Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

Dystrophischen Kardiomyopathie ist eine schlecht verstanden Folge der Muskeldystrophie. Generieren von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten mit Muskeldystrophie ist eine unschätzbare Quelle für zelluläre in vitro Krankheitsmodellsysteme und für Wirkstoff-Screening-Studien verwendet werden. Patienten stammenden Urinzellen in erfolgreiche Reprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen, um dystrophischen Kardiomyopathie Muster ¹ verwendet. Adressieren der Sicherheitsbedenken von integrierenden Vektor-Systeme, unter Verwendung eines nicht-integrierenden Sendai-Virus-Vektors für die Transduktion von Yamanaka Faktoren in den Urin-Zellen von Patienten mit Muskeldystrophie gesammelt präsentieren wir ein Protokoll. Dieses Protokoll erzeugt vollständig neu programmiert Klone innerhalb von 2-3 Wochen. Die pluripotenten Zellen sind vektorfreien Durchgang durch-13. Diese dystrophischen iPS-Zellen lassen sich in Herzmuskelzellen differenziert und entweder verwendet werden, um Krankheitsmechanismen und für Wirkstoff-Screening zu untersuchen.

Kardiomyopathie ist die zweithäufigste Todesursache bei Patienten mit Duchenne und Becker-Muskeldystrophie (MD). Obwohl Mutationen in dem X-verknüpften Dystrophin-Gen in 1 auftreten: 3,500 männlichen Neugeborenen, ist sehr wenig über die molekularen und zellulären Ereignisse, die zum fortschreitenden Herzmuskelschäden bekannt. Menschen induzierte pluripotente Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten stammen, wurden als neuartige Instrument, um die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen zu studieren und für Wirkstoff-Screening ^1,2 verwenden entstanden.

Die erwartete Beschwerden von Hautbiopsien oder Blutproben kann jungen Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten davon abzubringen, die Einwilligung zur Studienteilnahme zu geben. Urinproben ein nicht-invasives Quelle somatischer Zellen, abänderbar Neuprogrammierung Methoden. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Urin Zellen von Muskeldystrophie Patienten gesammelt wurden, können kultiviert werden und effizient in iPSCs Hilfe retroviraler Transduktion mit den Yamanaka Faktoren (umprogrammiertOCT3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc; OSKM) ^1. Der Nachteil der retroviralen Gentransfer ist die zufällige Integration der Umprogrammierung Gene in die Wirtschromosomen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir das nicht-integrierenden Sendaivirus zur Urin Reprogrammierung verwendet.

Dieses Protokoll beschreibt die Sendai-Virus Reprogrammierung von Zellen aus Urin isoliert Muskeldystrophie-Patienten, die dann in Herzmuskelzellen oder anderen Zelltypen für eine weitere Studie unterschieden werden können. Dieses Protokoll kann auch für andere Patienten spezifischen Krankheiten angepasst werden.

HINWEIS: Die Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten sollten Einwilligung in einem Institutional Review Board teilzunehmen geben genehmigten Studie.

1. Puffer und Medien Vorbereitungen

1. Waschpuffer: Zu 100 ml Waschpuffer vorbereiten, 1 ml der 100x Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin + 100 ug / ml Streptomycin) und 99 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Urinary Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium: Um UPC Medium herzustellen, mischen gleichen Volumina von Keratinozyten Serum Free (KSF) Medium + Vorläuferzellen Cell Medium.
   1. KSF Medium: Um Keratinozytenmedium vorzubereiten, fügen Sie 5 ng / ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), 50 ng / ml Rinder (BPE), 30 ng / ml von Choleratoxin und Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) versetzt, um 500 ml Medium KSF.
   2. Vorläuferzellen Cell Medium: In drei Viertel der DMEM mit einem Viertel der Ham-F12-Medium und ergänzt mit 10% FBS, 0,4 ug / ml Hydrocortison, 0,1nM Choleratoxin, 5 ng / ml Insulin, 1,8 x 10 ^-4 M Adenin, 5 ug / ml Transferrin, 2 x 10 ^-9 M triiod Thyronin, 10 ng / ml EGF und Pen / Strep-Lösung.
3. hES Medium: Fügen Sie 20% KO-Serumersatz (K-SR), 1x MEM nicht essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 100 uM β-Mercaptoethanol, 20 ng / ml bFGF und Pen / Strep zu 400 ml DMEM / F12-Medium.

