التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

يمكن أن تكون مترجمة fluorophores واحدة مع الدقة نانومتر باستخدام FIONA. هنا يقال ملخصا لتقنية FIONA، وكيفية إجراء التجارب FIONA يوصف.

مضان التصوير بدقة نانومتر واحد (FIONA) هو تقنية بسيطة ولكنها مفيدة لتوطين fluorophores واحدة مع الدقة نانومتر في الطائرة س ص. هنا ملخص للتقنية FIONA يقال ويتم وصف أمثلة على البحوث التي تم تنفيذها باستخدام FIONA فترة وجيزة. أولا، كيفية إعداد المعدات اللازمة لإجراء التجارب FIONA، أي مجموع الداخلية انعكاس مضان المجهري (TIRFM)، مع تفاصيل عن محاذاة البصريات، يوصف. ثم كيفية إجراء التجربة FIONA بسيطة على توطين وظائفها و Cy3-DNA الجزيئات واحدة باستخدام البروتوكولات المناسبة، تليها استخدام FIONA لقياس 36 نانومتر حجم الخطوة من الميوسين اقتطاع فرجينيا محرك واحد وصفت مع نقطة الكم، ويتضح. وأخيرا، يقال جهد مؤخرا لتوسيع نطاق تطبيق FIONA لعينات سميكة. وتبين أن، وذلك باستخدام الهدف الغمر بالماء ونقاط الكم غارقة في عمق المواد الهلامية سول وقرنيات العين أرنب (>200 ميكرون)، والدقة توطين 2-3 نانومتر يمكن تحقيقه.

حوالي عام 1882، وجدت إرنست آبي أن حل المجهر الضوء المرئي هو ~ λ / 2NA، أو ~ 200 نانومتر (حيث λ هو الطول الموجي وNA هي الفتحة العددية) ^1،2. لذا فإن أي كائن أصغر من هذا البعد سوف تظهر كبقعة محدودة الحيود في المجهر الضوئي. ومع ذلك، فمن الممكن لتحديد مركز البقعة، وهذا هو، والموقع من وجوه، مع دقة أعلى بكثير ^3. مضان التصوير بدقة نانومتر واحد (FIONA) هو تقنية بسيطة ولكنها مفيدة لتوطين fluorophores واحدة مع الدقة نانومتر في الطائرة س ص ^4. دقة الترجمة، _σ μ (أي الخطأ المعياري للمتوسط)، ويعتمد على عدد الفوتونات التي تم جمعها، حيث N هو عدد الفوتون، S هو الانحراف المعياري للبقعة الفلورسنت، وغيرحجم بكسل للكشف والتصوير، وب هو الانحراف المعياري للخلفية ^3،4. لfluorophore انبعاث الفوتونات ~ 10،000، يمكن تحقيق FIONA ~ 1 نانومتر الدقة ^4.

FIONA يمكن استخدامها لتحديد بدقة موقف باعث ثابت أو متحرك واحد (على افتراض الصور يمكن اتخاذها بسرعة كافية). FIONA يمكن تطبيقها بالتتابع إلى الإطارات من الفيلم وبالتالي تتبع حركة جزيء واحد ^{4- 8.} قد تكون الكواشف-صور الوقائية اللازمة لضمان أن العينة لا التحلل الضوئي. وعلاوة على ذلك، الكائن الفلورسنت نفسها قد تكون من أي حجم، أصغر أو أكبر من حيود limit- على سبيل المثال، قد تتكون من عضية (~ 1 ميكرون) مع العديد من البروتينات الفلورية فرقت على غشاء لها. باستخدام FIONA لا تزال تسفر عن دقيقة جدا (نانومتر) بمعدل متوسط ​​الوسط من كتلته. تحسن كبير في دقة الترجمة من قبل FIONA يسمح حل nanomeالحركات ثالثا النطاق مع مرور الوقت. وقد دفع هذا المجهر في طول النطاق الجزيئي ^{4- 8.}

منذ اختراع لها، وقد تم تطوير أنواع من FIONA. على سبيل المثال، والتصوير مشرق الميدان مع دقة نانومتر واحد (bFIONA) ^9، وهو البديل طفيف FIONA والصور ويموضع الأجسام الكثيفة مثل الأجسام الصباغية في الجسم الحي (الأجسام الداكنة التي تحتوي على صبغة الميلانين) مع الضوء المرسل. بالإضافة إلى ذلك، واستخدمت FIONA لحل الأصباغ متعددة. على سبيل المثال، واحد جزيء التصوير ذات الدقة العالية مع photobleaching من (الجمبري) ^10،11 أو واحد جزيء عالية الدقة colocalization (SHREC) وقد وضعت ¹² لحل اثنين من الأصباغ خلال حوالي 10 نانومتر. (لاحظ أن هذا هو القرار، أي كيف يمكن للمرء أن أقول بدقة الأصباغ بصرف النظر متطابقة.) وفي الآونة الأخيرة، ساهم تحليل FIONA لعملية توطين معين فائقة قرار المجهري مثل ريكو البصرية العشوائيةالمجهر nstruction (STORM) ^{13- 15} و تنشيط صورة توطين المجهري (النخيل) ^16، التي fluorophores المظلمة المؤقتة متحمس، ثم يتم ترجمة مضان. بواسطة مثيرة مرارا كثافة منخفضة نسبيا من الأصباغ (أقل من واحد في الحيود بقعة محدودة)، ثم جمع مضان، وتحليل كل منهم FIONA، يمكن للمرء بناء على خريطة عالية الدقة. القرار بعد ذلك يقتصر على عدد الفوتونات كل صبغ يضع بها، فضلا عن أشياء مثل الحفاظ على عينة ثابتة (بما في ذلك، على سبيل المثال، المسرح المجهر) خلال عملية الاستحواذ.

