Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene. Hier eine Zusammenfassung der FIONA Technik wird berichtet, und Beispiele der Forschung, die durchgeführt wurde unter Verwendung Fiona kurz beschrieben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie man auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, gefolgt von der Nutzung von FIONA um die 36 nm Schrittweite von einer einzigen abgeschnitten Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert messen Durchführung einer einfachen FIONA Experiment veranschaulicht. Schließlich jüngsten Bemühungen um die Anwendung FIONA zu dicken Proben erstrecken wird berichtet. Es wird gezeigt, dass mit einem Wasserimmersionsobjektiv und Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhäute (>200 um) Lokalisierungsgenauigkeit von 2-3 nm erreicht werden.

Rund 1882 Ernst Abbe festgestellt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops sichtbar ist ~ λ / 2NA oder ~ 200 nm (wo λ die Wellenlänge und NA die numerische Apertur) ^1,2. Daher würde jedes Objekt kleiner als diese Dimension als beugungsbegrenzten Fleck in einem optischen Mikroskop erscheinen. Jedoch ist es möglich, die Mitte des Flecks, das heißt, die Position des Objekts zu bestimmen, mit einer viel höheren Präzision ^3. Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene ^4. Die Genauigkeit der Lokalisierung, _σ μ (dh die Standardabweichung des Mittelwerts), hängt von der Gesamtzahl der gesammelten Photonen, , Wobei N die Photonenzahl, s die Standardabweichung der Leuchtfleck, adie Pixelgröße der Bilddetektor, und b die Standardabweichung der Hintergrund ^3,4. Für einen Fluorophor emittiert ~ 10.000 Photonen können FIONA erreichen ~ 1 nm Präzision ^4.

Fiona verwendet, um die Position eines stationären Emitter oder ein Bewegen eines (vorausgesetzt Bilder schnell genug gemacht werden) exakt zu bestimmen. FIONA können, um den Rahmen des Films angewendet werden sequentiell und damit verfolgen die Bewegung der ^{Einzelmolekül-4-8.} Lichtschutz Reagenzien notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Probe nicht photochemisch. Weiterhin können die fluoreszierenden Objekts selbst beliebig groß sein, kleiner oder größer als die Beugungs Begrenzung- zB kann es aus einer Organelle (~ 1 um) mit vielen fluoreszierenden Proteine ​​auf ihrer Membran dispergiert bestehen. Mit FIONA kann immer noch eine sehr genaue (Nanometer) Durchschnitt der durchschnittlichen Mitte-der-Masse ergeben. Die große Verbesserung in Lokalisierungsgenauigkeit von Fiona ermöglicht die Lösung nanometer-Skala Bewegungen über die Zeit. Dies hat die Mikroskopie in die molekularen Längenskala ^{4 bis 8} geschoben.

Seit ihrer Erfindung haben Varianten von FIONA entwickelt. Zum Beispiel Hellfeld-Bildgebung mit einem-Nanometer-Genauigkeit (bFIONA) ^9, eine leichte Variante der FIONA, Bilder und lokalisiert dichte Objekte wie Melanosomen in vivo (dunkle Objekte, die das Pigment Melanin) mit Durchlicht. Darüber hinaus FIONA wurde eingesetzt, um mehrere Farbstoffe zu lösen. Zum Beispiel, Einzelmolekül-hochauflösende Bildgebung mit Photobleaching (Garnelen) ^10,11 oder Einzelmolekülhochauflösende Kolokalisation (SHREC) ¹² entwickelt worden, um zwei Farbstoffe innerhalb von etwa 10 nm zu lösen. (Beachten Sie, dass dies Auflösung, dh wie genau kann man identische Farbstoffe auseinander zu halten.) Vor kurzem hat FIONA Analyse auf die Lokalisierung bestimmter superauflösende Mikroskopie beigetragen wie stochastische optische RECOnstruction Mikroskopie (STORM) ^13-15-und Foto-aktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) ^16, in dem temporäre dunklen Fluorophore sind aufgeregt, und dann wird die Fluoreszenz lokalisiert. Durch wiederholtes spannende einem relativ niedrigen Dichte von Farbstoffen (weniger als eine pro beugungsbegrenzten Fleck) und dann das Sammeln der Fluoreszenz, die Analyse jeder von ihnen von Fiona, kann man aufbauen eine hochauflösende Karte. Die Auflösung wird dann einfach durch die Anzahl der Photonen jeder Farbstoff setzt heraus, als auch Dinge wie bei der Akquisition halten die Probe stationär (einschließlich zB der Mikroskoptisch) begrenzt.

