Trainings Ratten Freiwillig Dive Unterwasser: Untersuchungen des Mammalian Diving Antwort

Detailed instructions are provided on how to train rats to voluntarily dive underwater through a 5 m long Plexiglas maze. Because the brains of rats have been very well characterized, voluntarily diving rats may help elucidate the central pathways of the mammalian diving response.

Underwater submergence produces autonomic changes that are observed in virtually all diving animals. This reflexly-induced response consists of apnea, a parasympathetically-induced bradycardia and a sympathetically-induced alteration of vascular resistance that maintains blood flow to the heart, brain and exercising muscles. While many of the metabolic and cardiorespiratory aspects of the diving response have been studied in marine animals, investigations of the central integrative aspects of this brainstem reflex have been relatively lacking. Because the physiology and neuroanatomy of the rat are well characterized, the rat can be used to help ascertain the central pathways of the mammalian diving response. Detailed instructions are provided on how to train rats to swim and voluntarily dive underwater through a 5 m long Plexiglas maze. Considerations regarding tank design and procedure room requirements are also given. The behavioral training is conducted in such a way as to reduce the stressfulness that could otherwise be associated with forced underwater submergence, thus minimizing activation of central stress pathways. The training procedures are not technically difficult, but they can be time-consuming. Since behavioral training of animals can only provide a model to be used with other experimental techniques, examples of how voluntarily diving rats have been used in conjunction with other physiological and neuroanatomical research techniques, and how the basic training procedures may need to be modified to accommodate these techniques, are also provided. These experiments show that voluntarily diving rats exhibit the same cardiorespiratory changes typically seen in other diving animals. The ease with which rats can be trained to voluntarily dive underwater, and the already available data from rats collected in other neurophysiological studies, makes voluntarily diving rats a good behavioral model to be used in studies investigating the central aspects of the mammalian diving response.

The diving response consists of a suite of autonomic reflexes seen in animals of all vertebrate classes ¹. In response to submersion under water, this reflexly-induced response consists of apnea, bradycardia and an alteration of blood flow that maintains flow to the heart, brain and exercising muscles while limiting flow to viscera and non-exercising muscles ². Many of the metabolic and cardiorespiratory aspects of the mammalian diving response have been well investigated ^2,3, including those in humans ^4,5. However, what has been relatively lacking, until recently, is investigation of the central integrative aspects of the diving response. What happens within the brainstem, and what is the neuronal step-by-step pathway, that connects afferent inputs to efferent outputs during this autonomic reflex? Answering these questions will require an appropriate animal model ⁶. An adage in comparative physiology, the Krogh principle ⁷, is that for every research question there is some animal of choice on which the problem can be most conveniently studied. A most appropriate animal for studying the central aspects of the diving response is the rat ^6,8. In large part this is due to the fact that the brains of rats have been very well characterized, both anatomically and functionally, and many rat brain atlases are available ⁶. Additionally the rat is particularly useful in cardiorespiratory research, because the physiology of the rat is well known across all major organ systems, and the rat is well regarded as an animal model in systems biology ⁶. Finally, the laboratory rat is the domesticated version of the wild Rattus norvegicus, an animal that routinely swims and dives underwater ⁶. Based on these considerations, the rat is a good choice for studies investigating the central aspects of the mammalian diving response. In comparison, using marine animals to investigate the central aspects of the mammalian diving response would be much more difficult. This is due in large part to marine animals having comparatively large and non-uniformly sized brains, and the relative difficulty and high cost of housing these animals.

Rats have previously been used to investigate many aspects of the mammalian diving response, primarily in situations involving forced underwater submergence ^9-12. However many studies in marine and aquatic animals have shown that there can be a differential response to diving based upon whether the submergence was forced or voluntary ^2,13. Diving animals may show an extremely intense bradycardia during forced diving but a much less intense bradycardia during voluntary diving. The “stress” of forced submergence can significantly change the cardiovascular responses of diving in many animals ¹⁴. Small rodents such as muskrats also show a more intense diving response during forced submergence than during voluntary diving ^15,16. Thus, if rats are to be used to investigate the central aspects of the mammalian diving response, investigators should be aware that a rat forcibly submerged underwater may produce a response different from that of a voluntarily diving rat.

The goal of this article is to provide detailed instructions on how to train rats to voluntarily dive underwater. These procedures are not technically difficult, but can be time-consuming. The training is conducted in such a way as to reduce the stressfulness that could otherwise be associated with forced underwater submergence. This voluntary diving technique should minimize activation of central stress pathways and thus better allow investigation of the central aspects of the diving response. By itself, training rats to voluntarily dive underwater generates no data that can be used to investigate the central aspects of the mammalian diving response. Therefore examples of how voluntarily diving rats have been used in conjunction with other physiological and neuroanatomical research techniques, and how the basic dive training may need to be modified to accommodate theses other techniques, are also provided.

HINWEIS: beschriebenen Versuchsprotokolle hier bei Midwestern University durchgeführt wurden von der Midwestern University IACUC genehmigt.

1. Raumanforderungen

1. Sichern Sie sich einen Eingriffsraum, die fließend heißem und kaltem Wasser in Betrieb war, und einen Weg, um das Wasser aus dem Tank in den Boden zu entfernen, typischerweise einen Abfluss.
2. Verwenden Sie eine Studie Tisch, auf dem die Tauchtank platzieren. Da Zimmer mit Bodenabläufe werden in der Regel für die Entwässerung konturiert, abgeholzt Gummistopfen und sie unter den Tischbeinen, um sicherzustellen, dass die Tischplatte und somit die Wasseroberfläche im Tank, eben ist.

