Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins sind von grundlegender Bedeutung für die Zelladhäsion durch Integrine aber Studien von ihnen von der Schwierigkeit, sie rekombinante Expression in bakteriellen Wirten angetroffen behindert. Wir beschreiben hier Methoden für die effiziente Produktion in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.

Kindlins wesentliche Coaktivatoren, mit Talin, der Zelloberflächenrezeptoren, Integrine und sich an Integrin-outside-in Signal-, und die Steuerung der Transkription im Zellkern. Die kindlins sind ~ 75 kDa Multidomänen-Proteine ​​und zu einer NPXY Motiv und vor T / S-Cluster der Integrin-β-Untereinheit zytoplasmatischen Schwanz binden. Die hämatopoetisch wichtigen Kindlin-Isoform, Kindlin-3, ist entscheidend für die Thrombozytenaggregation bei der Thrombusbildung, das Rollen von Leukozyten in Reaktion auf eine Infektion und Entzündung und Osteoklasten-Bildung in Podozyten Knochenresorption. Die Kindlin-3 Rolle in diesen Prozessen wurde in umfangreichen zelluläre und physiologische Studien geführt. Es besteht jedoch ein Bedarf für ein effizientes Verfahren zum Erfassen von hochwertigen Milligramm-Mengen des Proteins für weitere Studien. Wir haben ein Verfahren zur effizienten Expression und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 unter Verwendung eines Baculovirus-d entwickelt, hier beschrieben,zerrissen Expressionssystems in Sf9-Zellen ergibt ausreichende Mengen an hochreinem Protein voller Länge auf seiner biophysikalischen Charakterisierung ermöglichen. Der gleiche Ansatz könnte in der Studie von den anderen Säugetier Kindlin Isoformen genommen werden.

Proteine ​​der Kindlin Familie sind eine entscheidende Komponente der focal adhesion Montage und daher unerlässlich für komplexe Leben. Kindlins, von denen es 3 Isoformen in Säugern (Kindlin-1, Kindlin-2 und Kindlin-3), werden als Co-Aktivatoren von extrazellulären Rezeptoren, Integrine neben Talin ^1. Integrin-vermittelte Zelladhäsion verbindet die Zelloberfläche an die extrazelluläre Matrix (ECM) in höheren Eukaryonten. Es ist eine kritische und gemeinsame Verfahren in einer Vielzahl von physiologischen Erscheinungen, die Gewebeintegrität, der Embryogenese, Knochenstoffwechsel, Blutstillung und Immunität beinhalten. Integrin-vermittelte Zelladhäsion durch die Bindung von Talin und Kindlin die Integrin-β-Untereinheit cytoplasmatischen Schwanz (CTs) an ihren konservierten Motive NPXY durch inside-out Signaltransduktion aktiviert. Biomedizinische Bedeutung Kindlin Proteine ​​erstreckt sich jedoch bis zum Zellkern, wo Kindlin-2 wurde in mehreren jüngsten Berichten wurde gezeigt, daß bei der Transkription beteiligtal steuern ^2,3.

Kindlins sind Multidomänen-Proteine ​​von etwa 75 kDa, die durch den Besitz eines zweiteiligen C-terminalen FERM (4,1-Band, Ezrin, Radixin, Moesin)-Domäne, die durch eine Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne in der Mitte der Subdomäne F2 unterbrochen wird geprägt ^4,5. Untersuchungen der Kindlin-2-und-3 Kindlin PH-Domänen gezeigt, dass es in die Lipid-Second Messenger Phosphatidylinositol-(3,4,5)-Triphosphat und Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat ^6-8 bindet. , Studium der Kindlin-1-PH-Domäne zeigen jedoch, dass es bindet an PtdIns (3,4,5) P ₃ mit einer viel geringeren Affinität, die im Kindlin-1 durch eine Isoform-spezifischen Salzbrücke verhindert die Bindung von Lipiden erklärt werden kann ^9. Darüber hinaus gibt es eine ~ 100 Aminosäure Schleife in den F1-Domäne der kindlins, die voraussichtlich zu entfalten, aber bindet an Phosphatidylserin in dem inneren Blatt der Plasmamembran ^10,11 eingefügt. Die Kindlin FERMDomain wird als homolog zu der Talin FERM Domäne, obwohl die Talin FERM Domäne darf Pleckstrin Homologie-Domäne zu besitzen. Beide kindlins und Talin mit NPXY Motive auf den Integrin-β-Schwänze interagieren über die F3 Bereich ihrer FERM-Domäne, aber Kindlin bindet an die Membran distalen Motiv, während Talin zielt auf die Membran proximal ein ^12-16. Kindlins Talin und beide besitzen zusätzlich einen N-terminalen Domäne mit einem F0 Ubiquitin-artige Falte, die nicht in anderen Proteinen FERM ^11,17 zu finden ist. Studien über die F0-Domäne Kindlin-2 haben gezeigt, dass es unabhängig bindet an Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat angereicherten Membranen ^17.

