Method Article
Detailed instructions are provided on how to train rats to voluntarily dive underwater through a 5 m long Plexiglas maze. Because the brains of rats have been very well characterized, voluntarily diving rats may help elucidate the central pathways of the mammalian diving response.
Underwater submergence produces autonomic changes that are observed in virtually all diving animals. This reflexly-induced response consists of apnea, a parasympathetically-induced bradycardia and a sympathetically-induced alteration of vascular resistance that maintains blood flow to the heart, brain and exercising muscles. While many of the metabolic and cardiorespiratory aspects of the diving response have been studied in marine animals, investigations of the central integrative aspects of this brainstem reflex have been relatively lacking. Because the physiology and neuroanatomy of the rat are well characterized, the rat can be used to help ascertain the central pathways of the mammalian diving response. Detailed instructions are provided on how to train rats to swim and voluntarily dive underwater through a 5 m long Plexiglas maze. Considerations regarding tank design and procedure room requirements are also given. The behavioral training is conducted in such a way as to reduce the stressfulness that could otherwise be associated with forced underwater submergence, thus minimizing activation of central stress pathways. The training procedures are not technically difficult, but they can be time-consuming. Since behavioral training of animals can only provide a model to be used with other experimental techniques, examples of how voluntarily diving rats have been used in conjunction with other physiological and neuroanatomical research techniques, and how the basic training procedures may need to be modified to accommodate these techniques, are also provided. These experiments show that voluntarily diving rats exhibit the same cardiorespiratory changes typically seen in other diving animals. The ease with which rats can be trained to voluntarily dive underwater, and the already available data from rats collected in other neurophysiological studies, makes voluntarily diving rats a good behavioral model to be used in studies investigating the central aspects of the mammalian diving response.
The diving response consists of a suite of autonomic reflexes seen in animals of all vertebrate classes 1. In response to submersion under water, this reflexly-induced response consists of apnea, bradycardia and an alteration of blood flow that maintains flow to the heart, brain and exercising muscles while limiting flow to viscera and non-exercising muscles 2. Many of the metabolic and cardiorespiratory aspects of the mammalian diving response have been well investigated 2,3, including those in humans 4,5. However, what has been relatively lacking, until recently, is investigation of the central integrative aspects of the diving response. What happens within the brainstem, and what is the neuronal step-by-step pathway, that connects afferent inputs to efferent outputs during this autonomic reflex? Answering these questions will require an appropriate animal model 6. An adage in comparative physiology, the Krogh principle 7, is that for every research question there is some animal of choice on which the problem can be most conveniently studied. A most appropriate animal for studying the central aspects of the diving response is the rat 6,8. In large part this is due to the fact that the brains of rats have been very well characterized, both anatomically and functionally, and many rat brain atlases are available 6. Additionally the rat is particularly useful in cardiorespiratory research, because the physiology of the rat is well known across all major organ systems, and the rat is well regarded as an animal model in systems biology 6. Finally, the laboratory rat is the domesticated version of the wild Rattus norvegicus, an animal that routinely swims and dives underwater 6. Based on these considerations, the rat is a good choice for studies investigating the central aspects of the mammalian diving response. In comparison, using marine animals to investigate the central aspects of the mammalian diving response would be much more difficult. This is due in large part to marine animals having comparatively large and non-uniformly sized brains, and the relative difficulty and high cost of housing these animals.
Rats have previously been used to investigate many aspects of the mammalian diving response, primarily in situations involving forced underwater submergence 9-12. However many studies in marine and aquatic animals have shown that there can be a differential response to diving based upon whether the submergence was forced or voluntary 2,13. Diving animals may show an extremely intense bradycardia during forced diving but a much less intense bradycardia during voluntary diving. The “stress” of forced submergence can significantly change the cardiovascular responses of diving in many animals 14. Small rodents such as muskrats also show a more intense diving response during forced submergence than during voluntary diving 15,16. Thus, if rats are to be used to investigate the central aspects of the mammalian diving response, investigators should be aware that a rat forcibly submerged underwater may produce a response different from that of a voluntarily diving rat.
The goal of this article is to provide detailed instructions on how to train rats to voluntarily dive underwater. These procedures are not technically difficult, but can be time-consuming. The training is conducted in such a way as to reduce the stressfulness that could otherwise be associated with forced underwater submergence. This voluntary diving technique should minimize activation of central stress pathways and thus better allow investigation of the central aspects of the diving response. By itself, training rats to voluntarily dive underwater generates no data that can be used to investigate the central aspects of the mammalian diving response. Therefore examples of how voluntarily diving rats have been used in conjunction with other physiological and neuroanatomical research techniques, and how the basic dive training may need to be modified to accommodate theses other techniques, are also provided.