في هذه الورقة، ملخصا لتقنية FIONA وصفا موجزا أمثلة على البحوث التي تم تنفيذها باستخدام يقال FIONA. أولا، كيفية إعداد المعدات اللازمة لإجراء التجارب FIONA، أي مجموع الداخلية انعكاس مضان المجهري (TIRFM)، مع تفاصيل عن محاذاة البصريات، يوصف. ثم كيف لتنفيذ تجربة FIONA بسيطة على توطين وظائفها و Cy3-DNA الجزيئات واحدة باستخدام البروتوكولات الملائمة، ويتضح. بعد ذلك، واستخدام FIONA لقياس 36 نانومتر حجم الخطوة من الميوسين اقتطاع فرجينيا محرك واحد وصفت مع الكم نقطة وتقدم. ميوسين فرجينيا هو بروتين محرك processive الضروري الذي يحمل البضائع الخلوية بينما translocating على طول خيوط الأكتين. هنا يتم استخدام ميوسين فرجينيا بناء اقتطاع لإزالة مجالات لا علاقة لها حجم الخطوة، ومع علامة FLAG تضاف إلى C-محطة للسماح سهولة وضع العلامات مع نقاط الكم بين functionalized مع الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تتم هذه التجربة في ظل انخفاض ATP لإبطاء الميوسين والسماح باستخدام الطويلة مرات التعرض كافية للحصول على عدد الفوتون جيد في كل إطار. يمكن استبدال أي تسمية الفلورسنت مشرقة بما فيه الكفاية في البروتوكول التالي. وأخيرا، يقال جهد مؤخرا توسيع نطاق تطبيق FIONA لعينات سميكة. كمبدأ إثبات صحة، كانت غارقة نقاط الكمالمواد الهلامية في سول والقرنيات أرنب العين ثم تصويرها والمحلية باستخدام FIONA. للتصوير، هدفا غمر المياه 60X مع NA = 1.2 كان يستخدم لهذا الهدف وعلى مسافة عمل أطول مما كانت سابقا 100X الهدف الغمر النفط. لتعويض الخسارة في التكبير في الهدف، تم إدراج عدسة التكبير خارج (3.3X 4.0X أو) في مسار الانبعاثات. بالإضافة إلى ذلك، برنامج التحصين الموسع ومضان (لا TIR) يحتاج المجهري لاستخدامها للوصول إلى المناطق العميقة في عينات سميكة. يتبين أن نقاط الكم غارقة في عمق المواد الهلامية سول والقرنيات أرنب العين (Z> 200 ميكرون) يمكن أن تكون مترجمة 2-3 مع الدقة نانومتر.

بيان الأخلاق: تم جمع أنسجة القرنية من الأرانب وفقا لجامعة إلينوي المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية.

الإعداد 1. TIRFM

ملاحظة: ارتداء نظارات الليزر السلامة في كل وقت.