In diesem Papier, eine Zusammenfassung der FIONA Technik und beschreiben Sie kurz Beispiele von Forschung, die unter Verwendung von FIONA wird berichtet haben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie manDurchführung einer einfachen FIONA Experiment auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, veranschaulicht. Danach wird die Verwendung von Fiona 36 nm Schrittweite eines einzelnen abgeschnittenen Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert, um zu messen, ist dargestellt. Myosin Va ist ein wesentlicher Motor prozessive Protein, das zelluläre Fracht trägt, während Translokation entlang Aktin-Filamente. Hier eine Myosin Va konstruieren stumpf wird verwendet, um Bereiche irrelevant für die Schrittgröße zu entfernen, und mit einem Flag-Tag an den C-Terminus angefügt, um eine einfache Markierung mit Quantenpunkten mit Anti-FLAG-Antikörper funktionalisierten ermöglichen. Dieses Experiment wird unter niedrigen ATP getan, um die Myosin verlangsamen und ermöglichen die Verwendung von Belichtungszeiten lang genug, um eine gute Photonenzahl in jedem Rahmen zu bekommen. Jede ausreichend hell fluoreszierende Markierung könnte in dem folgenden Protokoll ersetzt werden. Schließlich jüngsten Anstrengungen der Verlängerung der Anwendung der FIONA zu dicken Proben berichtet. Als Proof-of-Prinzip wurden Quantenpunkte eingeweichtin Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhaut und dann abgebildet und lokalisiert mit FIONA. Für die Bildgebung, ein 60X Wasser Immersionsobjektiv mit NA = 1,2 wurde verwendet, da dieses Ziel hat eine längere Distanz als bisher verwendete 100X Ölimmersionsobjektiv. Um den Verlust in der Vergrößerung in dem Ziel auszugleichen, wurde ein extra-Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X) in der Emissionspfad eingefügt. Darüber hinaus Auflicht-Fluoreszenz (nicht TIR)-Mikroskopie muss verwendet werden, um tiefe Regionen in den dicken Proben zuzugreifen. Es wird gezeigt, dass die Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gels und im Kaninchenauge Hornhäute (Z> 200 um) können mit 2-3 nm Präzision lokalisiert werden.

Ethik-Erklärung: Die Hornhaut Gewebe von Kaninchen wurde in Übereinstimmung mit der Universität von Illinois Institutional Animal Care und Verwenden Richtlinien gesammelt.

1. TIRFM-Setup

HINWEIS: Tragen Laser-Schutzbrille die ganze Zeit.

1. Stellen Sie sicher, dass alle in der Liste der Materialien aufgeführt notwendigen optischen Komponenten sind verfügbar und bereit für die Ausrichtung. Falls erforderlich, verwenden Ersatz mit gleichwertigen Funktionen von anderen Unternehmen. Stellen Sie sicher, dass Spiegel und Linsen sollten Antireflexbeschichtungen (AR) passend zum Laser im Einsatz haben.
2. Stellen Sie die Höhen aller optischen Komponenten auf die Höhe des Zentrums des Mikroskops zurück Port.
3. Montieren Sie den Laser, Laser-Shutter und ND-Filter (n). ND-Filter, um die Laserleistung so gering wie möglich zu dämpfen, nach unten, während die Balken sichtbar. Ziehen Sie die Schrauben mit entsprechenden Sechskantschlüssel.
4. Planen Sie ein Strahlengang und markieren Sie es mit Klebeband oder Markierung auf der optischen Tisch (dotTed blauen Linien in Abbildung 1). Der Einfachheit halber halten gerade Wege entlang der Linien von Löchern auf der optischen Tisch.
5. Ort Spiegel M1 (Abbildung 1) an der ersten rechten Winkel dran. Legen Sie die beiden Blenden entlang der zweiten geraden Abschnitt der geplanten Strahlengang. Einzustellen sowohl die Position und die Neigung des M1, so dass die Laser geht durch die Iris.
6. Ort Spiegel M2 (Abbildung 1) an der zweiten rechten Winkel dran. Legen Sie das 10X Beam Expander (L1 L2 &, Abbildung 1) entlang der dritten geraden Abschnitt des Pfades. Seine Neigung einzustellen, so dass die Strahlaufweitung parallel zu sowohl der optischen Tabelle und der geplanten Strahlengang ist.
   1. Einzustellen M1 und M2 iterativ so dass die Laser geht geradlinig durch die Zentren der beiden Linsen der Strahlaufweiter. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Strahlprofil des aufgeweiteten Strahl ist nicht-begrenzten Gauß.
7. Stellen Sie M1, um den Strahl auf L1 zentrieren (FiGüre 1) und M2, um den Strahl auf L2 (1) iterativ zu zentrieren. Eine schlechte Strahlprofil bedeutet in der Regel der Laser abgeschnitten; verwenden Sie ein Stück weißes Papier, um den Strahl nach der Strahlaufweitung zu blockieren, um die Strahlprofil mit den Augen zu überprüfen. Für hochgenaue Analyse, verwenden Sie einen optischen Strahl Profiler.
8. Den Abstand zwischen L1 und L2, so daß der Strahl kollimiert. Wiederholen Sie Schritt 1.8 und 1.9, wenn nötig.
   HINWEIS: Wenn die Strahlgröße nicht mit der Entfernung ändern, ist der Strahl gebündelten genug für eine TIRFM-Setup. Um die Strahlkollimation weiter zu verbessern, könnte Werkzeuge wie Scheren-Interferometer verwendet werden. Eine typische Strahlgröße nach der Expansion ist ~ 20 mm.
9. Shutter des Lasers. Schrauben Sie den Mikroskopobjektiv und schrauben in einer Leuchtstoffausrichtungsziel. Ort Spiegel M3 und M4 (1), um den expandierten Strahl in den Mikroskopöffnung und auf den dichroitischen Spiegel in dem Revolverkopf zu leiten. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl springt ter dichroitische und gegen die Decke.
10. Passen M3, um die hellste Teil des Lichtstrahls auf dem Leucht Target Center und M4, um die Strahlneigung einstellen vertikal zu werden.
11. Shutter des Lasers und schrauben das Ziel wieder ein. Wenn die Ausrichtung im vorherigen Schritt ist getan und sollte es eine symmetrische Ort Verlassen des Ziel sein. Feinabstimmung der Neigungen von M3 und M4, die Laserleistung und Strahlprofil aus dem Ziel zu optimieren.
12. Montieren Sie eine EM-CCD Kamera mit dem Mikroskop und schließen Sie die Kamera an einen Computer. Starten der Software für die Kamera.
13. Montieren Sie eine Leuchtstoffprobe (Lösung von Fluorophore) auf dem Mikroskop. Schauen Sie sich die hell fluoreszierende Fleck auf der Kamera. Überprüfen Sie, dass der Spot nicht auf dem Bildschirm verschieben, wenn der Fokus geändert wird.
14. Platzieren Sie die TIR-Linse (L3, 1) auf der XYZ-Stufe in einem Abstand von der hinteren Brennebene des Objektivs, die gleich der Brennweite der L3 (~ 30 cm) ist. Stellen Sie die Position der L3so dass die Laser geht durch das Zentrum der Linse.
15. Übersetzen L3 entlang des Strahlengangs um die Strahlkollimation einzustellen. Sicherstellen, dass der Strahl immer noch auf dem Bildschirm zentriert und in der Form symmetrisch.
    HINWEIS: Die Beleuchtungsbereich an den Probenebene steigt mit abnehmender TIR-Linse Brennweite. In der Regel verwenden die kleinste Brennweite, am Set-up passen.
16. Übersetzen L3 senkrecht zum Strahlengang, um den Strahl von dem Ziel zu kippen. Halten der Übersetzung des TIR-Linse derart, daß TIR erreicht. Eine Probe von fluoreszierenden Kügelchen beobachten durch die EM-CCD-Kamera, und die Feinabstimmung L3 gute SNR zu erhalten.