2. Tauchflasche

1. Tauchen Behälterbau
   1. Konstrukt einen rechteckigen Behälter (100 x 60 x 15 cm) unter Verwendung von 3/4 Zoll dicken Plexiglas für die untere und 1/2 in Plexiglas für die Seitenwände (1). Dauerhaft zusammen mit Cyanacrylat Zement oder Solven befestigen die außerhalb Plexiglas Stücke des Tanksts wie Trichlormethan.
   2. Teilen Sie den Tank in 5 Kanälen jeweils etwa 100 cm in der Länge, mithilfe von Wechsel 1/2 Zoll dick Plexiglas in 85 x 15 cm Stücke schneiden. Dauerhaft platzieren Nuten in dem Boden und Kanten des Behälters, in die diese Kanalteiler in Position gesteckt werden.
   3. Suspend horizontalen Plexiglas Stücke aus den Kanalteiler, ein "Dach" für eine Unterwassertauch "Tunnel erstellen.
   4. In einer Ecke des Tanks Ort eine abnehmbare erhöhten Plattform, die "Zielbereich", für Ratten, die aus dem Wasser zu ziehen und Ruhe zwischen Schwimmen und Tauchen Studien. Ratten in der Regel Putzen und Wasser zu entfernen aus ihrem Fell, während im Zielbereich. Zeigen groß Seiten an den Rändern der Zielbereich, um sicherzustellen, die Ratten bleiben auf der Plattform zwischen den Trainings Studien.
   5. An der gegenüberliegenden Ecke des Tanks aus dem Zielbereich zu platzieren eine Kammer, die nur erlaubt unter Wasser Zugang zum Labyrinth. Auf dieser auswechselbaren "starten einrea "ist nur für Tauchversuche verwendet.
      HINWEIS: Zu Beginn eines Tauch Studie eine Ratte in das Wasser gesenkt, beim Sitzen auf einer Plattform in der Startkammer; damit diese Plattform wird als "Aufzug".
      HINWEIS: Verwenden Sie einen modularen Aufbau, wo der Startbereich, Zielbereich, und alle Kanäle Teiler sind abnehmbar aus dem Tank. 1) zur Erleichterung Befüllen und Entleeren Sie den Tank mit Wasser nach der Entfernung aller Kanalteiler, und 2) wenn eine Ratte bekommt desorientiert, vor allem unter Wasser, die Stücke können schnell demontiert, um die Ratte aus dem Rettungs werden: Diese wird aus zwei Gründen getan Wasser.
2. Füllen und Leeren des Tanks mit Wasser
   1. Füllen des Tanks mit Wasser
      1. Zu Beginn jeder Trainingseinheit, füllen den Tank mit frischem 32 ° C Leitungswasser bis zu einer Tiefe von etwa 12 cm. Rühren Sie das Wasser im Tank zu warm oder kühl Taschen minimieren.
         HINWEIS: In der Regel dauert es etwa 2 Stunden bis 12 Ratten zu trainieren. Während dieser Zeitsinkt die Wassertemperatur um etwa 4 ° C. Am Ende der Trainingseinheit kühlt das Wasser auf ca. 28 ° C. Seit 30 ° C Wasser thermo an Ratten, mit diesen warmen Wasser, anstatt Wasser mit Raumtemperatur, wird der Wärmeverlust während repetitives Training zu minimieren.
   2. Entleeren Sie den Tank mit Wasser
      1. Am Ende jeder Trainingseinheit, lassen Sie das Wasser aus dem Tank mit einem großen Schlauch, wie ein 4 m langes Stück 1 Zoll Innendurchmesser Schlauch. Vollständig bedeckt den Schlauch in den Behälter, wodurch keine Lufteinschlüsse in dem Schlauch. Platzieren schnell ein Ende des Schlauchs in den Bodenablauf. Die sich ergebende Siphon-Effekt wird das Wasser aus dem Tank ablassen.
      2. Während die Panzer Ende des Schlauchs unter der Wasseroberfläche, um den Siphon zu halten, kippen Sie den Tank auf der Kante, um eine vollständige Entleerung des Wassers zu erleichtern.
         Hinweis: Alternativ und anstatt Absaugen, installieren Sie einen Wasserhahn in der Nähe der Basis des Tanks, und verbindenein Schlauch aus dem Tank tippen, um den Bodenablauf.

3. Ratte Allergen Überlegungen

1. Einweghandschuhe tragen, wenn die Handhabung und das Training der Ratten. Die Handschuhe werden Kontakt mit dem Wasser in den Tank, die unweigerlich Rattenurin enthalten begrenzen.
   HINWEIS: Die Ratten werden während des Trainings nass werden, und das Zimmer wird mit einem "Wet-Ratte" Geruch gefüllt werden. Folglich prophylaktisches Regime von Antihistaminika verhindern oder die Effekte von Ratten-Allergien begrenzen. Trainer müssen möglicherweise auch Einwegstaubmasken oder N95-Masken zu tragen, sollten sie empfindlich auf Rattenallergene geworden.