1. تأكد من أن كافة المكونات البصرية الضرورية المدرجة في قائمة المواد متوفرة وجاهزة للالمحاذاة. إذا لزم الأمر، استخدام بدائل مع وظائف ما يعادلها من الشركات الأخرى. تأكد من أن العدسات المرايا وينبغي أن يكون الطلاء المضادة للانعكاس (AR) مطابقة الليزر في الاستخدام.
2. تعيين مرتفعات جميع المكونات البصرية إلى ارتفاع وسط المجهر العودة الميناء.
3. جبل ليزر، مصراع الليزر وفلتر ND (ق). استخدام المرشحات ND للتخفيف من قوة الليزر أسفل أدنى مستوى ممكن مع الحفاظ على شعاع مرئية. تشديد الخناق مع مفاتيح عرافة المناسبة.
4. تخطيط مسار الشعاع ووضع علامة عليه مع الشريط أو علامة على الطاولة البصرية (نقطةخطوط زرقاء تيد في الشكل 1). للبساطة، والحفاظ على مسارات مستقيمة على طول خطوط من الثقوب على الطاولة البصرية.
5. مكان المرآة M1 (الشكل 1) في أول الصحيح زاوية بدوره. وضع القزحيات اثنين على طول القسم الثاني على التوالي مسار الشعاع المخطط لها. ضبط كلا من موقف وميل M1 مثل أن الليزر يمر عبر قزحية العين.
6. مكان المرآة M2 (الشكل 1) في الثاني زاوية بدوره الصحيح. وضع المتوسع شعاع 10X (L1 و L2، الشكل 1) على طول القسم الثالث على التوالي للمسار. ضبط إمالته بحيث المتوسع شعاع مواز لكل من الجدول البصرية ومسار الشعاع المخطط لها.
   1. ضبط M1 و M2 مثل تكرارا أن الليزر يذهب بصراحة من خلال مراكز كل من العدسات من شعاع المتوسع. كرر هذه الخطوة حتى ملف شعاع من شعاع الموسع هو غير قص التمويه.
7. ضبط M1 إلى مركز شعاع على L1 (فايجوري 1) و M2 لتوسيط شعاع على L2 (الشكل 1) تكرارا. لمحة شعاع سيئة تعني عادة يتم قص الليزر. استخدام قطعة من الورق الأبيض لمنع شعاع بعد شعاع المتوسع للتحقق من ملف شعاع مع العينين. لتحليل عالية الدقة، واستخدام التعريف الشعاع الضوئي.
8. ضبط المسافة بين L1 و L2 بحيث شعاع موازى و. كرر الخطوة 1.8 و 1.9 إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: عندما لا يتغير حجم المسافة مع شعاع وشعاع موازى بما فيه الكفاية لإعداد TIRFM. لزيادة تحسين إيزاء شعاع، يمكن أن تستخدم أدوات مثل تداخل القص. وحجم شعاع نموذجي بعد التوسع هو ~ 20 ملم.
9. مصراع الليزر. فك الهدف المجهر والمسمار في محاذاة الهدف الفلورسنت. مكان يعكس M3 و M4 (الشكل 1) لتوجيه شعاع موسع في منفذ المجهر وعلى المرآة مزدوج اللون داخل البرج. تأكد من أن شعاع الليزر مستبعد قبالة رانه مزدوج اللون ونحو السقف.
10. ضبط M3 لتوسيط ألمع جزء من شعاع على الهدف الفلورسنت، وM4 لضبط الميل إلى أن شعاع الرأسي.
11. مصراع الليزر والمسمار الهدف الخريطة. إذا كان يتم محاذاة في الخطوة السابقة بشكل جيد يجب أن يكون هناك بقعة متماثل الخروج من الهدف. صقل يميل من M3 و M4 لتحسين قوة الليزر وملف شعاع من الهدف.
12. جبل كاميرا EMCCD إلى المجهر وتوصيل الكاميرا إلى جهاز كمبيوتر. بدء برنامج للكاميرا.
13. جبل عينة الفلورسنت (حل fluorophores) على المجهر. نظرة على بقعة مشرقة الفلورسنت على الكاميرا. تأكد من أن بقعة لا تحول على الشاشة كما يتم تغيير التركيز.
14. وضع عدسة TIR (L3، الشكل 1) على المسرح الترجمة XYZ على مسافة من الطائرة تنسيق الخلفية للهدف الذي يساوي البعد البؤري للL3 (~ 30 سم). ضبط الموقف من L3مثل أن الليزر يمر عبر مركز العدسة.
15. ترجمة L3 على طول مسار الشعاع لضبط إيزاء شعاع. تأكد من أن شعاع لا تزال تركز على رصد ومتناظرة في الشكل.
    ملاحظة: منطقة الإضاءة في الزيادات الطائرة عينة مع انخفاض TIR عدسة البعد البؤري. بشكل عام، استخدم أصغر البؤري التي يمكن احتواؤها على مجموعة المتابعة.
16. ترجمة L3 عمودي على مسار الشعاع لإمالة شعاع من الهدف. الحفاظ ترجمة بحيث يتحقق TIR عدسة TIR. نلاحظ عينة من الخرز الفلورسنت من خلال الكاميرا EMCCD، وصقل L3 للحصول على SNR جيد.

الرقم 1. التكوين البصري لمجموع المجهري التأمل الداخلي مضان (TIRFM).

2. FIONA و Cy3 على الحمض النووي

1. Cالعجاف الشرائح المجهر وcoverslips: شطف الشرائح المجهر وcoverslips مع DDH ₂ O والأيزوبروبانول وتجفيفها مع غاز النيتروجين. وضع الشرائح وcoverslips في نظافة البلازما لمدة 5 دقائق تحت الأرجون البلازما.
2. بناء غرف العينة (كما رسمت في الشكل 2).
   1. وضع منديل ورقي على مقاعد البدلاء ومن ثم وضع قطعة من الورق العدسة على الجزء العلوي من الأنسجة. وضع شريحة على ورقة العدسة. تأكد من أن الجانب نظيفة من الشريحة صعودا.
   2. تطبيق قطعتين من الشريط على الوجهين على الشريحة على طول حواف طويلة، مما يترك فجوة من 3-5 ملم في المركز. وضع ساترة تنظيفها على رأس الشريحة. تأكد من أن الجانب نظيفة ساترة تواجه الشريحة.
   3. استخدام غيض ماصة في الضغط على الشريط على الوجهين. استخدام شفرة حلاقة لإزالة الشريط الزائدة من الشرائح بحيث يظل الشريط فقط تحت ساترة.
      ملاحظة: يتم ترك نهايات مفتوحة من الغرفة مفتوحة ويكون بمثابة مدخل والخروجالسماح. حجم الغرفة هو عدة ميكرولتر.

الشكل 2. رسم من غرفة عينة نموذجية (أ) أعلى نظرا؛ (ب) الجانب الشخصي من الحق. (ج) الجانب الشخصي من الجبهة.