2. Urinprobenentnahme

1. Weisen Sie die Patienten, um Flüssigkeiten 30 Minuten vor dem Sammelurin trinken, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge (~ 30-40 ml) der Urin gesammelt werden können.
2. Geben Sie dem Patienten und / oder deren Erziehungsberechtigte eine Urinsammlung Kit mit folgendem Inhalt: (1) schriftliche Anweisungen zur Steril- oder Reinfangurinprobe zu erhalten, (2) feuchte antibakterielle Toiletten, und (3) eine 100 ml sterile Proben-Sammelbecher. Patienten sollen angewiesen Probe zu sammeln.
3. Sofort legen Sie die Urinproben auf Eis und Transfer zum laboratory in einem Kühler. Verarbeiten Sie die Urin zur Zellisolierung sofort. Wenn eine Verzögerung unvermeidlich, lagern die Probe auf Eis für bis zu 4 h bei minimalem Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen.

3. Isolierung und Expansion von Urin Cells

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank.

1. Mit sterilen Pipetten, um den Transfer Urinproben 50-ml-Zentrifugenröhrchen steril. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei RT.
2. Saugen Sie den Überstand zu verlassen 1 ml in der Röhre; darauf achten, dass das Zellpellet zu stören.
3. Resuspendieren und verbinden die Pellets aus einer Vielzahl von Röhren in 7 ml Waschpuffer und wiederholen Zentrifugation bei 400 × g für 10 min bei RT.
4. Vorsichtig den Überstand aspirieren, so dass die Zellpellet und ~ 0,2 bis 0,5 ml Überstand. Resuspendieren in 2-3 ml Urin-Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium und übertragen Sie die Suspension in 4-6 Vertiefungen einer unbeschichtete 24-Well-Platte.
5. Nach 72 Stunden, ergänzen die Kultur mit 0,5 ml frischem UPC Medium pro Vertiefung und ändern Medium alle 2-3 Tage nach der. Die Erythrozyten und Schuppenzellen, die nicht an der Platte zu befestigen müssen mit den Mediumwechsel entfernt werden.
6. Überwachen Kultur nach 4-6 Tagen.
   HINWEIS: Kleine 2-4 Zellkolonien beginnt zu erscheinen. Cells wird abgerundet oder verlängert, die Typ I oder Typ II Nierenepithelzellen (RE) Zellen jeweils ³ darzustellen.
7. Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage, da, sobald die Zellen erscheinen, werden sie einen kräftigen Wachstumsphase durchlaufen.
8. Sobald die Zellen Konfluenz von 80-90% zu erreichen, in der Umgebung von 9-15 Tagen nach der Plattierung zu dissoziieren und den Durchgang der Zellen (15,000-18,000 Zellen / cm ²⁾ auf 2-4 Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen zur weiteren Expansion. Kennzeichnen Sie diese als Zellpassage 1 (P1).
9. Charakterisieren Urinzellen für Linie Spezifikationen durch Durchflusszytometrie, immunohistochemchemische Färbung oder durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR).
10. Reprogram isoliert Urin Zellen (Abschnitt 4) oder frieren Sie sie in Freezing Medium (DMEM, ergänzt mit 10% Serum und 10% DMSO) für langfristige Kryolagerung.

4. Urin Zell Reprogrammierung Mit Sendai Virus

HINWEIS: Der richtige Umgang mit und die Verwendung von PSA (persönliche Schutzausrüstung) wird empfohlen, während die Manipulation der Transfektion Mittel. Die folgenden Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank. Die ordnungsgemäße Entsorgung der Transfektion Mittel und / oder transfizierten Zellen wird empfohlen, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden. Für Urin Reprogrammierung, verwenden Sie ein Sendai Reprogrammierung Kit mit Änderungen an Feeder-abhängigen Protokoll des Herstellers wie unten beschrieben.