Abbildung 1. Optische Konfiguration für Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM).

2. FIONA auf Cy3-DNA

1. Cschlanke Objektträgern und Deckgläsern: Spülen Objektträgern und Deckgläsern mit _ddH2O und Isopropanol und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas; Legen Sie die Folien und Deckgläser in der Plasmareiniger für 5 min unter Argon-Plasma.
2. Konstrukt Probenkammern (wie in Figur 2 skizziert).
   1. Legen Sie ein Gewebe auf der Bank und dann legte ein Stück Papier Linse auf der Oberseite des Gewebes. Legen Sie die Folie auf der Linse Papier. Stellen Sie sicher, dass der sauberen Seite der Folie nach oben zeigt.
   2. Gelten zwei Streifen von doppelseitigem Klebeband auf die Folie entlang der Längskanten, wobei ein Spalt von 3-5 mm in der Mitte. Legen Sie die gereinigten Deckglas der Folie. Stellen Sie sicher, dass die saubere Seite des Deckglases wird die Folie gegenüber.
   3. Verwenden Sie eine Pipettenspitze nach unten über das doppelseitige Klebeband drücken. Verwenden Sie einen Rasierer, um überschüssige Band aus der Folie zu entfernen, so dass das Band nur noch unter dem Deckglas.
      HINWEIS: Die offenen Enden der Kammer offen gelassen und dienen als Einlass und auslassen. Das Kammervolumen beträgt mehrere Mikroliter.

Abbildung 2. Skizze einer typischen Probenkammer (a) Draufsicht. (B) Seitenansicht von rechts; (C) Seitenansicht von vorne.