HINWEIS: beschriebenen Versuchsprotokolle hier bei Midwestern University durchgeführt wurden von der Midwestern University IACUC genehmigt.
1. Raumanforderungen
2. Tauchflasche
3. Ratte Allergen Überlegungen
4. Schwimmtraining
5. Tauchkurse
HINWEIS: Nachdem die Ratten gelernt haben, erfolgreich zu verhandeln Schwimmen durch das Labyrinth sie bereit sind, Tauchausbildung beginnen.
6. Experimentelle Variationen
HINWEIS: Die grundlegende experimentelle Aufbau und Tiertrainings wurden oben beschrieben. Doch nur Verhaltenstraining provides ein Modell, um mit anderen experimentellen Techniken verwendet, um Daten von Interesse zu sammeln. Basisprotokolle modifiziert werden, um bestimmte Aspekte des Tauchantwort zu untersuchen. Beispiele für diese Modifikationen und einige Überlegungen für die Erfassung von Daten unter Verwendung dieser physiologischen und neuroanatomische Techniken sind unten angegeben.
Erfolgreicher Abschluss der beschriebenen Schwimmen und Tauchen Trainingsverfahren können den Stress von Ratten erlebt beim Tauchen unter Wasser zu verringern. Blut Corticosteron Ebenen zeigen, dass wiederholte tägliche Training verringert den Leidhaftigkeit mit freiwilligen Tauchen verbunden sind, und ausgebildete Ratten finden Tauchen nicht mehr Stress als die täglich von einem Menschen (Abbildung 2; 17) abgewickelt. Umgekehrt, Ratten nicht in der Tauchprotokoll geschult finden freiwillige Tauch stressig (Abbildung 2; 17). Zusätzlich beide trainierten und untrainierten Ratten finden gezwungen Tauchen bis der größte Stressfaktor (Abbildung 2; 17) sein.
Und Hinter Kanülen (Abbildung 4; 21-23), die Herz-Kreislauf Antworten von Schwimmen, Tauchen und freiwillige Zwangstauch Ratten wurden mit implantierten Telemetriegeräte (8,17-20 Abbildung 3) aufgezeichnet. Unmittelbar nach freiwilligenUntertauchen, und innerhalb eines einzigen Schlag, Herzfrequenz sinkt um 78% und der mittlere arterielle Blutdruck sinkt um 25% 17. Diese Ergebnisse zeigen, dass freiwillig tauchen Ratten zeigen die gleichen kardiorespiratorische Veränderungen typischerweise in anderen Tauch Tieren gesehen. Hinter arteriellen Kanülen wurden verwendet, um die Muscarin-Antagonist Atropin, der die Bradykardie mit freiwilligen Tauchen (4; 21) zugeordnet eliminiert zu injizieren, und um die Verteilung der Herzleistung 22 einschließlich des zerebralen Blutflusses 23, bei freiwilligen Tauch bestimmen. Hinter Kanülen wurden auch verwendet, um zu zeigen, dass Ratten ignorieren zunehmende arterielle Hypoxämie und Hyperkapnie während sie untergetaucht sind 18, und das bereits bestehende Chemorezeptor-Laufwerk hat keine Auswirkungen auf das kardiovaskuläre Reaktionen auf freiwilliger Tauch 21 haben.
Neuronen innerhalb Laminae I und II der ventralen Markhinterhorn (MDH) auszudrücken Fos during freiwillige Tauchen und diese Neuronen kann die anfängliche Hirnstamm afferenten Relais des Tauchantwort (; 24 Abbildung 5) bilden. Wichtige Hirnstamm kardiorespiratorischen Kontrollbereiche, wie der Schwanzkompressorbereich (CPA), Nucleus tractus Einsiedler (NTS), rostral ventrolateralen Medulla (RVLM) und peribrachial Regionen erhöht alle anzeigen Fos Kennzeichnung während freiwillige Tauch verglichen mit Schwimm 25. Neuronen in chemosensitiven Regionen des Hirnstamms auszudrücken Fos nach langer Dauer gezwungen Tauchgänge 18.