Die kindlins zeigen Paralog-spezifische Gewebeexpressionsmuster und nicht-redundanten physiologischen Funktionen. Kindlin-1 wird hauptsächlich in der Epidermis exprimiert wird, sondern auch in einem geringeren Ausmaß die Dickdarm-, Magen und Nieren; Kindlin-2 ubiquitär exprimiert, aber in konzentrierter quergestreiften und glattenMuskel und ist die einzige Kindlin in der embryonalen Entwicklung exprimiert ⁴ und Kindlin-3 ist in den hämatopoetischen Geweben mit der höchsten Konzentration von Kindlin-3 in Megakaryozyten ¹⁸ gefunden ausgedrückt. Allerdings haben neuere Studien vorgeschlagen, dass funktionelles Protein in Endothelzellen Gewebe sowie ¹⁹ ausgedrückt.

Kindlin-3 ist von akuten medizinischen Interesse durch seine wichtige physiologische Rolle im Blut. Es ist kritisch für die Blutplättchenaggregation und Thrombusbildung Ausbreitung während ²⁰ Leukozytenrollen in Reaktion auf eine Infektion und Entzündung ^21,22 und Osteoklastenbildung in podocyte Knochenresorption ^23. Außerdem Erschöpfung der Kindlin-3 bei Menschen führt zu Haftung Mangel Typ-III Leukozyten - eine Krankheit, die durch lebensbedrohliche Blutungsstörungen und wiederkehrenden bakteriellen Infektionen ^20,24,25. Kindlin-3-Knock-out-Studien an Mäusen zeigte die entscheidende Funktion des Proteins inZelladhäsion KIND3 ^{-. / -} Mäuse zeigen unterschiedliche Phänotypen, wie schweren Blutungen aufgrund inaktiver Thrombozyten-Integrine, schwere Osteopetrose und die Beeinträchtigung der Leukozyten-Adhäsion ^20,22, ähnlich Symptome beim Menschen fehlt Kindlin-3.

Hochauflösende Strukturdaten auf den kindlins bis heute hat sich die einzelnen Teilbereiche wie die Pleckstrin Homologie (PH)-Domäne von ^Kindlin-1-9 und Kindlin-2 ^26,27 und der F0-Domäne von Kindlin-1 ¹¹ und Kindlin beschränkt -2 ^17. Die meisten der Sub-Domains von jedem Kindlin Polypeptid haben jedoch widerstanden Klonierung und Strukturanalyse (Yates und Gilbert, unveröffentlichte Beobachtungen) und Studien über die vollständigen Proteine ​​wurden von der Schwierigkeit der Expression und Aufreinigung ausreichender Menge mit E. behindert coli (unveröffentlichte Beobachtungen und Harburger et al. ^14). Es besteht ein erhebliches Interesse an der medizinischen Kindlin-3 und seine funktion, neben den anderen beiden Familienmitglieder, und vor kurzem haben wir erzeugt Milligramm-Mengen in das durch rekombinante Expression in Spodoptera frugiperda Zellen durch Baculovirusinfektion ¹² angetrieben. Wir beschreiben daher Verfahren zur Herstellung von Milligramm-Mengen von rekombinantem Maus Kindlin-3 in Insektenzellkultur, für die extensive Strukturuntersuchungen und biochemische Analyse.