3. Immobilisierung von Cy3-DNA auf den inneren Oberflächen der Probenkammern.
   1. Bereiten T-50-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Vorbereitung BSA-Biotin in T-50 in einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Vorbereitung T50-BSA-Puffer durch Lösen von BSA in T-50 in einer Endkonzentration von 10 mg / ml.
   2. Planen 0,5 mg / ml Neutravidin in T50-BSA-Puffer. Vorbereitung biotinylierten Cy3 markierter DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA in einer Endkonzentration von 5-10 pM.
   3. Je 10 ul BSA-Biotin (1 mg / ml) in die Probenkammer. Warten Sie 5 min.
   4. Waschen Sie die Kammer mit 40 ul T50-BSA. Je 10 ul Neutravidin (0,5 mg / ml) in die Probenkammer. Inkubation für 5 min.
   5. Die Kammer mit 40 ul T50-BSA waschen. Je 20 ul Cy3-DNA in die Probenkammer. Inkubation für 5 min und dann waschen die Kammer mit 80 ul T50-BSA.
4. Bild Cy3-DNA-Einzelmolekülen unter TIRFM.
   1. Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen von 1 ul Protocatechuat 3,4-Dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 ul Protocatechusäure (PCA, 62,5 mM), 50 ul 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbonsäure (Trolox, 2 mM in T-50) und 45 ul T50-BSA.
   2. Pipette in 30 ul Imaging Puffer und warten 8-10 min.
   3. Montieren Sie die Probe für die Bildgebung auf einem TIRFM, die mit einem grünen Laser (532 nm) ausgestattet ist, eine 100X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,45) und eine EM-CCD-Kamera.
   4. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 bis 500 ms und EM Gewinn auf 25 bis 100. Erwerben Sie einen Film der Probe für 1,000 Frames.
5. Führen FIONA die Analyse der Daten der aufgenommenen Bilder von Cy3-DNA.
   1. Bestimmen Sie die effektive Pixelgröße (dh Umrechnungsfaktor von Pixel zu Nanometer) durch Division der physikalischen Pixelgröße (gelesen aus dem Datenblatt des EMCCD-Kamera) durch die Gesamtvergrößerung (die Vergrößerung des Mikroskopobjektivs multipliziert mit irgendwelche zusätzlichen Vergrößerung).
   2. Bestimmung der Umwandlungsfaktor von Pixelintensitäten zu Nummern durch Dividieren CCD-Empfindlichkeit (dh Elektronen pro A / D-Zählung aus dem Datenblatt der CCD-Kamera gelesen) von der Elektronenvervielfacher (EM) Zunahme während der Bildaufnahme verwendet Photon.
   3. Kompilieren und ausführen FIONA.pro für FIONA-Analyse. Verwenden Sie diese IDL-Programm, das erworbene Bild zu importieren, die Eingabe der effektiven Pixelgröße (aus Schritt 2.5.1) und dem Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) und um Punkte für FIONA Analyse wählen.
      HINWEIS: Am Ende, das Program mit Ausgabe der Anpassungsergebnisse mit 2D Gauß-Funktionen, sowie Gesamtphotonenzahlen und Lokalisierungsgenauigkeit. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse und 4c-4d gezeigt.
   4. Kompilieren und ausführen phcount.pro zu Photonenzahl zu charakterisieren. Verwenden Sie diese IDL-Programm, um die durchschnittliche Anzahl der Photonen, die von einem Fluorophor vor Photobleaching emittiert wird, um das erfasste Bild und die Eingabe der Umrechnungsfaktor von Intensität zu Photonenzahl (aus Schritt 2.5.2) zu importieren.
      HINWEIS: Das Programm wird dann automatisch zu erkennen fluoreszierende Flecken (manuelle Auswahl ist eine Option) berechnen Photonen als Funktion der Rahmennummer und geben die Spuren von Photonen.
      1. Verwerfen schlechte Spuren und geben Rahmen Bereiche after photo für Basislinienkorrektur. Am Ende wird das Programm Ausgabe eine Liste der Gesamtphotonenzahlen für alle Flecken nicht verworfen. Dann zeichnen Sie die Verteilung der Photonenzahlen und passen die Verteilungtion mit einem exponentiellen Abfall, um die durchschnittliche Photonenzahl zu erhalten. Ein typisches Ergebnis ist in dem Abschnitt der repräsentative Ergebnisse gezeigt und Fakten 4e-4f.

