلة مجردة لكل بئر) يمكن تحميل من واحد الهضم وحة 6-جيدا، مع احتمال FOص اثنين 6 لوحات بشكل جيد ليتم هضمها في وقت واحد، وذلك باستخدام المحطتين سخان لوحة / مبرد. وهكذا، فإن الحد الأقصى لعدد جبلة مجردة التي يمكن توليدها خلال بروتوكول الهضم واحد ثلاث ساعات هو 5.64 × 10 ^6.

فيما بلغ عدد من جبلة مجردة ولدت في بروتوكول الهضم يوفر مقياس واحد للنظام، فمن الضروري أيضا لتقييم الخسائر في تركيز بروتوبلازمي كما يتم نقل جبلة مجردة من خلال خطوات مختلفة من البروتوكول. على هذا النحو، تم تقييم تركيز جبلة مجردة بعد كل خطوة نقل في البروتوكول. بعد بروتوكول الهضم، تم نقل 1.15 × 10 ⁴ ± 1.35 × 10 ² جبلة مجردة إلى كل بئر من 96 لوحات في آبار عميقة، إذا إجراء بروتوكول التحول، أو لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا (الشكل 2B). وبمجرد الانتهاء من بروتوكول التحول، 1.23 × 10 ³ ± 4.66 ستم نقل 10 ¹ جبلة مجردة إلى 96 جيدا لوحة فحص الفلورسنت (الشكل 2C). بالإضافة إلى عدد من جبلة مجردة نقل، فإنه من المهم تحديد الجدوى من جبلة مجردة لضمان مراحل pipetting لعدة لم يضر جبلة مجردة.

استنادا إلى نتائج من فحص جدوى، وكانت 95.1 ± 0.04٪ من جبلة مجردة قابلة للحياة بعد الهضم، 92.1 ± 0.06٪ بعد نقلها إلى لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا، و91،7 ± 16.67٪ بعد بروتوكول التحول. وعلى الرغم من الخطوات pipetting لمتعددة، كان هناك فرق معنوي (p> 0.44) بين أي من العينات. وبالإضافة إلى هذا الإجراء من قدرتها على البقاء، ووضع بروتوكول لتحديد تركيز جبلة مجردة في أي مرحلة من مراحل الدعوى عن طريق قياس عدد من جبلة مجردة ملطخة PI. كما هو مبين في الشكل (3)، وكان المنحنى القياسي generatإد عن طريق قياس كثافة مضان لتركيزات معروفة من جبلة مجردة من النظام. كان المنحنى القياسي مناسبا (R ² = 0.967) مع عدد من جبلة مجردة تغطي مجموعة من 0 إلى 30000 جبلة مجردة لكل بئر. للتحقق من صحة منحنى قياسي، وشدة مضان من العينات مع عدد معروف من جبلة مجردة (8125 و 24375 تحسب باستخدام عدادة الكريات) تم الحصول عليها وعدد من جبلة مجردة المحسوبة من معادلة المنحنى القياسي. وبناء على هذه النتائج، وتوقع منحنى القياسية 9560 و 28200 جبلة مجردة في كل بئر، خطأ 15 و 14٪. وبالنظر إلى أن هناك أيضا التباين في قياس عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، واعتبر هذا الخطأ مقبول.

بالإضافة إلى نتائج عدد الخلايا وقدرتها على البقاء، وكان بروتوكول التحول الناجح في توليد خلايا المعدلة وراثيا التي تعبر عن OFP (الشكل 2D - F). للأسف أدى البروتوكول المستخدم في البلدان المنخفضة الدخل، ~ 2٪، وكفاءة التحول، ويرجع ذلك إلى 16028 سنة مضت البلازميد ثنائي كبير المستخدمة في هذه الدراسة، ومنذ لم يكن الأمثل بروتوكول خصيصا لBY-2 جبلة مجردة. ومن المتوقع تعظيم الاستفادة من بروتوكول التحول، من حيث الكواشف وشروط خصيصا لBY-2 جبلة مجردة، لزيادة كفاءة التحول، كما أوضحت في مناقشة. ووفقا لهذا البروتوكول، وقد تم تصميم هذا الإجراء التحول للتدليل على طريق إثبات صحة مفهوم من العزلة البروتوبلازم إلى التحول، وكان ناجحا في تحقيق هذا الهدف.