3. شل و Cy3-DNA على الأسطح الداخلية للعينة غرف.
   1. إعداد T-50 العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم). إعداد BSA-البيوتين في T-50 في تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. إعداد عازلة T50-BSA عن طريق إذابة BSA في T-50 في تركيز النهائي من 10 ملغ / مل.
   2. إعداد 0.5 ملغ / مل neutravidin في المخزن T50-BSA. إعداد المعقدة البيروكسيديز و Cy3 المسمى DNA (و Cy3-DNA) في T50-BSA بتركيز نهائي من 5-10 مساء.
   3. ماصة 10 ميكرولتر BSA-البيوتين (1 ملغ / مل) في حجرة العينة. الانتظار لمدة 5 دقائق.
   4. غسل الغرفة مع 40 ميكرولتر T50-BSA. ماصة 10 ميكرولتر neutravidin (0.5 ملغ / مل) في حجرة العينة. احتضان لمدة 5 دقائق.
   5. غسل الغرفة مع 40 ميكرولتر T50-BSA. ماصة 20 ميكرولتر و Cy3-DNA في غرفة العينة. احتضان لمدة 5 دقائق ثم يغسل الغرفة مع 80 ميكرولتر T50-BSA.
4. صورة و Cy3-DNA الجزيئات واحدة تحت TIRFM.
   1. إعداد عازلة التصوير (100 ميكرولتر) عن طريق خلط 1 ميكرولتر Protocatechuate-3،4-دي أكسيجيناز (PCD، 5 ميكرومتر)، 4 ميكرولتر حمض الكافيك (PCA، 62.5 ملم)، 50 ميكرولتر 6 هيدروكسي 2،5،7،8- tetramethylchromane-2-حمض الكربوكسيلية (Trolox، 2 مم في T-50)، و 45 ميكرولتر T50-BSA.
   2. ماصة 30 ميكرولتر عازلة في التصوير والانتظار لمدة 8-10 دقيقة.
   3. جبل العينة للتصوير على أن TIRFM مجهز الليزر الأخضر (532 نانومتر)، هدفا الغمر النفط 100X (1.45 NA)، وكاميرا EMCCD.
   4. ضبط الوقت التعرض ل100-500 ميللي ثانية وEM الربح إلى 25 إلى 100. اكتساب فيلم من عينة ل1،000 الإطارات.
5. لتحليل البيانات FIONA على الصور المسجلة و Cy3 من الحمض النووي.
   1. تحديد الحجم الفعلي بكسل (أي عامل التحويل من بكسل إلى نانومتر) بقسمة حجم بكسل المادي (يقرأ من ورقة مواصفات الكاميرا EMCCD) من إجمالي التكبير (التكبير من الهدف المجهر مضروبا أي تكبير إضافية).
   2. تحديد عامل التحويل من شدة بكسل لفوتون الأرقام بقسمة الحساسية CCD (أي الإلكترونات في عدد A / D، وقراءة من ورقة مواصفات الكاميرا CCD) من خلال مضاعف الإلكترون (EM) مكاسب استخدمت خلال الحصول على الصور.
   3. ترجمة وتشغيل FIONA.pro لتحليل FIONA. استخدام هذا البرنامج IDL لاستيراد صورة المكتسبة، لإدخال حجم بكسل فعال (من الخطوة 2.5.1) وعامل التحويل من كثافة لعدد الفوتون (من الخطوة 2.5.2)، واختيار المواقع لتحليل FIONA.
      ملاحظة: في نهاية المطاف، فإن PROGRAم إرادة إخراج النتائج المناسب مع وظائف 2D التمويه، وكذلك مجموع أرقام الفوتون ودقة الترجمة. ويرد نتيجة نموذجية في قسم النتائج تمثيلية وأرقام 4C-4D.
   4. ترجمة وتشغيل phcount.pro لوصف عدد الفوتون. استخدام هذا البرنامج IDL لقياس متوسط ​​عدد الفوتونات المنبعثة من fluorophore photobleaching من قبل، لاستيراد صورة والمكتسبة لإدخال عامل التحويل من كثافة لعدد الفوتون (من الخطوة 2.5.2).
      ملاحظة: سيقوم البرنامج ثم كشف البقع الفلورسنت تلقائيا (اختيار اليدوي هو خيار)، وحساب التهم الفوتون بوصفها وظيفة من عدد الإطار، والإخراج آثار التهم الفوتون.
      1. تجاهل آثار سيئة وتحديد نطاقات إطار بعد photobleaching من خط الأساس للتصحيح. في النهاية، سوف إخراج قائمة من إجمالي أعداد الفوتون لجميع البقع لا تجاهل البرنامج. ثم رسم توزيع الأرقام الفوتون وتناسب distribuنشوئها مع الاضمحلال الأسي للحصول على متوسط ​​عدد الفوتون. ويرد نتيجة نموذجية في قسم النتائج تمثيلية وشخصيات 4E-4F.