3. Angewandte FIONA zu Motor (zB Myosin auf Aktin) Dynamik auf der Nanometerskala zu quantifizieren

1. Polymerisieren Aktin (dh vorzubereiten F-Actin) einen Tag vor FIONA Experiment.
   1. Rekonstituieren G-Aktin (Monomer) und Biotin G-Aktin (Monomer) bis 10 mg / allgemeiner Actin-Puffer ml. Rühren, um sicherzustellen, dass beide vollständig gelöst und halten sowohl auf Eis.
   2. Mischungs 10 ul G-Aktin (Monomer) mit 1,7 ul Biotin-G-Aktin in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l eiskaltem Puffer Aktin-Polymerisation.
   3. Wird die Mischung über Nacht bei 4 ° C (F-Aktin) gebildet und fügen ddH ₂ O auf ein Gesamtvolumen von 1 ml.
   4. Speichern der Aktin-Filamente (F-Actin) bei 4 ° C für die spätere Verwendung in den Experimenten.
      HINWEIS: Filamente zerfallen und über die Zeit zu verkürzen, kann jedoch für mindestens zwei Wochen verwendet werden.
2. Probe vorbereiten für die Bildgebung.
   1. Machen Sie eine Probenkammer (in Protokoll 2.1 und 2.2 beschrieben). Pipette in 20 ul biotinyliertes BSA 1 mg / ml in ddH ₂ O. Inkubation für 10 min. Spülen Sie mit 30 ul ddH ₂ O.
      HINWEIS: Dies blockiert die Glasoberfläche und legt Biotin für die Bindung der Aktin-Filamente. Biotinylierten Poly-L-Lysin - Polyethylenglykol (PLL-PEG) konnte die gleiche Funktion erfüllen.
   2. Pipette in 0,5 mg / ml Neutravidin. Inkubation für 2 min und dann waschen die Kammer mit 30 ul M5 Puffer.
   3. Pipette in die hergestellte F-Actin-25-fach verdünnt in allgemeiner Actin-Puffer auf eine Endkonzentration ~ 0,004 mg / ml. Warten Sie 10 min, spülen Sie die Kammer mit 30 ul Puffer.
   4. Verdünnen Myosin Va mit FLAG-Tags 30-fach in M5 Puffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl _2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) in einer Endkonzentration of 250 nM. Mischen Sie 1 ul Myosin mit 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 um, von Anti-Flag-Antikörper und Qdot705 konjugiert mit der Qdot705 Antikörperkonjugation Kit nach der Anleitung des Herstellers). Fügen Sie in 8 ul M5 bis zu 10 ul zu füllen. Pipette auf und ab, um gut zu mischen. Inkubation für 10 Minuten auf Eis.
      ANMERKUNG: Dies ergibt ein Gemisch aus 1 bis 4 Motor Quantenpunkte bei ~ 25 nM Konzentration Myosin.
3. Bildgebung des Myosin-Aktin zu Fuß auf.
   1. Vorbereitung Abbildungspuffer (100 ul) durch Mischen 84 ul BSA-M5 (M5 Puffer mit 1 mg / ml BSA), 1 ul ATP (50 uM in ddH ₂ O), 2 ul DTT (500 mM in ddH ₂ O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul Myosin-qdot nach 2,5 nM Konzentration Myosin, und 1 ul BME verdünnt weitere 10-fache.
   2. Pipette in 20 ul Imaging-Puffer, um die Kammer zu probieren und Inkubation für 8-10 min.
   3. Bild der Probe auf TIRF-Mikroskop bei 30 ms Belichtungs. Erwerben mindestens 1.000 Frames. Stellen Sie die Lautstärke von Myosin-qdot in Schritt 3.3.1, wenn nötig.
4. Führen Sie die Datenanalyse und finden Sie die Schrittgröße von Myosin Walking.
   1. Öffnen Sie die Videodatei in ImageJ ¹⁷ und schneiden Sie das Video um einen beweglichen Ort. Ernte eine ausreichend große Fläche, die der Spot nie innerhalb von 20 Pixel der Kante bekommt, und stellen Sie sicher, dass keine anderen Stellen im Video. Sicherzustellen, daß dieser Punkt in einem linearen Weg bewegt.
   2. Verfolgen Sie die Stelle durch das Video zu x und y-Koordinaten durch die Zeit, in Pixel, durch die Anwendung FIONA Analyse (Schritt 2.5.3), um jede und jeden Frame des Videos.
   3. Konvertieren Pixel Nanometern, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.
   4. Berechnen Verschiebung von der ersten Position als eine Funktion der Zeit.
   5. Laufen t-Test auf die Verschiebung, die Schritte des Myosin Walking erhalten.
      HINWEIS: Die für t-Test (step_t_test.zip) versehen Programm wird in IDL und con codiertbesteht aus 14 Unterprogramme im Ordner.
      1. Öffnen Sie alle Unterprogramme in IDL und alles übersetzen zweimal. Dann führen Sie mtltyanalysis_ttest.pro und wählen Sie eine Textdatei nur die Entfernungsdaten in einer einzigen Spalte enthält. Ein Ausgang Excel-Datei erzeugt, mit dem Rohdaten, die Passform und die Schrittweite.
   6. Löschen Sie alle Null-Werte aus der Schrittweite Spalte. Zeichnen Sie die Verteilung der Schrittweiten mit Origin oder MATLAB. Setzen Sie einen Gaußschen auf das Histogramm.
      HINWEIS: Schrittweite von Null-Werte müssen gelöscht werden, da ein Schritt von Null bedeutet, dass kein Schritt des vorherigen Rahmens gemacht. Der Beschlag gibt einen Peak bei etwa 36 nm (wie in 5 gezeigt).