4. Schwimmtraining

1. Tägliche Schwimmtraining
   HINWEIS: Die persönliche Erfahrung zeigt, dass jüngere Ratten lernen das Labyrinth besser und schneller, und damit beginnen das Training mit 35 g frisch entwöhnt Ratten ist vorzuziehen, mit adulten Ratten.
   1. Füllen Sie den Tank mit Wasser. Siehe 2.2.1.
   2. Legen FinishBereich und Kanalteiler bis 5 Schwimmkanäle erstellen.
   3. Während der ersten Trainingseinheit zu senken sanft die Ratten mit der Hand in das Wasser etwa 3-5 cm von der Zielbereich.
      HINWEIS: Bei ihrer Einführung in Wasserratten wird unsicher erscheinen, wie sie die erste Begegnung das Gefühl des Schwebens. Die Ratten werden unkoordiniert paddeln etwa bei dem Versuch, einen Weg, um das Wasser zu verlassen zu lokalisieren und erreichte schließlich die nahe gelegene Zielgelände. Aufgrund ihrer angeborenen Fähigkeit zu schwimmen, in nachfolgenden Studien die Ratten werden in einem viel mehr koordiniert in Richtung Zielbereich schwimmen.
      Anmerkung: Die Unterstützung, die Ratten von unten, damit ihre Füße auf den Ermittlern Händen. Senken Sie die Ratten ins Wasser, und lassen Sie sie schwimmen weg von der Hand, anstatt sie achtlos ins Wasser.
   4. Zwischen Studien lassen die Ratten bleiben im Zielbereich für mindestens 1 min. Dies ist, damit die Ratten zu pflegen und zu erforschen, so dass sie sehen den Zielbereich als "sicherer" Ortzwischen Studien gehen. Dies steht im Gegensatz zu Grabbing eine Ratte, die gerade eine Studie abgeschlossen hat und sofort Positionierung wieder im Wasser, um den nächsten Versuch starten.
      HINWEIS: externe Belohnung (dh Lebensmittel) Verwenden Sie nicht während des Trainings, um die Aktivierung von Belohnungs Schaltungen im Gehirn zu verhindern.
   5. Nach der Zielbereich Wartezeit, sanft halten die Ratten für 1 min vor Beginn des nächsten Versuch. Die Ratten mit einem Handtuch während dieser vorgericht halten seit wiederholende Einstieg in das Wasser sanft trocknet Ratten verursachen sehr nass und trocknete sie wird Hypothermie verhindern.
   6. Wiederholen 4.1.3. durch 4.1.5. 3 bis 5 Studien abzuschließen für jede Ratte während einer täglichen Schwimmtraining geschult werden.
   7. Entfernen Sie alle Kanalteiler und Zielbereich aus dem Tank.
   8. Leeren Sie das Wasser aus dem Tank. Siehe 2.2.2.
2. Wöchentliche schwimmen Trainingsplan
   1. Die täglichen Trainingseinheiten (siehe 4.1.) 5 Tage pro Woche, im Idealfall gleichzeitigjeden Tag.
   2. Beginnen Sie den ersten Versuch aus der Distanz erfolgreich am Vortag ausgehandelt. Beginnen Sie den zweiten und dritten Versuche von einem erhöhten Abstand.
   3. Bei jeder folgenden täglichen Trainingseinheit dabei den Abstand zwischen denen die Ratten im Wasser und im Zielbereich platziert. Für die ersten paar Trainingseinheiten erhöhen diesen Abstand von 5-10 cm. Nachdem die Ratten scheinen sich wohler mit Schwimmen, erhöhen die Abstände von 30-50 cm.
   4. Verwenden Sie größere Erhöhungen der Schwimmstrecken, während die Ratten lernen, mit einem geraden Abschnitt der baden-Kanal schwimmen. Im Gegensatz, zu lernen, die Haarnadel schwimmen schaltet zwischen den Kanälen vielleicht 2-3 Trainingseinheiten dauern.
      HINWEIS: Oft beim Warten im Zielraum, Ratten werden wieder ins Wasser, um zu schwimmen, und / oder untertauchen ihren Kopf unter Wasser noch auf dem Zielgelände Plattform sitzt.
   5. Wiederholen Sie diesen täglichen Trainingsprotokoll über 3 Wochen eine erfolgreiche Schwimm der gesamten 5 Kanälen zu gewährleisten.Diese sich wiederholenden Trainingsprotokoll sorgt für den erfolgreichen Abschluss des Labyrinths, zumal das Labyrinth abwechselnde links und rechts Haarnadelkurven.

5. Tauchkurse

HINWEIS: Nachdem die Ratten gelernt haben, erfolgreich zu verhandeln Schwimmen durch das Labyrinth sie bereit sind, Tauchausbildung beginnen.