Abb. 1: Schematische Darstellung der Tauchflasche Eine Plexiglastank (100 x 60 x 15 cm) wurde verwendet, um ein einfaches Labyrinth, bestehend aus fünf 1 m lange Kanäle zu erstellen. Der Tank wurde mit 30 ° C Leitungswasser gefüllt, und die Ratten wurden zunächst negotiat ausgebildetene das Labyrinth durch Schwimmen auf der Oberfläche des Wassers, im Start-Bereich (oben links) mit dem Zielbereich (unten rechts). Die Ratten wurden dann geschult, um durch das Labyrinth zu tauchen, hielt unter Wasser durch horizontale Plexiglas Stücke platziert 2-3 cm unter der Wasseroberfläche. [Diese Zahl hat sich von 26 modifiziert worden]
Figur 2: Corticosteron-Messungen. Blutentnahmen aus Rattenschwanzvenen wurden verwendet, um Corticosteron-Konzentrationen (Mittelwert ± SE) von Ratten in ihren Käfigen (Naive) links messen, Ratten für 10 min / Tag (behandelt werden), Ratten darauf trainiert, schwimmen und tauchen (Ausgebildete) und Ratten behandelt dass erhielt keine schwimmen oder tauchen Anlernen (ungelernter). Corticosteron wurde gemessen, nachdem ausgebildete Ratten hatten ihre Schwimmtraining (Links bar eingestellt) abgeschlossen hatte, nachdem ausgebildete Ratten ihre freiwillige div abgeschlossene Ausbildung (Zentrum Reihe von Balken), und nach trainiert Ratten hatten ihre Zwangstauchausbildung (Recht bar eingestellt) abgeschlossen. 1 zeigt Wert ist deutlich größer als naiv; 2 zeigt Wert ist deutlich größer als behandeltes; 3 zeigt Wert ist deutlich größer als Ausgebildete; * Bedeutet, dass bei trainierten Ratten Wert bei Zwangs Tauchgang ist deutlich größer als bei der freiwilligen Tauchgang. [Diese Zahl hat sich von 17 modifiziert worden]
Abbildung 3: Der arterielle Blutdruck Spuren von telemetrischen Sendern Rohdaten Spuren, pulsierenden arteriellen Blutdruck während Schwimmen (linke Spalte), freiwillige Tauchen (mittlere Spalte) und zwang Tauchen (rechte Spalte) von Ratten darauf trainiert, schwimmen und tauchen durch das Labyrinth. (untere Reihe) und von Ratten, die nicht die trai hattening-Verfahren (obere Reihe). Tauchen unter Wasser (sowohl freiwillige und erzwungene Untertauchen) produziert eine sofortige Bradykardie und langsameren Beginn Anstieg des arteriellen Drucks, während Schwimmen an der Oberfläche des Wassers verursacht keine solchen kardiovaskulären Veränderungen. Bars unter Spuren zeigen Perioden Flutung. Breaks in Spuren zeigen, die Zeiträume, telemetrische Signal verloren ging. [Diese Zahl hat sich von 17 modifiziert worden]
Abbildung 4: Atropin beseitigt Tauch Bradykardie. Originalaufnahmen der pulsierenden arteriellen Blutdruck von freiwillig tauchen Ratten (A) vor und (B) nach Atropin-Vorbehandlung. Spuren wurden unter Verwendung eines Hinterarterienkanüle erhalten. Bevor Atropin Vorbehandlung, verminderte arterielle Druck etwas nach Untertauchen, aber tHenne erhöht, um größer als vor dem Tauchgang für den Rest des Tauchgangs. Die Herzfrequenz wurde aus benachbarten Pulsdruck Abständen bestimmt. Beim Untertauchen gab es eine unmittelbare und wesentliche Bradykardie, die für die Dauer des Tauchgangs aufrechterhalten wurde. Nach parasympathische Blockade durch Atropin Vorbehandlung der Bradykardie wurde eliminiert. Es gab auch eine Erhöhung des arteriellen Drucks während des Tauchgangs. Die Bar unter der Messkurve stellt den Zeitraum von Flutung. [McCulloch, unveröffentlicht]