4. Dick Probenvorbereitung für FIONA

1. Bereiten Quantenpunkte in Sol-Gel verkapselt.
   1. Mischungs 4,5 ml TMOS, 1 ml ddH ₂ O und 100 ul HCl (120 mM). Beschallen die Mischung auf Eis für 30 min in der Ultraschall-Reiniger spin der Liste der Materialien ecified (Frequenz = 40 kHz, = Heizung aus). Mischen Sie die Lösung alle 10 min.
   2. 1,5 ul verdünnte Qdot605 in 1,5 ml HEPES (50 mM, pH 7,2). Mischungslösung mit 1,5 ml TMOS aus dem vorherigen Schritt.
   3. Gießen Sie die Mischung in eine Glasbodenschale. Glas verschließen Bodenschale mit Parafilm und bei 4 ° C für 1. 5 Stunden.
   4. 2 ml 1% BME in PBS an die Probenschale und bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor der Bilderzeugung.
2. Bereiten Hornhaut Probe mit Quantenpunkten gefärbt.
   HINWEIS: Kaninchen-Augen waren Geschenke von Dr. Marina Marjanovic.
   1. Trennen Sie die Hornhaut von den Augen und schneiden Sie es in 3 mm x 3 mm große Stücke.
   2. Verdünnen 1 ul Qdot 605-Streptavidin in 1 ml PBS. Inkubieren Sie die Hornhautgewebe mit 1 nM Qdots Lösung bei 4 ° C für 1 Stunde. Das Gewebe mit PBS waschen.
   3. Nehmen Sie einen sauberen Glasobjektträger und Deckglas ein # 1.5. Setz 4 Schichten doppelseitigen Klebeband auf dem Glasobjektträger entlang der längeren Seite, einnd Anders 4 Schichten doppelseitiges Klebeband parallel zum vorherigen Band und hinterlassen einen Kanal ca. 1 cm dazwischen. Legen Sie das Gewebe aus dem vorherigen Schritt in der Mitte des Kanals, und decken Sie es mit einem Deckglas.
   4. Drücken Sie vorsichtig auf den Seiten des Deckglases, um sie auf die Bänder kleben. Befeuchten Sie den Kanal mit 50 ul PBS vor Bildgebung.
3. Bild Quantenpunkte in Sol-Gel-und Hornhaut.
   1. Fiona Bildgebung in dicken Proben, verwenden Sie ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,27 mm, oder ein 60X Wasser-Immersionsobjektiv mit Arbeitsabstand von 0,28 mm.
   2. Montieren Sie die Probe auf dem Mikroskop. Einstellen der TIRF-Linse derart, daß sie die Auflicht-Fluoreszenz-Modus erreicht (dh der Laserstrahl tritt aus dem Ziel mit einem Winkel gegenüber dem Deckglas). Legen Sie eine zusätzliche Vergrößerungslinse (Objektiv mit 3,3fach oder 4.0X).
   3. Bewegen der Fokusebene des Objektivs zu einer gewünschten Z-Position (zB> 200 um). Rekord Bilder von immobilenQuantenpunkte in der Probe.
4. Führen FIONA Analyse, wie in Abschnitt 2.5 dieses Protokolls beschrieben.

Ein typisches Ziel-Typ TIRFM Aufbau ist in Abbildung 3 dargestellt. Zuerst wurde auf der Oberfläche immobilisierten Cy3-DNA Probe abgebildet. Ein typisches Bild ist in 4a gezeigt. Das Bild wurde mit 0,5 Sekunden Belichtungszeit aufgenommen, mit EM Verstärkung = 50 und CCD-Empfindlichkeit = 12.13 für die Kamera. Die Punktbild-Funktion (PSF) eines Cy3-DNA-Molekül ist in 4b dargestellt (von der durch den Pfeil in Figur 4a angedeutet Stelle), wo die Farbbalken zeigt die Skala von Pixelintensitäten. Die tatsächliche Photonen können durch Multiplizieren der Pixelintensitäten mit einem Umwandlungsfaktor, α = CCD Empfindlichkeit / EM Verstärkung berechnet. Dieser Spot enthält etwa 14.000 Photonen (nach Korrektur für den Hintergrund).

(X-μ _x) ² / (2s _x ²⁾ - - (y - & # Die PSF wird dann mit einem zweidimensionalen Gauß-Funktion, f (x, y) = z ₀ + A · exp (Einbau181; _y) ² / (2s _y ^2)), wie in 4c mit in 4D gezeigt Pass Residuen) gezeigt (. Die Genauigkeit der Lokalisierung wird dann berechnet durch , Wobei i = x oder y, s _i die Standardabweichung der Anpassung, N die Gesamtphotonenzahl, A die Pixelgröße ist und b die Standardabweichung der Hintergrund. In diesem spezifischen Beispiel N = 14.528, a = 106,67 nm, s _x = 115,5 nm, s = _y 109,4 nm, b = 18,9, was die Lokalisierung Genauigkeiten von σ = 1,3 nm _x und σ _y = 1,2 nm auf. Die Lokalisierungsgenauigkeit eines Fluorophors ist ungefähr proportional zu 1 / √N, dh je mehr Photonen ist die genauere Lokalisierung. In tatsächlichen Anwendungen Fiona ist jedoch die Dauer der experimentellen Beobachtung eine andere Überlegung. Daher einesollte in der Regel erkennen, den Kompromiss zwischen Lokalisierungsgenauigkeit und Beobachtungsdauer und vorausschauend zu planen. In solchen Situationen ist es meist hilfreich, um zu bestimmen, wie viele Photonen insgesamt ein Fluorophor ist in der Lage, vor Photobleichung emittiert. Eine typische Spur der Photonenzahl gegen Rahmen ist in Abbildung 4e gezeigt. Eine exponentielle Anpassung gibt, daß die durchschnittliche Photonenzahl ~ 1,4 × 10 ⁶ (Figur 4f).