1. Initial Tauchausbildung (erster Tag)
   1. Legen Startkammer. Füllen Sie den Tank mit Wasser (siehe 2.2.1.). Stellen Sie sicher, Wasserstand 1 cm unterhalb der Öffnung zum Startbereich.
   2. Legen Zielbereich und Kanalteiler bis 5 Schwimmkanäle erstellen.
   3. Während des ersten Tauchgang trainieren die Ratten an der Aufzugs in das Wasser innerhalb der Startkammer gesenkt werden. Zugriff auf das Labyrinth ist von der Unterseite des Startkammer. Während dieser ersten Sitzung der Wasserstand niedrig genug ist, so dass die Ratte kann leicht von der Startkammer in das Labyrinth zu schwimmen. Lassen Sie die Ratte zum Schwimmen durch das Labyrinth, um fortzufahrenZielbereich.
   4. Zwischen Studien lassen die Ratten bleiben im Zielbereich für mindestens 1 min.
      HINWEIS: externe Belohnung (dh Lebensmittel) Verwenden Sie nicht während des Trainings, um die Aktivierung von Belohnungs Schaltungen im Gehirn zu verhindern.
   5. Nach der Zielbereich Wartezeit, sanft halten die Ratten für 1 min vor Beginn des nächsten Versuch. Die Ratten mit einem Handtuch während dieser vorgerichtlichen Halt vorsichtig trocknen.
   6. Wiederholen 5.1.3. durch 5.1.5. bis 3 Studien abzuschließen für jede Ratte während dieser anfänglichen Tauchtrainingseinheit trainiert werden.
   7. Entfernen Sie alle Kanalteiler, starten Kammer und Zielbereich aus dem Tank.
   8. Leeren Sie das Wasser aus dem Tank. Siehe 2.2.2.
2. Initial Tauchausbildung (zweiter Tag)
   1. Legen Startkammer. Füllen Sie den Tank mit Wasser (siehe 2.2.1.). Stellen Sie sicher, Wasserstand etwas über der Öffnung zum Startbereich ist.
   2. Legen Zielbereich und Kanalteiler bis 5 Schwimmkanäle erstellen.
   3. Während des zweiten TauchgangTraining der Wasserstand erhoben worden, so dass die Startkammer die Ratte muss seinen Kopf unter dem Rand der Startkammer, um das Labyrinth betreten zu tauchen, um zu beenden. Betrachten Sie dies als ersten Tauchgang der Ratte. Lassen Sie die Ratte dann schwimmen weiter durch das Labyrinth zum Zielbereich.
   4. Lassen Sie die Ratten im Zielbereich bleiben für mindestens 1 Minute zwischen Studien.
      HINWEIS: externe Belohnung (dh Lebensmittel) Verwenden Sie nicht während des Trainings, um die Aktivierung von Belohnungs Schaltungen im Gehirn zu verhindern.
   5. Nach der Zielbereich Wartezeit, sanft halten die Ratten für 1 min vor Beginn des nächsten Versuch. Die Ratten mit einem Handtuch während dieser vorgerichtlichen Halt vorsichtig trocknen.
   6. Wiederholen 5.2.3. durch 5.2.5. bis 3 Studien abzuschließen für jede Ratte während dieser Tauchtrainingseinheit trainiert werden.
   7. Entfernen Sie alle Kanalteiler, starten Kammer und Zielbereich aus dem Tank.
   8. Leeren Sie das Wasser aus dem Tank. Siehe 2.2.2.
3. Initial Tauchausbildung (tHird Tag)
   1. Legen Startkammer. Füllen Sie den Tank mit Wasser (siehe 2.2.1.), So dass der Wasserstand über der Öffnung zum Startbereich ist.
   2. Legen Zielbereich und Kanalteiler bis 5 Schwimmkanäle erstellen. Legen Sie eine horizontale Stück Plexiglas unmittelbar außerhalb des Startbereich, um eine 5 cm lange Tauch Tunnel erstellen.
   3. Während des dritten Tauchgang Training die Ratte muss seinen Kopf unter dem Rand der Startkammer tauchen und schwimmen 5 cm unter Wasser, um das offene Wasser des Schwimmkanal zu erreichen. Lassen Sie die Ratte dann schwimmen weiter durch das Labyrinth zum Zielbereich.
      HINWEIS: Nachdem im Startbereich platziert, Ratten initiieren eigene Unterwasserflutung und damit diese als "freiwillig" Tauchgänge sein.
   4. Lassen Sie die Ratten im Zielbereich bleiben für mindestens 1 Minute zwischen Studien.
      HINWEIS: externe Belohnung (dh Lebensmittel) Verwenden Sie nicht während des Trainings, um die Aktivierung von Belohnungs Schaltungen im Gehirn zu verhindern.
   5. Nach der Zielbereich Wartezeit, sanft halten die Ratten für 1 min vor Beginn des nächsten Versuch. Die Ratten mit einem Handtuch während dieser vorgerichtlichen Halt vorsichtig trocknen.
   6. Wiederholen 5.3.3. durch 5.3.5. 3 bis 5 Studien abzuschließen für jede Ratte während dieser Tauchtrainingseinheit trainiert werden.
   7. Entfernen Sie alle Kanalteiler, starten Kammer und Zielbereich aus dem Tank.
   8. Leeren Sie das Wasser aus dem Tank. Siehe 2.2.2.
4. Wöchentliche Tauchtrainingsplan
   1. Die täglichen Trainingseinheiten (siehe 5.3.) 5 Tage pro Woche, idealerweise an der gleichen Zeit jeden Tag.
   2. Beginnen Sie den ersten Versuch aus der Distanz erfolgreich am Vortag ausgehandelt. Beginnen die zweiten und dritten Prozesse mit einem erhöhten Abstand Tauchen.
   3. Bei jeder folgenden täglichen Trainingseinheit erhöht die Länge des Tauchtunnel durch Hinzufügen zusätzlicher horizontaler Teiler, um den Abstand die Ratten müssen schwimmen unter Wasser zu verlängern. Für die ersten paar Trainingseinheiten Anstieg this Abstand von 5-10 cm. Nachdem die Ratten scheinen sich wohler mit Tauchen, erhöhen die Abstände von 30-50 cm.
      HINWEIS: überfordern nicht während aufeinander Studien versuchten Tauch Abstand. Falls notwendig, heben Sie das Ende des horizontalen Kanalabdeckung zu kürzeren Tauch Entfernungen bereitzustellen. Wenn während eines Tauchgangs Studie eine Ratte nicht das Ende des Tauchgangs Tunnel nicht erreichen und beginnt zu drehen um Unterwasser, schnell heben das Ende der Kanalabdeckung und lassen die Ratte an die Oberfläche und weiterhin seine schwimmen. Dies wird es der Ratte um einen längeren Tauchgang Distanz erfolgreich abzuschließen. Diese positive Verstärkung wird die Ratte halten, vorwärts durch den Unterwassertunnel mit jedem Tauchgang Studie.
   4. Verwenden Sie größere Erhöhungen der Tauch Distanzen, während die Ratten werden lernen, mit einem geraden Abschnitt der baden-Kanal tauchen. Im Gegensatz, zu lernen, um die Haarnadel tauchen schaltet zwischen den Kanälen vielleicht 2-3 Trainingseinheiten dauern.
      HINWEIS: Oft beim Warten im Zielraum, Ratten wird erneut eingeben thE Wasser zu schwimmen, und / oder tauchen den Kopf unter Wasser noch auf dem Zielgelände Plattform sitzt.
   5. Wiederholen Sie diesen täglichen Trainingsprotokoll über 3 Wochen eine erfolgreiche Tauch der gesamten 5 Kanälen zu gewährleisten. Diese sich wiederholenden Trainingsprotokoll sorgt für den erfolgreichen Abschluss des Labyrinths, zumal das Labyrinth abwechselnde links und rechts Haarnadelkurven.
      HINWEIS: Die volle 6 Wochen schwimmen und tauchen Trainingsplan mit dem Wachstum von 35 g frisch entwöhnt Ratten zusammenfällt, um ein Körpergewicht von 300 g zu erreichen.
   6. Nach dem täglichen Trainingseinheiten sind vollständig, und die Ratten in ihre eigenen Käfig zurückgegeben worden, sicherzustellen, Ratten schnell ihr Fell durch Pflege zu trocknen, oder, falls erforderlich, legen Sie ein Heizkissen unter ihrem Käfig, die Ratten warm halten, bis ihr Fell trocken ist.