In diesem Protokoll nutzen wir eines konstruierten Knockout Bacmid (BAC10 _{KO: 1629)} das ist, allein, nicht in der Lage, lebensfähige Virionen ²⁸ zu produzieren. Die virale DNA wird somit durch Rekombination mit einem Transfervektor, der in diesem Fall auch die Kindlin-3-Gen (FERMT3) und resultiert in der FERMT3 Gen ersetzt, das Virus sehr späten Gens, das hochgradig exprimiert wird, aber überflüssig, was in einem rekombinanten gerettet Virus, Maus Kindlin-3 als Teil des Virus Lebenszyklus ²⁸ ausdrückt. Wir identifizierten dieseVerfahren für die Herstellung von Kindlin-3, nachdem Versuche, in anderen Expressionswirte Expression und Aufreinigung nachgewiesen prohibitiv schwierig (unveröffentlichte Beobachtungen), sondern auch aufgrund der Vielseitigkeit der POPIN Vektor-Suite, die wir für das Klonen verwendet werden und dass in vielen Ausdruck eingesetzt werden beherbergt ^29.

Dieses Protokoll wird davon ausgegangen, dass die Maus Kindlin-3-Gen (FERMT3) wurde erfolgreich in einen Vektor stromabwärts von der sehr späten p10-Promotor und der Vektor besitzt flankierende Baculovirus-Sequenzen, die Rekombination mit dem Bacmid BAC10 _KO ermöglichen _{kloniert: 1629} IM Jones entwickelt und ²⁸ Kolleginnen und Kollegen. Aus diesem Protokoll wurde die Kindlin-3-Gen in pOPINE ²⁹ kloniert und die Primer und Klonierung Strategie verwendet werden können, an anderer Stelle ¹² beschrieben gefunden werden. Das Plasmid wird so konstruiert, dass die FERMT3 Gen (Kindlin-3) unter der Kontrolle des p10-Baculovirus-Promotor und der Vektor 5 'UTR/ORF603 und ORF 1629 und codiert für ein C-terminales _His6-tag für die nachgeschaltete Reinigung ^29.

1. Insektenzellkultur und Wartung

1. Vor rekombinanten Baculovirus Amplifikation Spodoptera frugiperda-Zellen zu Suspensionskultur (Sf9-Zellen), die angepasst istgezüchtet und gehalten werden. Insektenzellen sollte immer unter aseptischen Bedingungen in einem speziellen Gewebekultur Abzug gehandhabt werden.
2. Suspensionskulturen von Insektenzellen sind Sf-900 II (SFM) serumfreien Flüssigmedium mit 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt in Kolben bei 27 ° C mit Schütteln bei 100 Upm inkubiert.
3. Pflegen Sie die Insektenzellkultur Dichtebereich zwischen 1 × 10 ⁶ - 1 x 10 ⁷ Zellen / ml durch Spaltung und mit frischem Sf-900 II Medien Verdünnen der Zellkultur.
   Hinweis: gesund Zellen sollten einheitlich in der Größe aussehen sollten kugelförmig sein.
4. Zählen der Zellen in einem Probenvolumen mit einer Zählkammer und Lichtmikroskopie, die Kultur die Zelldichte zu berechnen.