Abbildung 5: Fos Etikettierung im MDH. Mikrofotografien des Trigeminus Markhinterhorn (MDH) und dem Rücken Trigeminus-Trakt (SP5) bei Ratten darauf trainiert, tauchen unter Wasser. (A) In einer Kontrollratte, die nicht wiederholt tauchen habe es keine Fos Etikettierung. (B) in einem Schwimmratte ist sehr beleuchtettle Fos Etikett in der MDH (große Pfeilspitze) oder paratrigeminal Kern (kleiner Pfeil) in sp5. (C) In einem Tauchratten es mehr Fos Kennzeichnung ventral sowohl in der MDH (große Pfeilspitze) und paratrigeminal Kern (kleine Pfeile) im Vergleich zu das Schwimmen und Kontrollratte. Legen Sie im Panel (A) zeigt die rostral-kaudale Lage des Panels AC. Maßstabsbalken in Panel C ist 100 um. [Diese Zahl hat sich von 24 modifiziert worden]
Abbildung 6: Aktiviert katecholaminerge Neuronen vom Tauchen Ratten. Mikrofotografien zeigen die medullas eines nichttauchKontrollRatte (A, C und E) und einer freiwillig Tauch Ratte (B, D und F). Das Hirngewebe wurde immunhistologisch sowohl eine Fos verarbeitetd Tyrosinhydroxylase (TH), Herstellung braun und schwarz TH somas Fos Kernen. Offene Pfeilspitzen identifizieren einfach markierten TH-positiven Neuronen, während durchgezogene Pfeile identifizieren Fos + TH doppelt markierten Neuronen. A1 Neuronen sind in A und B. C1 Neuronen identifiziert werden in C identifiziert und D. A5 Neuronen in E und F. Weitere Fos und TH doppelt markierten sind in der A1, C1 gesehen identifiziert und A5 Regionen der Tauch Ratte als in der nichttauchKontrollRatte. Kalibrierung Bar in E ist für Platten AF und 250 & mgr; m. Kalibrierung Bar im Einschub in F ist für alle Einsätze und 50 um. [Diese Zahl hat sich von 26 modifiziert worden]
Ratten in ihren verwilderten bilden können und tun, nutzen halbaquatischen Umwelt und oft tauchen unter Wasser, während der Nahrungssuche 6. So ist es nicht allzu überraschend, dass Ratten können sehr leicht trainiert, freiwillig unter Wasser tauchen werden. Die beschriebenen Trainingsverfahren kann bis 6 Wochen, die neu entwöhnt Ratten zu einer Körpergröße in den meisten erwachsenen Rattenhirn Atlanten verwendet (~ 300 g) bringen wird dauern. So sind die Gehirne von diesen ausgebildete Tiere werden leichter vergleichbar mit den in diesen Atlanten identifizierten anatomischen Strukturen sein.
Nachdem sie im Startbereich platziert meisten Ratten werden ihre Unterwasser schwimmen innerhalb von 20 sec beginnen. Jedoch gelegentlich eine Ratte auf 5 min oder länger dauern bis vor Beginn ihres freiwilligen Tauchgang. Während es in diesem Stadium verlockend, die Ratten in den Unterwassertunnel zu erzwingen, dies in der Regel vermieden werden sollte, um die Ratten Zuordnen des Wasser mit einer negativen Erfahrungen zu verhindern. Nagetiere können stur sein und darf initiVerbündeter verweigern während der Trainingseinheiten zu tauchen, aber sobald sie erkennen, der einzige Weg, um das Wasser zu verlassen ist, indem Sie den Tauchgang durch das Labyrinth, sie in der Regel bald nach dem im Startbereich platziert initiieren ihre Tauchgänge.
Ein kritischer Aspekt der Wiederholungen und methodischen Ausbildungsverfahren ist, dass sie in einer Weise, um die Spannung von den Ratten erlebten reduzieren geführt. Für Vermieter Ratten erkunden ihre Umwelt, vor allem während im Zielbereich zwischen Studien, scheint Stress weiter zu reduzieren. Ratten werden oft wieder in den Wasser zu schwimmen, und / oder untertauchen ihren Kopf unter Wasser noch auf dem Zielgelände Plattform sitzt. Dies legt nahe, dass Ratten sind nicht von Natur aus wasser aversiven. Zusätzlich ist es zwar nicht ungewöhnlich, Ratten, fäkale Pellets beim Schwimmen oder Tauchen oder beim Warten im Zielraum, tägliches Training führt zu weniger fäkale Pellets 17 zu produzieren. Im Allgemeinen ist die weniger gestresst die Ratten während der Ausbildung sind, desto weniger pellets sie zu produzieren. Etwaige fäkalen Pellets, die erzeugt werden, werden aus dem Wasser oder Zielbereich entfernt so bald wie möglich, um das Wasser relativ sauber zu halten.