6. Experimentelle Variationen

HINWEIS: Die grundlegende experimentelle Aufbau und Tiertrainings wurden oben beschrieben. Doch nur Verhaltenstraining provides ein Modell, um mit anderen experimentellen Techniken verwendet, um Daten von Interesse zu sammeln. Basisprotokolle modifiziert werden, um bestimmte Aspekte des Tauchantwort zu untersuchen. Beispiele für diese Modifikationen und einige Überlegungen für die Erfassung von Daten unter Verwendung dieser physiologischen und neuroanatomische Techniken sind unten angegeben.

1. Implantierbare Telemetrie-Sender
   1. Nach Abschluss der Ausbildung eine handelsübliche telemetrischen Sendern pulsierenden arteriellen Blutdruck von Schwimmen und Tauchen Ratten übertragen. Erhalten lokalen IACUC Zulassung für Verfahren bezüglich der Operation und postoperative Erholung. Folgen Sie den Implantationsverfahren von der Gesellschaft für ihre Sender vorgeschlagen, und eine vollständige Erholung von der Operation vor der Rückkehr die Ratte in das Wasser.
   2. Sicherstellen, dass die Antenne empfängt das Funksignal in der Nähe ist, wenn die Ratte im Wasser.
      HINWEIS: Wasser dämpft Funksignale, so dass die Entfernung, die das Funksignal needs reise durch das Wasser wird zu einem begrenzenden Faktor der Behälterabmessungen.
   3. Verwenden Sie einen Handantennenstab, sondern als ein Rattenkäfig große Antenne, um die Ratte zu folgen, wie es durch das Labyrinth fortschreitet. Halten Sie den Zauberstab-Antenne innerhalb von 30 cm von der Ratte, um sicherzustellen, dass das Funksignal nicht verloren geht, während die Ratte unter Wasser.
2. Trailing Kanülen
   1. Redesign der Kanalteiler und horizontale Stücke schaffen das Dach der Tauchtunnel, so dass die Kanüle Wegen entlang hinter der Ratte während der Progression durch das Labyrinth.
      HINWEIS: Der modulare Aufbau der Kanäle ist von größter Bedeutung und muss auch ermöglichen eine schnelle Wiederherstellung der Ratte aus dem Unterwasser-Labyrinth. Wenn eine Kanüle Haken und wurde von der Ratte verdrängt, konnte die Ratte bald ausbluten unter Wasser, wenn die Kanüle nicht schnell wieder angebracht.
   2. Verwenden Hinter arteriellen Kanülen zur arteriellen Blutdruck und Herzfrequenz in freiwillig tauchen Ratten aufzuzeichnen. Verwenden Sie ein 90 cm Stück PE50 alseine Hinter Kanüle.
      ANMERKUNG: Diese Kanülenlänge lang genug ist, um die Ratte mit dem Druckwandler zu verbinden, solange noch die Ratte durch das Labyrinth Fortschritt, ist aber kurz genug, um die Kanüle Totraum zu minimieren, und ist nahe genug an dem Druckwandler, um eine ausreichende Genauigkeit der zu ermöglichen arterielle Drucksignal.
   3. Verwenden Hinter venösen (oder arteriellen) Kanülen pharmazeutische Mittel, wie parasympathischen und sympathischen Agonisten und Antagonisten zu injizieren oder Tracern oder Farbstoffe, die die Verteilung der Herzleistung zu bestimmen, zu injizieren.
   4. Zurückzuziehen Blutproben von den Ratten mit der venösen (oder arteriellen) Kanülen während die Ratten unter Wasser zu Wasser Katecholamin-Spiegel oder der Blutchemie zu bestimmen.
      HINWEIS: Minimieren Sie die Länge der Hinter Kanüle und Konto für die Kanüle Totraum während Blutentnahmen.
3. Nachweis der Aktiv Brainstem Neuronen
   1. Verwenden immunologischen Nachweis des Fos-Proteins an identify bestimmte Bereiche des Hirnstamms, der Teil des Tauchantwort.
      HINWEIS: Während sich wiederholende Einleitung einer kardio-Reflex, Hirnstammneuronen, die Teil dieser Reflexschaltung kann aktiviert werden und produzieren ein Protein namens Fos sind.
   2. Wiederholt tauchen Ratten durch das Labyrinth alle 5 min für 2 Stunden für insgesamt 24 Tauchgänge.
      HINWEIS: Andere Protokolle, die auch veran neuronalen Fos Herstellung kann auch verwendet werden. Zur Aktivierung von Neuronen im Hirnstamm Reaktion auf Stress beteiligt zu vermeiden, ist das Verhalten, das wiederholt wird, als Teil der Verhaltenstraining einbezogen werden.
4. Blut Corticosteron-Gehalte während Tauchen
   1. Verwenden Corticosteron als Indikator für die Höhe der Belastung Ratten Erfahrung beim Schwimmen und Tauchen.
   2. Um Blut für Corticosteron Analyse zu erhalten, ziehen 0,1 ml Blutproben aus der Schwanzvene von Ratten 15 min nach 3 freiwillige schwimmt oder Tauchgänge.
      HINWEIS: Vorläufige Experimente zeigten, dass 15 min ist suffizient Zeit für die Produktion und Freisetzung von Corticosteron in den Kreislauf zu ermöglichen und zu einer Peakplasmaspiegel Corticosteron. Seit Corticosteron Ebenen haben einen circadianen Rhythmus, planen alle Blutentnahmen zur gleichen Tageszeit und entsprach mit dem Timing der Trainingseinheiten.