3. FIONA التطبيقية لقياس موتور (مثل الميوسين على الأكتين) الديناميات على مقياس نانومتر

1. بلمرة الأكتين (أي إعداد-F الأكتين) قبل التجربة FIONA يوم واحد.
   1. إعادة G-الأكتين (مونومر) والبيوتين G-الأكتين (مونومر) إلى 10 ملغ / مل مع العازلة الأكتين العام. اثارة للتأكد من حل كلا بالكامل، والحفاظ على حد سواء على الجليد.
   2. خلط 10 ميكرولتر G-الأكتين (مونومر) مع 1.7 ميكرولتر البيوتين G-الأكتين في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر الجليد الباردة عازلة بلمرة الأكتين.
   3. يترك الخليط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (F-الأكتين شكلت) ثم قم بإضافة ده ₂ O إلى إجمالي حجم 1 مل.
   4. تخزين خيوط الأكتين (F-الأكتين) في 4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا في التجارب.
      ملاحظة: سوف تتفكك خيوط وتقصير مع مرور الوقت، ولكن يمكن استخدامها لمدة أسبوعين على الأقل.
2. تحضير العينة للتصوير.
   1. جعل حجرة العينة (كما هو موضح في بروتوكول 2.1 و 2.2). ماصة في 20 ميكرولتر المعقدة البيروكسيديز BSA في 1 ملغ / مل في DDH ₂ O. احتضان لمدة 10 دقيقة. شطف مع 30 ميكرولتر DDH ₂ O.
      ملاحظة: يمنع هذا السطح الزجاجي وتنص على البيوتين لربط خيوط الأكتين. البيروكسيديز بولي-L-يسين - غليكول البولي إثيلين (PLL-PEG) يمكن أن تخدم نفس الوظيفة.
   2. ماصة في 0.5 ملغ / مل neutravidin. احتضان لمدة 2 دقيقة ثم يغسل الغرفة مع 30 ميكرولتر M5 العازلة.
   3. ماصة في المعدة F-الأكتين المخفف 25 مرة في المخزن الأكتين العام، إلى التركيز النهائي ~ 0.004 ملغ / مل. انتظر 10 دقيقة، شطف مع 30 غرفة عازلة ميكرولتر.
   4. تمييع الميوسين فرجينيا مع بطاقة FLAG 30 أضعاف في M5 العازلة (20 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 2 مم MgCl ₂ و 25 ملي بوكل، 1 ملم EGTA) إلى تركيز س النهائيو 250 نانومتر. مزيج 1 ميكرولتر الميوسين مع 1 ميكرولتر مكافحة FLAG-Qdot705 (~ 1 ميكرومتر، مترافق من الأجسام المضادة لمكافحة FLAG وQdot705 باستخدام الأجسام المضادة Qdot705 الإقتران كيت وفقا لدليل التعليمات من الشركة المصنعة). إضافة في 8 ميكرولتر M5 لملء إلى 10 ميكرولتر. ماصة صعودا وهبوطا لتخلط جيدا. احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: هذا ينتج خليط من المحركات 1 إلى 4 نقاط الكم، في ~ 25 نانومتر تركيز الميوسين.
3. التصوير للميوسين المشي على الأكتين.
   1. إعداد عازلة التصوير (100 ميكرولتر) عن طريق خلط 84 ميكرولتر M5-BSA (M5 عازلة مع 1 ملغ / مل BSA)، ATP 1 ميكرولتر (50 ميكرومتر في DDH ₂ O)، 2 ميكرولتر DTT (500 ملم في DDH ₂ O)، 1 CK ميكرولتر (500 U / مل)، و 5 ميكرولتر CP (200 ملم)، 1 ميكرولتر PCD، 4 ميكرولتر PCA، 1 ميكرولتر ميوسين-qdot بعد تخفيفه 10 أضعاف إلى 2.5 نانومتر آخر تركيز ميوسين، و1 ميكرولتر BME.
   2. ماصة في 20 ميكرولتر عازلة التصوير لأخذ عينات الغرفة واحتضان لمدة 8-10 دقيقة.
   3. صورة العينة على TIRF المجهر في 30 التعرض ميللي ثانية. الحصول على ما لا يقل عن 1،000 الإطارات. ضبط حجم ميوسين-qdot في الخطوة 3.3.1 إذا لزم الأمر.
4. لتحليل البيانات والعثور على الحجم خطوة من الميوسين المشي.
   1. فتح ملف الفيديو في ImageJ ¹⁷ واقتصاص الفيديو حول بقعة مؤثرة. المحاصيل على مساحة واسعة بما فيه الكفاية أن بقعة لم يحصل في غضون 20 بكسل من الحافة، والتأكد من عدم وجود بقع أخرى في الفيديو. تأكد من أن هذه البقعة تتحرك في مسار خطي.
   2. تتبع فورا، من خلال الفيديو لتوليد x و y تنسق عبر الزمن، في بكسل، من خلال تطبيق تحليل FIONA (الخطوة 2.5.3) إلى كل إطار من الفيديو.
   3. تحويل بكسل إلى نانومتر، كما هو موضح في القسم السابق.
   4. حساب النزوح من الموقف المبدئي بوصفها وظيفة من الزمن.
   5. تشغيل اختبار t على النزوح للحصول على خطوات ميوسين المشي.
      ملاحظة: هذا البرنامج ينص على اختبار t (step_t_test.zip) يتم ترميز في IDL ويخدعsists 14 من الوظائف الفرعية في المجلد.
      1. فتح جميع الوظائف الفرعية في IDL وتجميع كل مرتين. قم بتشغيل mtltyanalysis_ttest.pro واختيار ملف نصي يحتوي على البيانات فقط المسافة في عمود واحد. سيتم إنشاء ملف Excel الإخراج، الذي يحتوي على البيانات الخام، وصالح، وحجم الخطوة.
   6. حذف كل القيم الصفر من العمود حجم الخطوة. رسم توزيع أحجام خطوة المنشأ أو باستخدام MATLAB. تناسب التمويه على الرسم البياني.
      تحتاج أحجام الخطوة القيم الصفر ليتم حذفه لأن خطوة من الصفر يعني أن أي خطوة تتخذ من الإطار السابق: ملاحظة. تركيب يعطي الذروة حوالي 36 نانومتر (كما هو موضح في الشكل 5).