2. Erzeugung von rekombinantem Baculovirus

1. Kultur und aufrechtzuerhalten Sf9-Zellen in Suspension unter Verwendung von Sf-900 II Medium mit 100 ug / ml ergänzt Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. 1 x 10 ⁶ Zellen / ml - Baculovirus zur Erzeugung sollte Insektenzellen mit einem Dichtebereich von 5 x 10 ⁵ kultiviert werden.
2. Samen etwa 1 × 10 ⁶ Sf9-Zellen pro Vertiefung einer sterilen 6-Loch-Gewebekulturplatte in 2 ml Sf-900 II Medium mit 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Lassen Sie die Sf9-Zellen bei RT im Abzug auf der Basis der Kunststoffvertiefungen haften und bilden so eine Monoschicht.
3. Führen rekombinanten Baculovirus Erzeugung durch Cotransfektion Bacmid-DNA und Plasmid-DNA auf Monolayer-Kultur.
   1. Für jede Transfektion mischen 1-2 ug gereinigte pOPINE-mFERMT3, die die ORF1629 Baculovirus-Elemente, mit 0,5 ug gereinigt BAC10 _{KO besitzt: 1629} in 100 ul Sf-900 II SFM ohne Antibiotika (Lösung A).
   2. In einem separaten Röhrchen verdünnt 6 &mgr; l Cellfectin-Reagenz II mit 100 &mgr; l Sf-900 II SFM ohne AntiAntibiotika für jede Transfektion Reaktion (Lösung B). Ein "Master-Mix" finden Sie hier, geschaffen werden für reduzierte Liquid Handling, wenn viele Transfektionen benötigt werden.
   3. Man vermischt die beiden Lösungen (A und B etwa 200 ul) und Inkubation bei RT für 20 min, um eine Lipid-DNA-Komplex zu bilden.
   4. Verdünnen Sie die Lipid-DNA-Komplexe mit 800 ul Sf-900 II SFM ohne Antibiotika. Vorsichtig absaugen Sf9 Zellmonolayer Medien und vorsichtig pipettieren, die Lösung A / B und Medien auf der Sf9-Monoschicht.
   5. Der transfizierten Zellen in einem befeuchteten Brutschrank bei 27 ° CO / N, und fügen Sie weitere 1 ml Sf-900 II SFM ohne Antibiotika zu jedem Monolayer-Kultur am folgenden Tag. Zellen inkubieren bei 27 ° C für weitere 5 Tage.
4. Ernten des rekombinanten Baculovirus direkt aus dem Kulturmedium (etwa 2 ml gesamt) und in ein sauberes Zentrifugenröhrchen (zum Beispiel ein 15 ml-Falcon-Röhrchen).
   1. Abklären Sf9 Zell DEBRwird durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 min bei RT. Übertragen Sie das Virus, das in der resultierenden Überstand und bezeichnet P1, in ein sauberes Röhrchen und bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. In diesem Stadium kann die verbleibende Sf9-Monoschicht verwendet werden, um rekombinantes Virus Generation durch die Beurteilung der Anwesenheit von rekombinantem Kindlin-3 in den Insektenzellen herangezogen werden.
5. Resuspendieren die Monoschicht mit 0,5 ml PBS verdünnen und 10 ul Probe mit gleichen Volumen 2x SDS-PAGE-Ladepuffer. Erhitzen Sie die Proben bei> 95 ° C für mindestens 10 min.
   1. Beschallen der Probe für 1 s bei 10% Amplitude mit einem Mikro-Ultraschallgerät Tipp, wenn es zu zähflüssig für die richtige Gel-Lade ist.

3. Amplifikation des rekombinanten Baculovirus

1. Für die Amplifikation des Virus in Suspension, mit einem Zelldichte von 1,4 × 10 ⁶ Zellen / ml, und dies sollte zu besetzen 1/20 der Gesamtkolbenvolumen (dh 50 ml Kulturein 2-l-Kolben).
2. Erreichen die Amplifikation des rekombinanten Virus durch Infizieren der Insektenzellkultur mit dem Virusstamm P1 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1 unter Verwendung der folgenden Formel;
   
   Hinweis: P1 Virus Generation ausgegangen, um einen erwarteten Virustiter von 1 x 10 ⁷ PBE / ml aufweisen. Jedoch kann ein Plaque-Assay vor dieser Stufe durchgeführt werden.
3. Inkubieren der infizierten Insekten P1-Kultur bei 27 ° C unter Schütteln bei 100 Upm für 3 Tage (72 h).
4. Ernte des Virus durch Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT. Speichern des resultierenden Zellpellets in diesem Stadium zur Bestätigung der rekombinanten Virusproduktion durch Bestimmung Kindlin-3-Proteinexpression durch SDS-PAGE und Western Blotting.
5. Übertragen Sie die geklärt Virus-angereicherten Medien in ein sauberes Röhrchen und lagern bei 4 ° C indie dunkle bis zur Verwendung. Diese virale Lager wird als P2 bezeichnet.
   Hinweis: Eine virale Titer von 2 x 10 ⁸ pfu / ml (oder eine Verstärkungsrate von 100 pfu / Zelle) kann erwartet werden.