Erfolgreicher Abschluss der beschriebenen Schwimmen und Tauchen Trainingsverfahren können den Stress von Ratten erlebt beim Tauchen unter Wasser zu verringern. Blut Corticosteron Ebenen zeigen, dass wiederholte tägliche Training verringert den Leidhaftigkeit mit freiwilligen Tauchen verbunden sind, und ausgebildete Ratten finden Tauchen nicht mehr Stress als die täglich von einem Menschen (Abbildung 2; ¹⁷⁾ abgewickelt. Umgekehrt, Ratten nicht in der Tauchprotokoll geschult finden freiwillige Tauch stressig (Abbildung 2; ^17). Zusätzlich beide trainierten und untrainierten Ratten finden gezwungen Tauchen bis der größte Stressfaktor (Abbildung 2; ¹⁷⁾ sein.

Und Hinter Kanülen (Abbildung 4; ^21-23), die Herz-Kreislauf Antworten von Schwimmen, Tauchen und freiwillige Zwangstauch Ratten wurden mit implantierten Telemetriegeräte ^(8,17-20 Abbildung 3) aufgezeichnet. Unmittelbar nach freiwilligenUntertauchen, und innerhalb eines einzigen Schlag, Herzfrequenz sinkt um 78% und der mittlere arterielle Blutdruck sinkt um 25% ^17. Diese Ergebnisse zeigen, dass freiwillig tauchen Ratten zeigen die gleichen kardiorespiratorische Veränderungen typischerweise in anderen Tauch Tieren gesehen. Hinter arteriellen Kanülen wurden verwendet, um die Muscarin-Antagonist Atropin, der die Bradykardie mit freiwilligen Tauchen (4; ²¹⁾ zugeordnet eliminiert zu injizieren, und um die Verteilung der Herzleistung ²² einschließlich des zerebralen Blutflusses ^23, bei freiwilligen Tauch bestimmen. Hinter Kanülen wurden auch verwendet, um zu zeigen, dass Ratten ignorieren zunehmende arterielle Hypoxämie und Hyperkapnie während sie untergetaucht sind ^18, und das bereits bestehende Chemorezeptor-Laufwerk hat keine Auswirkungen auf das kardiovaskuläre Reaktionen auf freiwilliger Tauch ²¹ haben.

Neuronen innerhalb Laminae I und II der ventralen Markhinterhorn (MDH) auszudrücken Fos during freiwillige Tauchen und diese Neuronen kann die anfängliche Hirnstamm afferenten Relais des Tauchantwort (; ²⁴ Abbildung 5) bilden. Wichtige Hirnstamm kardiorespiratorischen Kontrollbereiche, wie der Schwanzkompressorbereich (CPA), Nucleus tractus Einsiedler (NTS), rostral ventrolateralen Medulla (RVLM) und peribrachial Regionen erhöht alle anzeigen Fos Kennzeichnung während freiwillige Tauch verglichen mit Schwimm ^25. Neuronen in chemosensitiven Regionen des Hirnstamms auszudrücken Fos nach langer Dauer gezwungen Tauchgänge ^18.

Abb. 1: Schematische Darstellung der Tauchflasche Eine Plexiglastank (100 x 60 x 15 cm) wurde verwendet, um ein einfaches Labyrinth, bestehend aus fünf 1 m lange Kanäle zu erstellen. Der Tank wurde mit 30 ° C Leitungswasser gefüllt, und die Ratten wurden zunächst negotiat ausgebildetene das Labyrinth durch Schwimmen auf der Oberfläche des Wassers, im Start-Bereich (oben links) mit dem Zielbereich (unten rechts). Die Ratten wurden dann geschult, um durch das Labyrinth zu tauchen, hielt unter Wasser durch horizontale Plexiglas Stücke platziert 2-3 cm unter der Wasseroberfläche. [Diese Zahl hat sich von ²⁶ modifiziert worden]

Figur 2: Corticosteron-Messungen. Blutentnahmen aus Rattenschwanzvenen wurden verwendet, um Corticosteron-Konzentrationen (Mittelwert ± SE) von Ratten in ihren Käfigen (Naive) links messen, Ratten für 10 min / Tag (behandelt werden), Ratten darauf trainiert, schwimmen und tauchen (Ausgebildete) und Ratten behandelt dass erhielt keine schwimmen oder tauchen Anlernen (ungelernter). Corticosteron wurde gemessen, nachdem ausgebildete Ratten hatten ihre Schwimmtraining (Links bar eingestellt) abgeschlossen hatte, nachdem ausgebildete Ratten ihre freiwillige div abgeschlossene Ausbildung (Zentrum Reihe von Balken), und nach trainiert Ratten hatten ihre Zwangstauchausbildung (Recht bar eingestellt) abgeschlossen. 1 zeigt Wert ist deutlich größer als naiv; 2 zeigt Wert ist deutlich größer als behandeltes; 3 zeigt Wert ist deutlich größer als Ausgebildete; * Bedeutet, dass bei trainierten Ratten Wert bei Zwangs Tauchgang ist deutlich größer als bei der freiwilligen Tauchgang. [Diese Zahl hat sich von ¹⁷ modifiziert worden]