1. Um einen hohen Wirkungsgrad Neuprogrammierung mit dem Sendai-Virus zu gewährleisten, verwenden Sie Gänge 1-5 von Urin-Zellen, die schnell sindly Division. Wenn die Zellen nicht gut replizieren oder werden seneszenten, verwerfen, da sie nicht effizient neu zu programmieren.
2. Seed 60.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen. Markieren Sie diese als Tag -2. Einzustellen Zellsaat Dichte (5 x ^Oktober 4-9 × 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung) wie erforderlich, um 80-90% Konfluenz von Tag 0 zu erreichen.
3. Am Tag 0 (48 h nach dem Ausplattieren der Zellen), bereiten die Sendai Umprogrammierung Vektoren (SeV), die jede der vier OSKM Faktoren. In jeder der Vektoren zu 1 ml vorgewärmten UPC Medium. Verwenden Sie eine MOI von 1-1,5 (5-7,5 x 10 ⁵ CIU), die ausreicht, um eine Anpassung Urinzellen ist. Saugen Sie das Medium und langsam 1 ml UPC + SeV zu einer Vertiefung der Urin Zellen hinzuzufügen. Verwenden Sie die zweite sowie die Weiterleitung Negativkontrolle.
4. Am Tag 1, ersetzen Sie die UPC + SeV Medium durch frisches Medium UPC. Einige Zelltod nach 24 h durch virale Zytotoxizität gesehen.
5. Je nach Effizienz der umprogrammiert clonE-Formationen und die kompakte Morphologie, halten Wechsel des Mediums täglich bis Tag 6 oder 7.
6. Einen Tag vor der Dissoziation von transduzierten Zellen (Tag 5 oder 6), vorzubereiten MEF Nährplatten durch Plattieren Mitomycin-C (10 ug / ml für 3 Stunden) behandelt-MEFs bei einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / cm ² auf 0,1 % Gelatine beschichtete 100 mm ² Kulturschalen.
7. Am nächsten Tag (Tag 6 oder 7), dissoziieren die Zellen mit 0,25% Trypsin, Resuspendieren der Zellen in Medium und UPC Platte 5 × 10 ⁴ - 2 x 10 ⁵ Zellen / 100 mm ² MEF Zuführplatte.
8. Am folgenden Tag zu hES Medium wechseln und das Medium jeden Tag. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um transformierte Zellen zu überwachen.
   HINWEIS: Die Zellen klonale Aggregaten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie und mit höheren Zellkern zu Plasma-Relation (12-18 Tage nach der Weiterleitung) zu bilden.
9. Innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Transduktion abholen Kolonien und Übertragung auf neue Platten für clonal Expansion.
10. Führen Lebendzellfärbung zum Auswählen iPSC Klone durch Inkubieren von Zellen mit TRA-1-81-Antikörper für 1 h bei 37 ° C im CO ₂ -Inkubator nach Gegenfärbung mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoff konjugierten sekundären Antikörper, gefolgt für 1 h bei 37 ° C im CO ₂ -Inkubator.
11. Verwenden Sie eine 26 G 1½ Zoll Nadel Quer schlüpfen die größeren TRA-1-81 positive iPSC Klone in kleine gleichgroße Stücke (4-6 Stück pro Klon).
12. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze zu holen und den Transfer 10-20 schraffierte Stücke aus mehreren Klonen in jede Vertiefung der Matrigel (10 ug / cm ²⁾ beschichtete 24-Well-Platte mit hES-Medium.
    HINWEIS: Stücke von einem einzigen Klon einzeln in einer einzigen Vertiefung plattiert nicht erweitern oder pflegen Pluripotenz.
13. Ändern von hES zu iPSC Medium 24-48 Stunden nach der Umprogrammierung Klone werden auf die Matrigel Oberfläche befestigt.
14. Während der Wartung auf Matrigel-beschichteten Platten, manuell scrape-off alle differenzierten Zellen oder verunreinigen MEF Feeder-Zellen mit einer Pipette-Spitze bis zur voll reprogrammiert und pluripotent dystrophischen iPSC (MD-iPS) Klone anzureichern.
15. Nachdem einzelne Klone wurden ~ 100 & mgr; m Größe erreicht, erweitern die Klone durch Dissoziieren mit 0,48 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Lösung für 3 min und Beschichtung kleine Zellaggregate von MD-iPSCs in iPSC Medium (ergänzt mit 5 uM Y27632, Rho-Kinase-Inhibitor ) auf frischen Matrigel (10 ug / cm ²⁾ beschichtete 12-Well-Platte. Ändern iPSC Medium täglich.
16. Voll Umprogrammierung jedes Klons kann sowohl durch Genexpressionsanalyse OSKM Gene und immunhistochemische Färbung von Pluripotenzmarker (Oct3 / 4 und TRA-1-81) bestimmt werden. Eine rigorose Bewertung der Pluripotenz Potenzial sollte eingesetzt werden, um zu bestätigen vollständig umprogrammiert iPSC Linien lassen sich in drei Keimblätter differenzieren. Dies kann entweder durch Embryoidkörper (EB) die Bildung und Differenzierung Assay oder einem ter erreicht werdenatoma Bildungstest.