4. Expression Kindlin-3 in Baculovirus-infizierten Sf9

1. Wachsen ein ausreichendes Volumen von Sf9-Zellen in Suspensionskulturen in Sf-900 II SFM mit 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, vor großen rekombinanten Kindlin-3 Expression zur Reinigung ergänzt. Suspensionskulturen bei 27 ° C inkubieren mit Schütteln bei 100 UpM und mit einer Gesamtkulturvolumen: Kolben-Volumen-Verhältnis von 1:5.
2. Infizieren Suspensionskulturen von Sf9 bei einer Dichte von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Nachtrag Sf9 Kulturen mit einer endgültigen Konzentration von 1% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) folgten mit verstärkten rekombinanten Virus (P2-Virus Lager) zu einer MOI von 1 zu geben. Die infizierten Kulturen bei 27 ° C inkubieren mit Schütteln bei 100 UpM.
4. Ernte-Rekombinationnt Kindlin-3-CHIS _{6-exprimierenden} Sf9-Zellen 72 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation bei 1.000 xg   und das resultierende Zellpellet bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert oder -80 ° C zur Langzeitlagerung.

5. Reinigung von rekombinantem Kindlin-3

1. Eingefrorene Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Sf9)-Pellets rekombinanten Kindlin-3 exprimieren, auf Eis.
2. Resuspendieren aufgetaute Zellpellet mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), mit EDTA-freie Proteaseinhibitorcocktail und 1.000-2.000 U DNase1 ergänzt.
   Hinweis: Alternativ können modifizierte Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) verwendet werden, wobei die NaCl-Konzentration auf 500 mM eingestellt, um nicht-spezifische Wechselwirkungen zwischen endogenen Sf9 Zellproteinen und dem immobilisierten Metallaffinitätssäule für nachgeschaltete Reinigung verwendet (siehe unten) zu vermeiden.
3. Lyse der Zellen durch Inkubation der resuspendierten Zellen mit dem Detergens und vortexing. Mit Ultraschall (40% Amplitude, 10 Zyklen von 10 s Puls, gefolgt von 10 Sek. Kühlung) die Probe für weitere Zellaufschluss in einem Eisbad oder alternativ eine Dounce Homogenisator.
4. Klärung des Lysats durch Zentrifugation bei 48.000 × g für 1 h bei 4 ° C. Laden der resultierende Überstand auf eine HisTrap Säule (5 ml Säulenvolumen) mit Lysepuffer äquilibriert bei 4 º C mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min.
   Hinweis: Alternativ kann das geklärte Lysat mit 1-5 ml Bettvolumen voräquilibriert Nickel-Sepharose-Kügelchen (z. B. Ni-Sepharose 6 Fast Flow) bei 4 ° C für 1-2 Stunden inkubiert werden. Eine Kolonne von Ni-Sepharose kann nach dem Bindeschritt durch Verwendung einer Schwerkraftströmung Spalte gebildet werden.
5. Mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer waschen der Säule (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol), um ungebundene Proteine ​​zu entfernen.
6. Verwenden eines linearen Imidazol-Gradienten von 10 bis 500 mm bei einer Geschwindigkeit von 10 mM / ml (oder 10 Säulenvolumen) unter Verwendung eines FPLC eluiert Äktadas gebundene rekombinante _Kindlin-3-6 CHIS.
7. Fraktionieren die Elution in 0,5-1 ml-Fraktionen unter Verwendung des FPLC Äkta, mit jenen Fraktionen, die Kindlin-3-CHIS ₆ normalerweise unter Elution mit einer Imidazol-Konzentration von 300 mM.
8. Bewertung der Protein-Zusammensetzung des Eluats mittels SDS-PAGE und für erstmalige Reinigungen Bestätigung durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His _{6-Antikörper} oder Anti-Maus-Kindlin-3-Antikörper.