4. سميكة إعداد نموذج لFIONA

1. إعداد نقاط الكم مغلفة في سول هلام.
   1. خلط 4.5 مل TMOS، 1 مل DDH ₂ O و 100 ميكرولتر حمض الهيدروكلوريك (120 ملم). يصوتن الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة في نظافة بالموجات فوق الصوتية ليرة سوريةecified في قائمة المواد (التردد = 40 كيلو هرتز، سخان = إيقاف). مزيج الحل كل 10 دقيقة.
   2. تمييع 1.5 ميكرولتر Qdot605 في 1.5 مل HEPES (50 ملي درجة الحموضة 7.2). مزيج حل مع 1.5 مل TMOS من الخطوة السابقة.
   3. صب الخليط في طبق أسفل الزجاج. ختم طبق أسفل الزجاج مع parafilm وتخزينها في 4 درجة مئوية ل1. 5 ساعة.
   4. إضافة 2 مل 1٪ BME في برنامج تلفزيوني على طبق عينة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.
2. تحضير العينة القرنية ملطخة نقاط الكم.
   ملاحظة: كانت الأرنب عيون الهدايا من الدكتور مرسى مارجانوفيتش.
   1. فصل القرنية من عيون وقطع عليه في 3 مم × 3 مم قطعة.
   2. تمييع 1 ميكرولتر Qdot 605-streptavidin في 1 مل من برنامج تلفزيوني. احتضان الأنسجة القرنية مع 1 نانومتر Qdots الحل عند 4 ºC لمدة 1 ساعة. غسل الأنسجة مع PBS.
   3. تأخذ شريحة زجاجية نظيفة وساترة # 1.5. وضع 4 طبقات من الشريط مزدوجة من جانب على شريحة زجاجية على طول الجانب الأطول، والثانية وضع 4 طبقات أخرى من جهين الشريط الموازي للشريط السابق وترك القناة حوالي 1 سم بين بين. وضع الأنسجة من الخطوة السابقة في منتصف القناة، وتغطية ذلك مع ساترة.
   4. اضغط برفق على جانبي ساترة لجعله التمسك الأشرطة. الرطب القناة مع 50 ميكرولتر PBS قبل التصوير.
3. صورة نقاط الكم في سول جل والقرنية.
   1. لFIONA التصوير في عينات سميكة، استخدم الهدف 60X الغمر بالمياه مع العمل عن بعد من 0.27 مم، أو الهدف 60X الغمر بالمياه مع العمل عن بعد من 0.28 ملم.
   2. جبل العينة على المجهر. ضبط عدسة TIRF بحيث تصل إلى وضع برنامج التحصين الموسع ومضان (أي شعاع الليزر يخرج من الهدف مع زاوية ضد ساترة). إدراج عدسة التكبير إضافية (3.3X أو 4.0X).
   3. نقل البؤري للهدف إلى موقف ض المطلوب (مثل> 200 ميكرون). تسجيل صور متحركة منالنقاط الكمومية في العينة.
4. لتحليل FIONA كما هو موضح في القسم 2.5 من هذا البروتوكول.

ويرد نموذجية الهدف من نوع الإعداد TIRFM في الشكل 3. الأولى، تم تصوير عينة و Cy3-DNA-يجمد السطح. يظهر صورة نموذجية في الشكل 4A. تم التقاط هذه الصورة مع زمن التعرض 0.5 ثانية، مع تحقيق مكاسب EM = 50 والحساسية CCD = 12.13 للكاميرا. يظهر الانتشار وظيفة نقطة (PSF) من جزيء واحد و Cy3-DNA في الشكل 4B (من ركلة يشير إليه السهم في الشكل 4A)، حيث يظهر شريط اللون حجم كثافة بكسل. ويمكن حساب التهم الفوتون الفعلية بضرب كثافة بكسل بمعامل التحويل، حساسية α = CCD / EM كسب. تحتوي هذه البقعة حوالي 14،000 الفوتونات (بعد تصحيح الخلفية).

ثم تم تزويد قوات الأمن الفلسطينية مع وظيفة ثنائية الأبعاد جاوس، و (س، ص) = ض ₀ + A · إكسب (- (X-μ _س) ² / (2S _{× ²⁾} - (ص ​​- & #181، _ص) ² / (2S _ص ^2))، كما هو مبين في الشكل 4C (مع مخلفات المناسب هو مبين في الشكل 4D). ثم يتم احتساب دقة الترجمة من قبل حيث ط = س أو ص، ق _ط هو الانحراف المعياري للتركيب، N هو إجمالي عدد الفوتون، وهو هو حجم البكسل، و B هو الانحراف المعياري الخلفية. في هذا المثال محددة، N = 14،528، و= 106.67 نانومتر، ق _س = 115.5 نانومتر، ق _ص = 109.4 نانومتر، ب = 18.9، مما أدى إلى توضيحات توطين σ _س = 1.3 نانومتر، وσ _ص = 1.2 نانومتر. دقة الترجمة من fluorophore يتناسب تقريبا 1 / √N، أي المزيد من الفوتونات، وتوطين أكثر دقة هو. ومع ذلك، في التطبيقات الفعلية لFIONA، ومدة الملاحظة التجريبية هي اعتبار آخر. لذا واحدبشكل عام يجب تحقيق المفاضلة بين دقة الترجمة ومدة الملاحظة والتخطيط للمستقبل. في مثل هذه الحالات، فإنه من المفيد عادة لتحديد عدد الفوتونات في المجموع fluorophore قادر على ينبعث photobleaching من قبل. ويرد أثر نموذجي العد الفوتون مقابل الإطار في الشكل 4E. يعطي تركيب الأسي أن متوسط ​​عدد الفوتون ~ 1.4 × 10 ⁶ (الشكل 4F).