Meist Progenitorzellen aus menschlichem Urin isoliert sind positiv für uroepithelial Vorläufer und Perizyten Marker wie CD44, CD73 und CD146 (97,37%, 97,09% und 97,3% jeweils, Figur 1A und 1B). Diese Zellen exprimierten auch andere mesenchymalen Marker wie alpha-Aktin der glatten Muskulatur und Vimentin (1B). RT-PCR-Analyse zeugt von einer gemischten Population von Zellen in den Kulturen, daß es eine schwache Expression von Cytokeratin-7 (CK-7) und Uroplakin (UP) -Ia & -IIIa, Marker uroepithelial Linie (Figur 1C).

Die Umprogrammierung Schritte werden durch schema in 2A zusammengefasst. Repräsentative Bilder zeigen die Morphologie der Zellen während der verschiedenen Zeitpunkten während des gesamten Protokolls (2B). Die Urin-Zellen zu transformieren aus langgestreckten, Typ-II-Zellen (Tag 0) in ein Kopfsteinmuster (Tag 4) während der Umprogrammierung. By Tag 12, typisch pluripotenten Klone (iPS) zu sehen sind und in der Lage sind, ihre pluripotenten Morphologie unter Zuführung freien Bedingungen (iPS-P2) zu halten. Lebendzellfärbungen für TRA-1-81 identifiziert umprogrammiert Klone (2C).

Um die Bildung von Vektoren und transgene freien pluripotenten Klone zu bestätigen, wird die RT-PCR unter Verwendung von Primern gegen die SeV viralen Genoms und jeder der exogenen OSKM Faktoren. Die Hochregulation endogener Reprogrammierungsfaktoren können auch in diesem Schritt bestätigt wird. Das exogene Genexpressions nicht mehr durch Passage-13 erfaßt wird, aber die Hochregulation endogener Faktoren beobachtet (3A). Immunfluoreszenzfärbung bestätigt Pluripotenz Marker Ausdruck auf iPS-Zellen (Oct3 / 4 und TRA-1-81; 3B). Die endogene Umprogrammierung der Genexpression in Urin Zellen gesehen können diese Zellen führen zu höheren Wirkungsgraden ¹ umprogrammieren, verglichen mit anderen Zellquellen. Die expression des Dystrophin-Gens und Proteins durch Immunfluoreszenz verifiziert, Western-Blot (WB) und RT-PCR-Analysen (3C-D). Immunfluoreszenzfärbung von Wildtyp-UCs und iPS-Zellen für Dystrophin zeigen deutlich, Kernlokalisierungs ¹¹ in iPS-Zellen, aber nur sehr wenige UCs ausgedrückt positive (3C). Dystrophin-Expression in den Zellen zu überprüfen, Immunblot-Analyse für Dystrophin ergab, dass das ubiquitäre Dystrophin Isoform (DP71) ist die vorherrschende Isoform, die in Wildtyp iPSCs erzeugt, während dystrophischen iPSCs fehlt Dystrophin Genexpression nachweisbar DP71 Expression (Abbildung 3D). Die Exon Deletionsmutationen von Dystrophin in den dystrophischen iPS-Zellen unter Verwendung spezifischer Primer flankieren die gelöschten Exons bestätigt werden. Kein PCR-Amplifikation in den dystrophischen iPSCs erkannt, während Wildtyp-iPS-Zellen zeigen, Dystrophin Transkript Verstärkung (3E).

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Abbildung 1. Charakterisierung der isolierten Zellen Urin (BKS) zeigt uroepithelial Vorläufer, mesenchymale und glatte Muskelzellen Linien. (A) Durchflusszytometrische Analyse UCs sondiert mit konjugierten Antikörper gegen uroepithelial und Perizyten Marker CD44, CD73 und CD146. (B) Immunfluoreszenzfärbung von UCS mit CD44, αSMA und Vimentin. (C) Genexpressionsprofil UCs zeigen schwache Expression von CK-7 und UP-Ia und UP-IIIa im Vergleich zu positiven Kontrollproben, während die Genexpression von alpha-smooth muscle actin (αSMA) ist vergleichbar mit der Positivkontrolle. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Die Neuprogrammierung von UC zu iPS-Zellen zu generieren. (A) Schematische Darstellung der Neuprogrammierung Timeline. (B) Bilder, die verschiedene Morphologien UCs während des SeV Übertragung, bei Tag 0 (SeV Übertragung), Tag 4 (morphologische Übergang), Tag 12 (pluripotenten Klone neu aufkommende MEFs) und die charakteristische iPSC Klon unter Zuführung freien Bedingungen (iPS -P2 auf Matrigel). (C) Live-Cell-Imaging für TRA-1-81 pluripotente Kolonien an Tag 17 zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 3. Erzeugung von viralen Genoms und Transgene Kostenlose iPS-Zellen. (A)Genexpressionsanalyse zeigt die Gegenwart des SeV Genoms und OSKM Transgenen bei Passage 2 (iPS-P2) und ihrem Verschwinden von Durchgang 13 (iPS-P13) während endogenen Genexpression besteht während des gesamten. (B) Phasenkontrastbilder und Immunfluoreszenz verglichen Oct3 / 4 und TRA-1-81-Färbung in UCs und resultierende iPS-Zellen. (C) Dystrophin wird durch Immunfluoreszenz in Wildtyp-iPS-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-UC, und (D) die spezifische Dystrophin-Isoformen (DP71) kann durch WB bestätigt werden erkannt. (E) RT-PCR-Analyse wird verwendet, um die spezifische Dystrophin Exon-Deletion in den dystrophischen iPS-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-UCs und iPS-Zellen zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Tabelle 1. Liste der Primer Sequenzen.