بعد التحقق من صحة بنجاح كافة الإجراءات الفردية، وقد تم الحصول على مقاييس للtimecourse من البروتوكول من العزلة البروتوبلازم إلى التحول. كما هو موضح في الشكل (4)، وينفق استثمارا كبيرا من الوقت خلال مرحلة الهضم، والذي كان مطلوبا 3 ساعة FOص الهضم الكامل للجدار الخلية والافراج عن جبلة مجردة. خلال هذا الإجراء، يتم تشغيل 18 حلقات بين / محطة حضانة لوحة شاكر ولوحة سخان المبرد 1، مع المحرك لوحة تحريك لوحة بين المحطتين. وقت نقل بين شاكر لوحة وسخان لوحة / مبرد 1 يستغرق سوى 8.9 ثانية، ويضمن أن الغالبية العظمى من إجراء عملية الهضم ينفق تحتضن وتهتز. الوقت الإجمالي من الشروع في إجراءات لاستكمال التحميل من الانزيمات التي موزع متعدد الأوضاع هو 2.2 دقيقة. عموما، يتم الانتهاء من كامل بروتوكول البروتوبلازم العزلة في 3 ساعات و 22.8 دقيقة. وبناء على هذه النتائج، 88٪ من بروتوكول البروتوبلازم العزلة ينفق هضم. بعد الانتهاء من بروتوكول البروتوبلازم العزلة، يبدأ بروتوكول التحول، وتكتمل في غضون 27.5 دقيقة. على غرار بروتوكول العزلة البروتوبلازم، وينفق 72٪ من إجراء تحول احتضان رد فعل. الخطوة الوحيدة الأخرى في البروتوكولالتي لديها عنصرا هاما الوقت (> 10٪ من إجمالي وقت الداخلي) هو التهيئة للبروتوكول من قبل الآلية منصة تداول السائل، وهو ما يمثل 14٪ من إجمالي الوقت في الإجراء. وبهذه الطريقة، يتم إنفاق 86٪ من بروتوكول في التهيئة والحضانة، مع 14٪ فقط من الوقت الذي يقضيه في pipetting لونقل خطوات. وكانت مدة كاملة من العزلة البروتوبلازم والتحول 3 ساعة و 50 دقيقة و 53 ثانية، مع عدم وجود المدخلات الخارجية المطلوبة من المشغل.