وأظهرت عملية تحليل البيانات من الميوسين قياس حجم الخطوة في الشكل 5. أولا، ملف فيديو مع الإشارة إلى الضوضاء جيدة من الميوسين واحد لأنه يمشي على طول يتم التقاط أي خيوط الأكتين. ويبين الشكل 5A ثلاثة إطارات من الفيديو التي اتخذت في 100 مللي ثانية مع التعرض الهدف 100X الغمر النفط. ثم يتم تتبع PSF تتحرك من خلال ملف الفيديو اقتصاص باستخدام تعليمات برمجية مخصصة مكتوب في IDL لاستخراج المسافة مقابل الوقت المعلومات، التي وضعت من خلال اختبار Tعن الخطوات. الشكل 5B يظهر مع المسافة مقابل الوقت (أحمر) وخطوة مكتشف الإخراج (أبيض). أخطاء الترجمة في كل إطار تحجب شكل الدرج من التتبع، لذلك فمن الأهمية بمكان لتحقيق العد فوتون في كل الإطار الذي يتوافق مع الخطأ توطين أقل من نصف حجم الخطوة النظري أحد يرغب في رؤية الشكل يظهر 5C خطوات من العديد آثار مجتمعة في واحدة الرسم البياني التي يتم توزيعها-التمويه عن حجم حقيقي خطوة الميوسين. الصالح جاوس إلى صناديق الرسم البياني غلة النهائي قياس حجم الخطوة من 35.8 ± 0.4 نانومتر.

لأن عينات سول جل والقرنية شفافة، ويمكن ليزر الإثارة التوغل عميقا في عينات دون منتشرة كثيرا. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تصغير لصناعة السيارات في مضان من العينة. عندما المسمى مع تركيز منخفض من نقاط الكم، فمن الممكن لجمع مضان من Qdots في عمق العينة مع إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. واستخدام المياه الهدف يعطينا مسافة العمل من 270 أو 280 ميكرون، مما يعني أنه من الممكن أن تركز بقدر 280 ميكرون بعيدا عن ساترة. وهذا يسمح لنا لإجراء تحليل FIONA على نقاط الكم في عينات سميكة. لنقاط الكم في عينة سول هلام، والدقة توطين 1-2 نانومتر بالقرب من ساترة و2-3 نانومتر في 280 ميكرون في عمق العينة (الأرقام 6A-6B) ويتحقق. لنقاط الكم في عينة بيولوجية (جزء من القرنية من العين أرنب، الشكل 6E)، دقة توطين 1-2 نانومتر بالقرب من ساترة و2-3 نانومتر في ~ 223 ميكرومتر في عمق العينة (الأرقام 6C-6D) ويتحقق. ويلاحظ أن الدقة توطين تحسين باستخدام عدسة التكبير إضافية، والتي بدونها تم الحصول على دقة الترجمة من 6-7 نانومتر. وهذا يتفق مع الدراسات السابقة العددية تبين أن دقة التعريب يمكن تحسينها عن طريق تغيير حجم بكسل فعال من ~ 200نانومتر إلى 50 نانومتر ~ حتى لو كان إجمالي عدد الفوتونات التي تم جمعها قد تكون أقل نظرا لانعكاسات إضافية / الانكسار ^18.

الرقم 3. التكوين البصري. التكوين البصري من مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري أ.) هو صورة عندما الليزر هو في حالة TIRF وب) هو شكل شعاع الليزر على السقف عندما الليزر في برنامج التحصين الموسع-الإضاءة.