Das Datenanalyseverfahren von Myosin Schrittgrößenmessung ist in Figur 5 gezeigt. Zuerst eine Videodatei mit gutem Signal-zu-Rauschen eines Einzel Myosin beim Laufen entlang einer Aktin-Filament aufgenommen wird. 5a zeigt drei Rahmen von einem Video bei 100 ms Belichtung mit 100X Ölimmersionsobjektiv gemacht. Das bewegte PSF wird dann durch die beschnittene Videodatei mit einem benutzerdefinierten Code in IDL geschrieben, um Entfernungs-Zeit Informationen zu extrahieren, die durch eine T-Probe gestellt wird verfolgtfür Schritte. 5B zeigt, wobei der Abstand über der Zeit (rot) und Schritt-Finder Ausgang (weiß). Lokalisierung von Fehlern in jedem Rahmen verdeckt die Treppenform der Spur, so ist es wichtig, eine Photonenzählung in jedem Rahmen, der an einem Lokalisierungsfehler kleiner als die Hälfte der theoretischen Schrittweite ein, um zu sehen wünscht, entspricht erzielen. 5C zeigt Schritte von mehreren Spuren in einem Histogramm über die wahre Größe, die Myosin Schritt ist Gauß-verteilt kombiniert. Ein Gauß-Fit an die Histogramm-Bins ergibt einen letzten Schritt Größenmessung von 35,8 ± 0,4 nm auf.

Da Sol-Gel-und Hornhaut-Proben transparent sind, Anregungslaser können tief in den Proben ohne zu sehr verstreut zu durchdringen. Darüber hinaus ist die Autofluoreszenz von der Probe minimiert wird. Wenn mit niedriger Konzentration von Quantenpunkten markiert ist, ist es möglich, die Fluoreszenz von Qdots tief in der Probe mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis erhalten. DieVerwendung von wasser Ziel gibt uns den Arbeitsabstand von 270 oder 280 um, was bedeutet, dass es möglich ist, sich so weit wie 280 um entfernt von der Deck konzentrieren. Dies erlaubt uns, FIONA Analyse auf Quantenpunkte in dicken Proben durchzuführen. Für Quantenpunkte in einem Sol-Gel-Probe, Lokalisierungsgenauigkeit von 1-2 nm in der Nähe des Deckglases und 2-3 nm bei 280 um tief in die Probe (6a-6b) erreicht wird. Für Quantenpunkte in einer biologischen Probe (Teil einer Hornhaut von einer Kaninchenauge, 6e), Lokalisierungsgenauigkeit von 1-2 nm in der Nähe des Deckglases und 2-3 nm bei ~ 223 um tief in die Probe (6c-6d) erreicht wird. Es wird angemerkt, dass die Lokalisierungsgenauigkeit durch Verwendung der zusätzlichen Vergrößerungslinse, ohne die eine Lokalisierungsgenauigkeit von 6-7 nm erhalten wurde verbessert. Dies ist konsistent mit früheren Studien, die numerische dass die Lokalisierungsgenauigkeit kann durch Änderung des effektiven Pixelgröße von ~ 200 verbessert werden,nm bis 50 nm ~, auch wenn die Gesamtzahl der gesammelten Photonen könnte niedriger durch zusätzliche Reflexionen / Brechungen ¹⁸ sein.

Abbildung 3. Optische Konfiguration. Die optische Konfiguration der Totalreflexions-Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. A) ist ein Bild, wenn der Laser ist in TIRF Zustand und b) ist die Strahlform des Lasers an der Decke, wenn der Laser ist in epi-Beleuchtung.

Abbildung 4. Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA. A) CCD-Bild (256 x 256 Pixel) von Cy3-DNA. B) CCD-Bild eines einzelnen Cy3-DNA-Molekül, von dem gezeigt YELNieder Pfeil in a) c.) Montage der Point-Spread-Funktion der einzelnen Cy3-DNA-Molekül mit einer zweidimensionalen Gauß-Funktion. d) Einbau Residuen aus c). e) Photon zählen gegen Rahmennummer. f) Verteilung der Anzahl der Photonen, die von Cy3-Molekül vor Photobleaching emittiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Myosin Fuß durch FIONA beobachtet. a) Rahmen von Beispiel-Datendatei entsprechend t = 0 s, 30 s und 60 Sekunden. Die Myosin-qdot Konstrukt wird auf einer geraden Bahn eine gute Photonenzahl (> 5000) in jedem Frame Anwendung FIONA, die in und hat b.) Zu jedem Rahmen YieLDS ein Abstand über der Zeit, die in rot eingezeichnet ist. Ein Schritt-Suchalgorithmus auf der Basis der T-Test wird verwendet, um dann zu extrahieren einzelnen Schritte, und die Ausgabe wird in weiß überlagert. Schrittgrößen sind in weiß in Einheiten von Nanometern. C) Nur wenige Schritte von mehreren Spuren in einem Histogramm kombiniert gekennzeichnet. Die Messgrößen sind Schritt Gauß-verteilt über 35,8 ± 0,4 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. FIONA Analyse auf Quantenpunkten tief in dicken Proben. A) Fluoreszenzbild von QD 605 in Sol-Gel bei Z = 280 um mit 90X Vergrößerung. B) die Punktbildfunktion des QD in ein markiert). σ _x = 2 ist.6 nm, = σ _y 2,3 nm. Jede Einheit in der X-und Y-Achse stellt 266,7 nm. C) Fluoreszenzaufnahme QD 655 in Kaninchenhornhautgewebe bei Z = 223 um mit in c 360X Vergrößerung. D) Die PSF des QD markiert). σ _x = 2.2 nm, = σ _y 3,6 nm. Jede Einheit in der X und Y-Achse repräsentiert 44,4 nm. E) Bilder von der auf einem Deckglas montiert Hornhautgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