9. Pool der Fraktionen, die Kindlin-3 und Pufferaustausch in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl über eine Reihe von Verdünnungen in Puffer und Probenkonzentrationen unter Verwendung einer Zentrifugal-Protein-Konzentrator mit einer 50 kDa-Molekulargewicht-Cut-off (MWCO) bei 4 ° C.
   Hinweis: Alternativ dialysieren der Proteinlösung mit Slide-A-analysator Dialysekassette mit einer Molekulargewichtsschwelle von 30 kDa bei 4 ° C für 4 h auf O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl.
   Bemerkung: für den Ionenaustausch (siehe unten) eine geringere Konzentration an NaCl, dh 50 mM, kann und hat für diesen Schritt verwendet worden.
10. Anwenden der Puffer-ausgetauscht Proteinlösung auf eine voräquilibriert HiTrap Heparin HP-Säule (5 ml Säulenvolumen) unter Verwendung eines FPLC Äkta mit einer Rate von 0,5 ml / min.
    Hinweis: Das gebundene Kindlin-3 wird mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,2 M NaCl bis 1 M NaCl) im gleichen Puffer und erhöht mit einer Geschwindigkeit von 10 mM / ml eluiert. Kindlin-3-CHIS6 voraussichtlich bei etwa 0,6 M NaCl eluieren.
11. Fraktionieren die Elution in 0,5-1 ml Fraktionen und Beurteilung der Proteinzusammensetzung durch SDS-PAGE und Western-Blotting, gegebenenfalls.
    Hinweis: man kann ein Protein Reinheit von nahezu 95% erwarten, wie durch SDS-PAGE beurteilt.
12. Pool enthaltenden Fraktionen Kindlin-3 und Konzentrat unter Verwendung einer Zentrifuge Protein-Konzentrator mit einer 50 kDa MWCO auf ein Endvolumen von 0,5-2 ml.
13. In einem letzten Schritt Polieren der konzentrierten Protein und Pufferaustausch des Proteins unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC).
    1. Tragen Sie die gereinigten Protein auf eine Superdex S200 (16/60) oder (10/30) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT äquilibriert mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min bzw. 0,5 ml / min je nach Spaltengröße verwendet.
       Hinweis: Größenausschluss-Chromatographie kann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Bedarf durchgeführt werden.
    2. Aufreinigung der Proteine ​​der Größe nach durch Anlegen Puffer auf die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min bzw. 0,5 ml / min, je nach Größe der Spalte verwendet.
       Hinweis: Das Protein von der Säule eluiert und fraktioniert wird unter Verwendung der Absorption bei 280 nm überwacht.
    3. Eine einzelne Absorptionsspitze von SEC sollte, die fraktioniert und durch SDS-PAGE beurteilt, um die Homogenität zu bestimmen, ist, und ist typischerweise> 95% rein nach diesem Schritt erwarten.
14. Konzentriere das gereinigte Kindlin-3-CHIS ₆ unter Verwendung einer Zentrifuge Protein-Konzentrator mit einer 50 kDa MWCO auf ~ 15 mg / ml, wie spektrophotometrisch unter Verwendung eines berechneten Extinktionskoeffizienten (ε) von 109.320 M ^-1 cm ^-1 beurteilt ^</ Sup> (vorausgesetzt, alle Cysteinreste reduziert werden).
15. Für die Lagerung bei -20 ° C und Langzeitlagerung bei -80 º C, Aliquot des Proteins in PCR-Röhrchen und Flash-Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff. Alternativ kann das Protein direkt für die Untersuchung unter Verwendung einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Methoden verwendet werden.