الشكل 1:. تخطيطي للمنصة الروبوتية وتكوين منصة الآلي التعامل مع السائل خلال بروتوكول يتكون (أ) النظام الآلي من 3 مداخن لوحة / الفنادق التي يمكن الوصول إليها من قبل المحرك لوحة. فندق 1 هو محطة lidding / delidding المعينة، فندق 2 هو فلوري 96-جيدالوحة كومة، وفندق 3 هو كومة وحة 6 جيدا. النظام لديه اثنين من معالجات السائلة، وهي منصة الآلي معالجة السائل، ومتعدد الأوضاع موزع القائم على فوهة. لأغراض التدفئة / التبريد منصة روبوتية اثنين من لوحة التدفئة وحدة / تقشعر لها الأبدان، جنبا إلى جنب مع شاكر لوحة لخلط لوحة. وأخيرا، فإن النظام لديه قارئ لوحة القائم على مستوحد اللون لقياس مضان. ويضم كل المكونات في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء العرف بنيت. (ب) ابتداء من تكوين منصة تداول السائل الآلي مع عش 2 من لوحة كاشف والمربع تلميح المحتلة وضعت على عش 8. (C) تكوين السائل الآلي منصة تداول قبل استدعاء بروتوكول تجريبي. يقع لوحة في آبار عميقة على عش 4، ويقع على لوحة فحص الفلورسنت 96-بشكل جيد على عش 6، ويقع على لوحة 6 جيدا تحتوي على جبلة مجردة على عش 5. يرجى النقر هنا لضد iew نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور الممثل BY-2 جبلة مجردة بعد كل عملية تحويل وبعد التحول مع الفلورسنت الجين مراسل البروتين البرتقال (A - C) الميكروسكوب من BY-2 كثافة البروتوبلازم في 6 جيدا لوحة، لوحة 96-جيدا بعد نقل 70. ميكرولتر من لوحة 6 جيدا، و 96 جيدا الفلورسنت لوحة فحص ما بعد التحول. (د) صورة مجهرية Brightfield من BY-2 جبلة مجردة بعد التحول. (E) نيون BY-2 البروتوبلازم التعبير عن الجينات OFP تصور باستخدام / TRITC تصفية مجموعة و Cy3. (F) تراكب من brightfield والميكروسكوب الفلورسنت يتظاهرون انخفاض كفاءة التحويل. شريط النطاق = 50 ميكرون. الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: منحنى القياسية لحساب عدد من جبلة مجردة عدد جبلة مجردة في معين بشكل جيد يمكن أن تحسب بمقارنة كثافة مضان، في وحدات التعسفي (AU)، إلى معادلة المنحنى القياسي. وتمت مقارنة المصادقة على عدد البروتوبلازم بين المنحنى القياسي وعدادة الكريات عند نقطة مبين في الرسم البياني، مع 9561 جبلة مجردة تحديدها من قارئ لوحة، و8،125 يعول على عدادة الكريات. وعموما، تم العثور على خطأ من 15٪ بين الطريقتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعادة 4 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
وينفق مخطط جانت للإجراءات المنصوص عليها لإنتاج BY-2 جبلة مجردة والتحول الجيني الغالبية العظمى من البروتوكول، ~ 3 ساعات، على هضم الخلايا BY-2 لتوليد جبلة مجردة: الرقم 4. تحميل الحل الانزيم وتعطيل تتطلب 12٪ فقط من الوقت الإجراء العام. وبالمثل، حضانة رد فعل التحول على شاكر لوحة تمثل 72٪ من بروتوكول التحول. وعموما، فإن الإجراء من العزلة البروتوبلازم حتى يتحقق التحول الجيني قيد 4 ساعات (3 ساعات و 50 دقيقة و 53 ثانية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي: بروتوكولات الآلي لعزل البروتوبلازم، عد الخلايا، والتحول بوساطة الربط بين <./ قوي> بروتوكولات كاملة تطويرها للاستخدام في منصة روبوتية لإنجاز كل المهام المذكورة أعلاه مدرجة في هذا الملف. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

وقد تم التحقق من صحة بروتوكول المذكورة أعلاه بنجاح لعزل البروتوبلازم، والعد، والتحول باستخدام التبغ زراعة الخلايا تعليق BY-2. ومع ذلك، يمكن بسهولة تمديد بروتوكول لأي ثقافة تعليق النبات. في الوقت الحاضر، وقد تم تحقيق العزلة والتحول البروتوبلازم في محطات عديدة، بما في ذلك الذرة (ذرة شامية) ^10، الجزرة (Daucus carota) ^32، الحور (حور euphratica) ^33، العنب (كرمة العنب الاوروبي) ^34، زيت النخيل (Elaeis guineensis) ³⁵ والخس (خس ساتيفا) ^36، الخردل (خردل هندي) ^37، الأرز (البركة أوريزا) ^38، والتبن (ثمام عصوي) ^39،40. في حين الاختلاف في ظروف التربية والهضم تحدث من نوع إلى نوع، من حيث البروتوكول وضعت في هذا العمل، لتحل محل وسائل الإعلام أو الثقافة أو تغيير شروط حفريجب estion لا تغيير البروتوكول الأساسي. على التكيف مع أنواع مختلفة، ووسائل الإعلام والثقافة، والانزيمات اللازمة لعملية الهضم يتم تحميلها من قبل المشغل قبل التهيئة للبروتوكول، وبالتالي تبادل هذه المكونات هي تافهة. وكميزة إضافية، والبروتوكول هو قابلة للتعديل لفحص ظروف الهضم متعددة مع العائد من جبلة مجردة قياسها من قبل النظام. وهذا هو عنصر أساسي، حيث أن استخدام الإنزيمات منخفضة التكلفة ضرورية للتطبيقات عالية الإنتاجية، وبالتالي فمن المهم أن تقليل كمية من الانزيمات المستخدمة في عملية الهضم.