Modellierung von Herzkreislauferkrankungen mit iPS-Zellen entwickelt sich zu einem gemeinsamen Ansatz für den genetischen Beitrag ^4-6 zu verstehen. Einige unerwartete Schwierigkeiten, die einem Zellproben von Patienten, insbesondere junge Kinder, können, indem sie die Möglichkeit einer nichtinvasiven Ansatz wie einer Urinsammlung vermieden werden. In diesem jungen Patientengruppe ist es oft schwierig, eine Urinvolumen ausreichend zu sammeln, um genügend Zellen zur Reprogrammierung Urin ergeben. Coaching der jungen Patienten Flüssigkeiten trinken 30 Minuten vor der Urinsammlung verbessert den Erfolg der Urin Zellisolierung. Jedoch kann wiederholen Urin Sammlungen notwendig in dieser Bevölkerung. Wir haben kombiniert und angepasst zwei verschiedene Protokolle ^3,7, um die Isolierung und Kultivierung von UCs von Patienten mit Muskeldystrophie zu optimieren.

Induzierte pluripotente Stammzellen aus entweder Hautfibroblasten oder Urin-Zellen von Muskeldystrophie patien erzeugt wurdets ^1,2. Allerdings stützte beide Umprogrammierung Protokolle auf Lentiviren, die Umprogrammierung Faktoren in die Körperzellen einzuführen. Diese Integration von Virenliefermethode kann problematisch sein, wenn das Transgen zufällig integriert in das Wirtsgenom und verursacht entweder Transgen Reaktivierung oder Mutagenese (in 8 überprüft). Daher wird bei diesen Techniken konnten wir mit Hilfe des Sendai-Virus, die OSKM Transgene in den Urin-Zellen in einer nicht-integrierend ⁹ transduzieren.

Dieses Verfahren unter Verwendung von Sendai-Virus auf UCs umprogrammieren bietet den Vorteil eines nicht-integrierenden Ansatz mit höherer Transduktionseffizienz ^9,10. Urin-Zellen von Muskeldystrophie-Patienten gesammelt innerhalb von 2-3 Wochen nach der Transduktion umprogrammiert. Diese Umprogrammierung Kinetik sind vergleichbar mit UC Umprogrammierung mit lentiviralen Transduktion ^1. Obwohl dieses Protokoll kann skaliert werden, um Feeder freie Methode für Urin Reprogrammierung zu etablieren, werdening ein effizientes Verfahren mit Sendai-Virus-Transduktion von Zellen aus Urin Muskeldystrophie Patienten isoliert. Das beschriebene Verfahren beruht auf MEFs als Feeder-Schicht, um sich voll zu etablieren die pluripotenten MD-Klon vor, um Feeder freien Bedingungen in Durchgang 2 zu übertragen.

Die nukleare Verbreitung des DP71 Isoform des Dystrophin-Protein ist seit langem in verschiedenen embryonalen Stadium Zellmodellen ^11,12 festgelegt. Das ubiquitäre Expression von DP71 in Kernmatrix Bruchteil der frühen Vorläufer / embryonalen Stadium Zellen legt nahe, ihre Rolle in der Kernarchitektur und Zellzyklusregulation ^12. Unsere neu programmiert Wildtyp-iPS-Zellen exprimieren DP71; jedoch ist seine Abwesenheit in dystrophischen iPSCs die Umprogrammierung oder pluripotente Potenzial der dystrophischen Zellen nicht hemmen. Abschließend werden die dystrophischen Genmutationen in iPS-Zellen umprogrammiert konserviert; so dass es ein effizientes Werkzeug dystrophischen Kardiomyopathie zu Modell.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.