Ratten können gelegentlich zu blutigen Nasen beim Schwimmen und Tauchen, die ein Ergebnis der Insufflation von Wasser in die Nasengänge sein können. Das Auftreten von Blut kann aufgrund osmotischer Spannungen innerhalb der Nasenschleimhaut werden. Während im Zielbereich zwischen Studien die Ratten werden sich Bräutigam. Als Folge Blut aus der Nase kann über die Ratten Kopf und Schnauze umverteilt bekommen, was den Ratten eine leichte Rotstich, besonders um die Augen, im Laufe eines Trainings. Auch kann ein gelegentlicher Ratte Tauch stressig (auf dh durch Drehen um und verirren beim Tauchen unter Wasser (siehe Hinweis nach 5.4.3., Wie man dies zu) verhindern) zu finden und / oder negative Taucherlebnisse. In diesen Ratten können Porphyrin in den Ecken ihrer Augen erscheinen, signalisiert eine Stress response.
Die Größe der Tauchtank wird zu einem gewissen Grad bestimmen die Raumanforderungen. Der beschriebene Behälter ist konstruiert für Ratten schwimmen 2-3 cm unter der Oberfläche des Wassers durch ein 5 m langes Labyrinth Plexiglas, eine Unterwasserschwimmdauer 10-15 sec 17,19,24,26,27 geben. Sollte ein Experiment entworfen werden, um Antworten von längerer Dauer Tauchgang zu messen, oder von einem tieferen Tauchwasser, muss der Tank erneut ausgeführt werden. Die Raumanforderungen könnten dann auch ändern, um die Dimensionen einer neu gestalteten Tauchtank passen. Wenn es keinen Bodenablauf in der Eingriffsraum zur Verfügung, kann das Wasser aus dem Tank in einem großen Behälter gesammelt werden, wie beispielsweise ein 60 gal Mülltonne, die dann an anderer Stelle in bequemer Weise entleert werden kann.
Die Fos-Technik kann mit anderen neuronalen Nachweisverfahren verwendet werden, um weiter zu identifizieren und zu charakterisieren, die Teil Neuronen des Hirnstamms Schaltung des Sprungantwort. Beispielsweise,Und globosa Neuronen im lateralen A7 Bereich 26,27, die während freiwilliger aktiviert werden; Fos Erkennung in Verbindung mit Tyrosin-Hydroxylase-Färbung hat katecholaminerge Neuronen in der A1, C1, A2, A5 und Unter coeruleus Bereichen (26 Abbildung 6) identifiziert Tauchen. Auch hat Fos Erkennung in Verbindung mit der retrograden Tracers Cholera-Toxin die Zellkörper der Motoneuronen kardialen vagalen innerhalb der externen Bildung des Nucleus ambiguus, die bei freiwilligen Tauch 20 aktiviert werden, identifiziert.
Untersuchung des zentralen Nerven Integration der kardiorespiratorischen antwortet Tauch ist für eine Reihe von Gründen, 6,8,28. Die Tauchantwort ermöglicht Tieren, einschließlich des Menschen, zu untergetaucht Unterwasser ohne Atem für längere Zeit bleiben. Die Tauchantwort stellt eine funktionelle Reorganisation der Hirnstamm homöostatischen Kontrolle, und zeigt eine der mächtigsten paMuste r der bei Tieren beobachteten vegetativen Reflexe. Das Tauchen Antwort kann auch wichtige klinisch beim Menschen als Teil der trigemino-kardialen Reflex, Nasen-Rachen-Reflex, und / oder plötzlichen Kindstod sein. Schließlich wird ein Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die im Hirnstamm von Ratten existiert helfen festzustellen, wie kortikalen Afferenzen können grundlegende Hirnstamm vegetativen Reflexe modifizieren. All diese Überlegungen machen Studie der zentralen Aspekte des Säugetiertauchantwort inhärent sinnvoll und interessant. Mit den beschriebenen Verfahren an Ratten zu trainieren, um sich freiwillig zu tauchen unter Wasser besser Untersuchung der zentralen Aspekte des Säugetiertauchantwort als die Verwendung von Zwangs tauchte Tieren ermöglichen. Denn die Trainingsverfahren wie beschrieben 1) reduzieren Aktivierung von ZNS Stress Schaltung und 2) haben CNS nicht aktiviert Lohn-Schaltung, da externe Belohnungen werden nicht verwendet.
Der Autor ist Berater für Stölting Company, und vorausgesetzt, das gesamte Design und die Spezifikationen der McCulloch Tauchflasche Maze, um sie für kommerzielle Zwecke.
Forschung mit Mitteln des Midwestern University Office of Research und geförderten Programmen unterstützt. Auch dank der Midwestern University Tierhaltung und Erik Warren.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
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