وعلى غرار ثقافة والهضم، ستكون هناك حاجة إلى إدخال تعديلات على بروتوكول التحول عند اعتماد نظام للتحول من جبلة مجردة معزولة من الأنواع النباتية المختلفة. وقد أجريت عملا كبيرا على تعظيم الاستفادة من التحول بوساطة PEG في جبلة مجردة محطة ^16،35، مع العديد من العوامل التي تؤثر على كفاءة التحول. في التيار التعليم الجامعيكان RK أحد العوامل التي تحد تؤثر على كفاءة تحويل حجم كبير من البلازميد اختبار ثنائي، 16028 سنة مضت، والتي كانت تستخدم لأغراض النمذجة حجم البلازميد الجينوم التحرير. في الدراسات السابقة على التحول بوساطة PEG-BY-من 2 جبلة مجردة، وقد تحقق 40-60٪ التحول. ومع ذلك، استخدمت هذه الدراسات الصغيرة 5000 البلازميدات بي بي ^41،42. وتشمل التعديلات الأولية إلى التحول بوساطة الربط بين بين الأنواع تركيز PEG وMgCl _2، كمية وتركيز الحمض النووي، ومدة رد الفعل. كما وقدم PEG وMgCl ₂ الحلول في النظام على لوحة الكاشف، والحمض النووي هو في صحن عميق جيدا قبل تحميلها، وهذه الشروط يمكن تعديلها بسهولة في البروتوكول المذكورة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، زيادة أو خفض فترة حضانة، جنبا إلى جنب مع تعديل سرعات الاختلاط، يمكن تسيطر على وجه التحديد عن طريق المنصة الروبوتية. الحد الحالي للبروتوكول التحول هو عدم وجودالفرز باستخدام قارئ لوحة للكشف عن مراسل فلوري، ويرجع ذلك إلى انخفاض كفاءة التحول بوساطة PEG في BY-2 جبلة مجردة. في الأنواع الأخرى، مثل thaliana نبات الأرابيدوبسيس والذرة ^16، والتحول بوساطة PEG-فعال 40-90٪. في مثل هذه الأنظمة transformants يمكن وصف بسرعة باستخدام قارئ لوحة على الروبوت. وبالتالي، سيكون من الممكن تحديد الآبار مع transformants إيجابية، وأيضا تحديد مستوى التعبير. لتطبيقات، مثل فحص المروج، فإن هذه الميزة تزيد من فائدة البروتوكول الحالي، وسيتم إضافة في التكرار في وقت لاحق من هذا النظام.

بالإضافة إلى التحسين من كفاءة التحول للBY-2 جبلة مجردة، قد العديد من التعديلات زيادة الكفاءة والإنتاجية الشاملة للنظام. وكانت دراسات سابقة على التشغيل الآلي للتحول يسمح جبلة مجردة البروتوبلازم لتستقر في قاع الآبار، وذلك قبل إضافة كانحلول ح ^43. في البروتوكول الحالي، كانت مختلطة جبلة مجردة على شاكر لوحة لمنع تسوية والحفاظ على جبلة مجردة في تعليق باستخدام لوحات جيدا مسطحة القاع. وعلاوة على ذلك، أثناء التحول، لم يسمح جبلة مجردة إلى تسوية في لوحات في آبار عميقة، للحد من التعرض لPEG، والتي يمكن أن تكون سامة خلال التعرض لفترات طويلة. على هذا النحو، وكانت مخففة في جبلة مجردة ~ 10 أضعاف مع حل W5 عند نقلها من لوحة في آبار عميقة لوحة فحص الفلورسنت 96-جيدا، مما أدى إلى 1.23 × 10 ³ ± 4.66 × 10 ¹ جبلة مجردة لكل بئر. من أجل زيادة عدد جبلة مجردة نقل بعد التحول، ويمكن إضافة خطوة حضانة للسماح للجبلة مجردة ليستقر، وطاف حذفه تليها إضافة كمية قليلة من السائل وسائل الإعلام BY-2. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم إضافة جهاز للطرد المركزي القائم على لوحة للنظام، هذه الخطوة يمكن أن يتحقق بسرعة أكبر. تعديل آخر يمكن أن تضيف وظائف إلى tانه نظام من شأنه أن يكون استخدام الحي / الميت فحص مضان لتحديد الجدوى من جبلة مجردة معزولة قبل التحول. في البروتوكول الحالي، تم اختبار ثنائي الأسيتات فلوريسئين (FDA)، وصبغة حي؛ ومع ذلك، حجب البروتوبلازم خلفية مضان BY-2 إشارة ادارة الاغذية والعقاقير. إذا تم استخدام صبغة حيوية أكثر استقرارا، ثم الجدوى البروتوبلازم يمكن تحديد كنسبة من الأحمر (PI) إلى اللون الأخضر (Calcein صباحا، الخ) مضان، وموحدة على غرار بروتوكول عد الخلايا. ومن شأن هذه التعديلات إضافة المزيد من الوظائف لهذا النظام، وسيتم المدرجة في البروتوكولات في المستقبل.