Abbildung 3: Der arterielle Blutdruck Spuren von telemetrischen Sendern Rohdaten Spuren, pulsierenden arteriellen Blutdruck während Schwimmen (linke Spalte), freiwillige Tauchen (mittlere Spalte) und zwang Tauchen (rechte Spalte) von Ratten darauf trainiert, schwimmen und tauchen durch das Labyrinth. (untere Reihe) und von Ratten, die nicht die trai hattening-Verfahren (obere Reihe). Tauchen unter Wasser (sowohl freiwillige und erzwungene Untertauchen) produziert eine sofortige Bradykardie und langsameren Beginn Anstieg des arteriellen Drucks, während Schwimmen an der Oberfläche des Wassers verursacht keine solchen kardiovaskulären Veränderungen. Bars unter Spuren zeigen Perioden Flutung. Breaks in Spuren zeigen, die Zeiträume, telemetrische Signal verloren ging. [Diese Zahl hat sich von ¹⁷ modifiziert worden]

Abbildung 4: Atropin beseitigt Tauch Bradykardie. Originalaufnahmen der pulsierenden arteriellen Blutdruck von freiwillig tauchen Ratten (A) vor und (B) nach Atropin-Vorbehandlung. Spuren wurden unter Verwendung eines Hinterarterienkanüle erhalten. Bevor Atropin Vorbehandlung, verminderte arterielle Druck etwas nach Untertauchen, aber tHenne erhöht, um größer als vor dem Tauchgang für den Rest des Tauchgangs. Die Herzfrequenz wurde aus benachbarten Pulsdruck Abständen bestimmt. Beim Untertauchen gab es eine unmittelbare und wesentliche Bradykardie, die für die Dauer des Tauchgangs aufrechterhalten wurde. Nach parasympathische Blockade durch Atropin Vorbehandlung der Bradykardie wurde eliminiert. Es gab auch eine Erhöhung des arteriellen Drucks während des Tauchgangs. Die Bar unter der Messkurve stellt den Zeitraum von Flutung. [McCulloch, unveröffentlicht]

Abbildung 5: Fos Etikettierung im MDH. Mikrofotografien des Trigeminus Markhinterhorn (MDH) und dem Rücken Trigeminus-Trakt (SP5) bei Ratten darauf trainiert, tauchen unter Wasser. (A) In einer Kontrollratte, die nicht wiederholt tauchen habe es keine Fos Etikettierung. (B) in einem Schwimmratte ist sehr beleuchtettle Fos Etikett in der MDH (große Pfeilspitze) oder paratrigeminal Kern (kleiner Pfeil) in sp5. (C) In einem Tauchratten es mehr Fos Kennzeichnung ventral sowohl in der MDH (große Pfeilspitze) und paratrigeminal Kern (kleine Pfeile) im Vergleich zu das Schwimmen und Kontrollratte. Legen Sie im Panel (A) zeigt die rostral-kaudale Lage des Panels AC. Maßstabsbalken in Panel C ist 100 um. [Diese Zahl hat sich von ²⁴ modifiziert worden]

Abbildung 6: Aktiviert katecholaminerge Neuronen vom Tauchen Ratten. Mikrofotografien zeigen die medullas eines nichttauchKontrollRatte (A, C und E) und einer freiwillig Tauch Ratte (B, D und F). Das Hirngewebe wurde immunhistologisch sowohl eine Fos verarbeitetd Tyrosinhydroxylase (TH), Herstellung braun und schwarz TH somas Fos Kernen. Offene Pfeilspitzen identifizieren einfach markierten TH-positiven Neuronen, während durchgezogene Pfeile identifizieren Fos + TH doppelt markierten Neuronen. A1 Neuronen sind in A und B. C1 Neuronen identifiziert werden in C identifiziert und D. A5 Neuronen in E und F. Weitere Fos und TH doppelt markierten sind in der A1, C1 gesehen identifiziert und A5 Regionen der Tauch Ratte als in der nichttauchKontrollRatte. Kalibrierung Bar in E ist für Platten AF und 250 & mgr; m. Kalibrierung Bar im Einschub in F ist für alle Einsätze und 50 um. [Diese Zahl hat sich von ²⁶ modifiziert worden]

Ratten in ihren verwilderten bilden können und tun, nutzen halbaquatischen Umwelt und oft tauchen unter Wasser, während der Nahrungssuche ^6. So ist es nicht allzu überraschend, dass Ratten können sehr leicht trainiert, freiwillig unter Wasser tauchen werden. Die beschriebenen Trainingsverfahren kann bis 6 Wochen, die neu entwöhnt Ratten zu einer Körpergröße in den meisten erwachsenen Rattenhirn Atlanten verwendet (~ 300 g) bringen wird dauern. So sind die Gehirne von diesen ausgebildete Tiere werden leichter vergleichbar mit den in diesen Atlanten identifizierten anatomischen Strukturen sein.

Nachdem sie im Startbereich platziert meisten Ratten werden ihre Unterwasser schwimmen innerhalb von 20 sec beginnen. Jedoch gelegentlich eine Ratte auf 5 min oder länger dauern bis vor Beginn ihres freiwilligen Tauchgang. Während es in diesem Stadium verlockend, die Ratten in den Unterwassertunnel zu erzwingen, dies in der Regel vermieden werden sollte, um die Ratten Zuordnen des Wasser mit einer negativen Erfahrungen zu verhindern. Nagetiere können stur sein und darf initiVerbündeter verweigern während der Trainingseinheiten zu tauchen, aber sobald sie erkennen, der einzige Weg, um das Wasser zu verlassen ist, indem Sie den Tauchgang durch das Labyrinth, sie in der Regel bald nach dem im Startbereich platziert initiieren ihre Tauchgänge.