الرقم 4. توطين وظائفها و Cy3-DNA. (256 × 256 بكسل) و Cy3-DNA. ب) اتفاقية مكافحة التصحر صورة من جزيء واحد و Cy3 الحمض النووي، التي أشار إليها ييل أ) اتفاقية مكافحة التصحر صورةالسهم منخفضا في). ج) تركيب وظيفة انتشار نقطة من جزيء واحد و Cy3-DNA مع وظيفة جاوس ثنائية الأبعاد. د) من مخلفات تركيب ج). ه) الفوتون العد مقابل عدد الإطار. و) توزيع عدد الفوتونات المنبعثة من جزيء و Cy3 photobleaching من قبل. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. الميوسين المشي لاحظها FIONA. أ) إطارات من ملف البيانات المثال الموافق T = 0 ثانية، 30 ثانية، و 60 ثانية. وبناء ميوسين-qdot يتحرك في على طول الطريق المستقيم، ولها عدد جيد الفوتون (> 5،000) في كل إطار. ب) تطبيق FIONA إلى كل إطار yieLDS المسافة مقابل الوقت الذي أثر المرسومة باللون الأحمر. ويستخدم خوارزمية لتقصي خطوة على أساس T-اختبار لثم استخراج الخطوات الفردية، ومضافين الإخراج في الأبيض. وصفت الأحجام خطوة في الأبيض في وحدات نانومتر. ج) خطوات من آثار متعددة يتم الجمع في الرسم البياني. أحجام خطوة هي قياس جاوس وزعت حوالي 35.8 ± 0.4 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6. تحليل FIONA على نقاط الكم عميقة في عينات سميكة. أ) صورة نيون من QD 605 في سول جل في Z = 280 ميكرون مع 90X التكبير. ب) انتشار ظيفة نقطة من QD وضع علامة في). σ _س = 2.6 نانومتر، σ _ص = 2.3 نانومتر. كل وحدة في X ومحور Y تمثل 266.7 نانومتر. ج) صورة نيون من QD 655 أرنب في الأنسجة القرنية في Z = 223 ميكرون مع 360X التكبير. د) PSF من QD وضع علامة في ج). σ _س = 2.2 نانومتر، σ _ص = 3.6 نانومتر. كل وحدة في محور X و Y تمثل 44.4 نانومتر. ه) صور من نسيج القرنية التي شنت على ساترة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

FIONA هي تقنية في توطين موقف باعث الفلورسنت (fluorophore العضوي أو الكم نقطة) مع الدقة نانومتر والقرار الزماني وصولا الى 1 ميللي ثانية ^{4- 8.} عندما يتم جمع ما يكفي من الفوتونات، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد موقف باعث الفلورسنت أكثر دقة بكثير من الحد حيود (~ 200 نانومتر)، وبالتالي يفتح هذا الأسلوب وسيلة لمراقبة ما لم يظهر مع التقليدية / التقليدية المجهر الضوئي ^{4 - 8.} منذ اختراع لها، وقد FIONA طبقت بنجاح لمراقبة قريبة من العديد من المحركات الجزيئية، مثل myosins وkinesins. وفي الآونة الأخيرة، فإنه، جنبا إلى جنب مع الأعمال الأخرى ^3،19، ساهم في عملية توطين تقنيات معينة الناشئة فائقة الدقة مثل STORM وPALM ^{13- 16.}

في خطوة حاسمة لتحقيق FIONA تكمن في عدد الفوتونات التي تم جمعها، والتي تتأثر المختلفة والجهات الفاعلة. على سبيل المثال، الإعداد TIRFM المستخدمة في التجارب FIONA يجب أن تنسجم جيدا أن هذا PSF جيد (أي لا تمتد، لا وصم، الخ) ويتحقق ويتم الحصول على إشارة إلى نسبة الضوضاء معقولة. وبالإضافة إلى ذلك، وهو هدف بقيمة NA عالية ينبغي أن تستخدم من أجل جمع أكبر عدد ممكن من الفوتونات ممكن.

لجمع المزيد من الفوتونات وبالتالي لزيادة الدقة التعريب، تم استكشاف طرق مختلفة زبال الأكسجين والكواشف لقمع photobleaching من وامض ^{20- 22.} وقد استخدمت طريقتين-الكسح الأكسجين المختلفة في مختبرنا. واحد هو "gloxy" الحل (أوكسيديز الجلوكوز والكاتلاز) ^20. والآخر هو وصف PCA / PCD فوق ^22. الأعمال السابقة مباشرة بعد خلط لكن الرقم الهيدروجيني من الحل التغيرات على مر الزمن. يبقي الحل الأخير دون تغيير كيميائيا ولكن لا بد من وضع فترة حضانة من 8 إلى 10 دقيقة.

وق هو موضح هنا، فمن الممكن أيضا أن أعرب FIONA سميكة لعينات باستخدام الهدف الغمر بالماء 60X مع NA = 1.2. ويشمل هذا الهدف على مسافة تعد تعمل (0.27 مم) مما كانت سابقا 100X الهدف الغمر النفط (0.17 ملم). للعمل على عينات سميكة، ويحتاج برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري لاستخدامها. على الرغم من أن الاستفادة من خلفية منخفضة من TIRFM التضحية، والدقة نانومتر التوطين لا تزال قابلة للتحقيق أثناء استخدام نقاط الكم مشرق. هذا التمديد سوف تكون مفيدة في التصوير الأنسجة سميكة والتطبيقات الطبية.

تطبيق FIONA محدودة في بعض الجوانب. أولا وقبل كل شيء، كما تعتمد توطين الدقة على عدد من الفوتونات التي تم جمعها، وعادة ما يثير الشبهة القرار الزمني للFIONA. ثانيا، FIONA وحدها لا يمكن تطبيقها على عينات المسمى قليلة. وبعبارة أخرى، سوف تفشل إذا FIONA fluorophores متعددة قريبة بما فيه الكفاية مثل تتداخل PSFs بهم. بالإضافة إلى ذلك، تناثر الضوء يحد من الانبعاثات ا ف بالثني من FIONA في سميكة الأنسجة التصوير.

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 068625 المنح والمنح جبهة الخلاص الوطني 1063188 ومركز الفيزياء الخلايا الحية 0822613. شكر خاص للدكتور مرسى مارجانوفيتش في معهد بيكمان للعلوم والتقنية المتقدمة لهدية من عيون الأرانب.