وفيما يتعلق البروتوكول الحالي، هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب اتباعها لضمان نجاح البروتوكول. أولا، سن / صحة ثقافات BY-2 ضروري لضمان أن جبلة مجردة قابلة للحياة يمكن أن تكون معزولة عن الخطوات اللاحقة. كما هو موضح في الخطوة 1.3، عن طريق نقل ثقافة مرحلة السجل إلى قارورة جديدة في01:50 نسبة الخلايا إلى وسائل الإعلام الجديدة، والسماح للثقافة لتنمو لمدة 5-7 أيام، ويمكن أن تكون معزولة الحد الأقصى لعدد جبلة مجردة قابلة للحياة. السماح للثقافات أن ينمو لفترات أطول أو أقصر باستخدام اللقاح محدد من شأنه أن يقلل العائد البروتوبلازم، وتسبب فشل البروتوكولات اللاحقة. والخطوة الثانية الحاسمة هي خطوة 1.5، لأن استخدام نصائح الماصة القياسية، بدلا من نصائح الماصة واسعة تتحمل المحدد، وسوف يسبب النصائح لتسد، وتؤدي إلى وحدات التخزين غير صحيحة نقله. وفيما يتعلق إعداد النظام الآلي، وترتيب لوحات على السائل منصة الآلي المناولة، خطوة 2.4، أمر بالغ الأهمية، مع الإعداد المعدلة منع رئيس معالج السائلة من الوصول إلى جميع الآبار على لوحة 6 جيدا. نظرا لتصميم منصة آلية التعامل مع السائل، يجب أن توضع لوحة 6 جيدا في عش 5، أو سوف البروتوكولات التي اختيرت لهذا الصك تفشل. وبالمثل، فإن عدم تحديد المختبرات في لوحة بشكل صحيحبرنامج المحرك، خطوة 2.2، سوف يسبب الصك فشل لانتزاع، أو إسقاط معدات المختبرات مما أدى إلى إنهاء بروتوكول. لبروتوكول عدد خلايا، ينطوي على خطوة حاسمة في تثبيت الخلايا مع الإيثانول، خطوة 3.2. إذا لم يتم إصلاحها خلايا قبل وضع العلامات مع PI، فقط سيتم تسمية الخلايا nonviable، بدلا من سكان جبلة مجردة، وأنه لن يكون من الممكن لحساب عدد من جبلة مجردة معزولة. الخطوة الأخيرة الحاسمة، خطوة 4.6، ويتضمن مجموعة من المرشحات الفلورسنت لتحليل مجهري للتعبير عن علامة فلوري pporRFP. استخدام أخرى "الحمراء" مجموعات الفلتر يسمح لمضان الخلفية من الكلوروفيل، زيادة كبيرة في إشارة في جميع جبلة مجردة بلاستيدات الخضراء التي تحتوي على، ومنع حساب كفاءة التحول. الالتزام بعناية للمواصفات في هذه الخطوات الحاسمة يضمن أكبر فرصة للنجاح وتوليد دتس أكثر استنساخهوآخرون.

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصلحة مالية المتنافسة.

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.