Ein kritischer Aspekt der Wiederholungen und methodischen Ausbildungsverfahren ist, dass sie in einer Weise, um die Spannung von den Ratten erlebten reduzieren geführt. Für Vermieter Ratten erkunden ihre Umwelt, vor allem während im Zielbereich zwischen Studien, scheint Stress weiter zu reduzieren. Ratten werden oft wieder in den Wasser zu schwimmen, und / oder untertauchen ihren Kopf unter Wasser noch auf dem Zielgelände Plattform sitzt. Dies legt nahe, dass Ratten sind nicht von Natur aus wasser aversiven. Zusätzlich ist es zwar nicht ungewöhnlich, Ratten, fäkale Pellets beim Schwimmen oder Tauchen oder beim Warten im Zielraum, tägliches Training führt zu weniger fäkale Pellets ¹⁷ zu produzieren. Im Allgemeinen ist die weniger gestresst die Ratten während der Ausbildung sind, desto weniger pellets sie zu produzieren. Etwaige fäkalen Pellets, die erzeugt werden, werden aus dem Wasser oder Zielbereich entfernt so bald wie möglich, um das Wasser relativ sauber zu halten.

Ratten können gelegentlich zu blutigen Nasen beim Schwimmen und Tauchen, die ein Ergebnis der Insufflation von Wasser in die Nasengänge sein können. Das Auftreten von Blut kann aufgrund osmotischer Spannungen innerhalb der Nasenschleimhaut werden. Während im Zielbereich zwischen Studien die Ratten werden sich Bräutigam. Als Folge Blut aus der Nase kann über die Ratten Kopf und Schnauze umverteilt bekommen, was den Ratten eine leichte Rotstich, besonders um die Augen, im Laufe eines Trainings. Auch kann ein gelegentlicher Ratte Tauch stressig (auf dh durch Drehen um und verirren beim Tauchen unter Wasser (siehe Hinweis nach 5.4.3., Wie man dies zu) verhindern) zu finden und / oder negative Taucherlebnisse. In diesen Ratten können Porphyrin in den Ecken ihrer Augen erscheinen, signalisiert eine Stress response.

Die Größe der Tauchtank wird zu einem gewissen Grad bestimmen die Raumanforderungen. Der beschriebene Behälter ist konstruiert für Ratten schwimmen 2-3 cm unter der Oberfläche des Wassers durch ein 5 m langes Labyrinth Plexiglas, eine Unterwasserschwimmdauer 10-15 sec ^{17,19,24,26,27} geben. Sollte ein Experiment entworfen werden, um Antworten von längerer Dauer Tauchgang zu messen, oder von einem tieferen Tauchwasser, muss der Tank erneut ausgeführt werden. Die Raumanforderungen könnten dann auch ändern, um die Dimensionen einer neu gestalteten Tauchtank passen. Wenn es keinen Bodenablauf in der Eingriffsraum zur Verfügung, kann das Wasser aus dem Tank in einem großen Behälter gesammelt werden, wie beispielsweise ein 60 gal Mülltonne, die dann an anderer Stelle in bequemer Weise entleert werden kann.

Die Fos-Technik kann mit anderen neuronalen Nachweisverfahren verwendet werden, um weiter zu identifizieren und zu charakterisieren, die Teil Neuronen des Hirnstamms Schaltung des Sprungantwort. Beispielsweise,Und globosa Neuronen im lateralen A7 Bereich ^26,27, die während freiwilliger aktiviert werden; Fos Erkennung in Verbindung mit Tyrosin-Hydroxylase-Färbung hat katecholaminerge Neuronen in der A1, C1, A2, A5 und Unter coeruleus Bereichen ⁽²⁶ Abbildung 6) identifiziert Tauchen. Auch hat Fos Erkennung in Verbindung mit der retrograden Tracers Cholera-Toxin die Zellkörper der Motoneuronen kardialen vagalen innerhalb der externen Bildung des Nucleus ambiguus, die bei freiwilligen Tauch ²⁰ aktiviert werden, identifiziert.

Untersuchung des zentralen Nerven Integration der kardiorespiratorischen antwortet Tauch ist für eine Reihe von Gründen, ^6,8,28. Die Tauchantwort ermöglicht Tieren, einschließlich des Menschen, zu untergetaucht Unterwasser ohne Atem für längere Zeit bleiben. Die Tauchantwort stellt eine funktionelle Reorganisation der Hirnstamm homöostatischen Kontrolle, und zeigt eine der mächtigsten paMuste r der bei Tieren beobachteten vegetativen Reflexe. Das Tauchen Antwort kann auch wichtige klinisch beim Menschen als Teil der trigemino-kardialen Reflex, Nasen-Rachen-Reflex, und / oder plötzlichen Kindstod sein. Schließlich wird ein Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die im Hirnstamm von Ratten existiert helfen festzustellen, wie kortikalen Afferenzen können grundlegende Hirnstamm vegetativen Reflexe modifizieren. All diese Überlegungen machen Studie der zentralen Aspekte des Säugetiertauchantwort inhärent sinnvoll und interessant. Mit den beschriebenen Verfahren an Ratten zu trainieren, um sich freiwillig zu tauchen unter Wasser besser Untersuchung der zentralen Aspekte des Säugetiertauchantwort als die Verwendung von Zwangs tauchte Tieren ermöglichen. Denn die Trainingsverfahren wie beschrieben 1) reduzieren Aktivierung von ZNS Stress Schaltung und 2) haben CNS nicht aktiviert Lohn-Schaltung, da externe Belohnungen werden nicht verwendet.

Der Autor ist Berater für Stölting Company, und vorausgesetzt, das gesamte Design und die Spezifikationen der McCulloch Tauchflasche Maze, um sie für kommerzielle Zwecke.

Forschung mit Mitteln des Midwestern University Office of Research und geförderten Programmen unterstützt. Auch dank der Midwestern University Tierhaltung und Erik Warren.