FIONA ist eine Technik, um die Position eines optischen Emitter (organisches Fluorophor oder Quantenpunkt) mit Nanometer-Präzision und zeitlichen Auflösung von bis zu 1 ms ^{4 bis 8} zu lokalisieren. Wenn genügend Photonen gesammelt werden, ermöglicht diese Technik, um die Position einer fluoreszierenden Emitter viel genauer als die Beugungsgrenze (~ 200 nm) zu bestimmen und somit dieses Verfahren eröffnet eine Möglichkeit, um zu beobachten, was mit herkömmlichen / traditionelle optische Mikroskopie ⁴ gesehen ^{- 8.} Seit seiner Erfindung, Fiona wurde erfolgreich auf die Beobachtung zu Fuß von vielen molekularen Motoren, wie Myosin und Kinesinen angewendet. In jüngerer Zeit ist es, zusammen mit anderen Arbeiten ^3,19, trug zur Lokalisierung bestimmter Schwellen Super-Resolution-Techniken wie STORM und PALM ^13-16.

Der entscheidende Schritt Fiona erreichen besteht in der Anzahl der gesammelten Photonen, die durch verschiedene f betroffen istSchauspieler. Zum Beispiel sollte die TIRFM Einrichtung für FIONA Experimente verwendet und so ausgerichtet, dass eine gute PSF (dh nicht-gestreckte, nicht-stigmatisiert, etc.) erreicht wird und eine angemessene Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhalten werden. Darüber hinaus sollte ein Objektiv mit einer hohen NA-Wert, um so viele Photonen zu sammeln verwendet werden.

Um mehr Photonen zu sammeln und damit zu Lokalisierungsgenauigkeit zu erhöhen, wurden verschiedene Sauerstoff-Scavenger Methoden und Reagenzien untersucht, um zu unterdrücken Photobleichen und Blinken ^20-22. Zwei unterschiedliche Sauerstoffradikalfänger Verfahren wurden in unserem Labor verwendet. Ist "gloxy" Lösung (Glucoseoxidase und Katalase) ^20. Die andere ist PCA / PCD über ²² beschrieben. Die früheren Arbeiten unmittelbar nach dem Mischen, aber der pH der Lösung im Laufe der Zeit ändert. Letztere hält die Lösung chemisch unverändert, aber eine Inkubationszeit von 8 bis 10 min erforderlich.

Eins hier gezeigt wird, ist es auch möglich, FIONA für dicke Proben unter Verwendung eines 60X Wasserimmersionsobjektiv mit NA = 1,2 zu verlängern. Dieses Ziel hat eine längere Arbeitsabstand (0,27 mm) als bisher verwendet 100X Ölimmersionsobjektiv (0,17 mm). Auf dicken Proben funktioniert, muss Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet werden. Obwohl die Vorteile der niedrigen Hintergrund der TIRFM geopfert wird, ist Nanometer-Präzision Lokalisierung noch erreichbar, während mit hellen Quantenpunkte. Diese Erweiterung ist nützlich in dicken Gewebedarstellung und medizinische Anwendungen.

Die Anwendung Fiona in einigen Aspekten beschränkt. Erstens, da das Lokalisierungsgenauigkeit hängt von der Gesamtzahl der gesammelten Photonen, die zeitliche Auflösung Fiona Regel beeinträchtigt. Zweitens allein FIONA kann nur spärlich markierten Proben angewendet werden. In anderen Worten, wird scheitern, wenn FIONA mehrere Fluorophore sind nah genug, wie ihre PSFs überlappen. Darüber hinaus ist die Streuung des Emissionslichts begrenzt die APwendung von FIONA in Dick Gewebe-Bildgebung.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Diese Arbeit wurde vom NIH Grants 068.625, NSF Zuschüsse 1.063.188 und Center der Physik von lebenden Zellen 0822613. Besonderer Dank geht an Dr. Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology für das Geschenk von Kaninchenaugen unterstützt.