Der Groß Expression von rekombinantem Maus Kindlin-3 unter Verwendung von Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen kann weniger als zwei Wochen, um Milligramm-Mengen zu erreichen, wie in der schematischen Fig. 1A dargestellt ist und nur eine kleine Menge der Plasmid-DNA aus einer QIAprep Miniprep Kit, Beispiel. Die Erzeugung von rekombinantem Baculovirus wird durch Cotransfektion von Sf9-Zellen mit Maus-Kindlin-3 (FERMT3) enthaltende Plasmid zusammen mit einem Werk linearisiert Bacmid (BAC10: KO ₁₆₂₉₎ erreicht, und das Ernten der neu gebildeten Virionen nach 5-7 Tagen, wie in Abbildung 1A. Diese Methode der Erzeugung Baculovirus 100% ergibt rekombinanten Viren und im wesentlichen verzichtet auf die Notwendigkeit für Plaque-Reinigung ^28,30. Eine repräsentative kleinen Maßstab (2 ml Mono) Kultur wird ein rekombinantes Virus-enthaltenden Lösung mit einem erwarteten Virustiter von 1 x 10 ⁷ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml erzeugenKultur. Man kann ein Plaque-Assay durchzuführen, um die tatsächliche virale Titer zu bestimmen, aber das ist vielleicht zu arbeitsintensiv, wenn eine große Anzahl von Konstrukten für Strukturstudien getestet. Der Erfolg des Virus Erzeugungsschritt durch Verwendung eines eGFP-enthaltende Plasmid parallel bewertet werden, oder, für diese Kindlin-3-Konstrukt kann die Sf9-Monoschicht in PBS resuspendiert und durch SDS-PAGE und Western Blotting beurteilt werden, welche typischerweise zeigt, eine deutliche Bande, die einem 75-kDa-His-markierten Proteins, wie es in Fig. 1B gezeigt. Das Virus wird anschließend verstärkt, um ausreichende Mengen für große (Liter Volumen) Insektenzellinfektion und rekombinante Proteinisolierung zu erzeugen. Der zweite Durchgang Virus (P2) durch Infektion von Suspensionskulturen mit einem geschätzten MOI von 0,1 (siehe Protokoll) erzeugt. Es ist wichtig, dass die Verstärkung Sf9-Suspensionskultur nimmt nur ein Zwanzigstel der gesamten Kolbenvolumen. Diese zusätzliche Belüftung gewährleistet, dass die resultierende virUS-enthaltende Medien, die nach 3 Tagen (72 Stunden) nach der Infektion geerntet, werden ausreichende Mengen Kindlin-3 in dem nachfolgenden Ausdruck Kultur zu erzeugen. Die amplifizierte Virus-Stock (P2) wird angenommen, dass eine erwartete virale Titer von 2 x 10 ⁸ pfu / ml, basierend auf einer konservativen Schätzung von 100 pfu / Zelle mit einer Zelldichte von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml während der Amplifikation ³¹ besitzen. Im allgemeinen ist für eine optimale Verstärkung und Baculovirus-Protein-Produktion, die Sf9-Zellen einheitlich sein in Größe und sphärisch, wie in Fig. 1C gezeigt. Zusätzlich ist die virale Amplifikation und Proteinexpression maximal bei 72 h nach der Infektion, und beide werden bei 96 h nach der Infektion wesentlich verringert.

Sobald Virus wurde verstärkt und zur Sf9-Zellen zu infizieren in Großversuche rekombinanten Kindlin-3 ist teilweise durch seine technisch C-terminalen His _6-Tag mit immobilisierten Metallaffinitäts chro gereinigtgraphie, wie in Fig. 2 gezeigt. Es ist wichtig für die Durchführung der Reinigung bei 4 ° C und dass ausreichende Proteaseinhibitoren wurden zugegeben, um Proteolyse zu verhindern. Das teilweise gereinigte Kindlin-3 ist zur Homogenität durch Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) mit einem Heparin-Säule weiter gereinigt, wie in Fig. 3 gezeigt. Wir verwendeten die Verwendung einer Heparinsäule anstelle einer herkömmlichen Ionenaustauschsäule, wie wir voraus, dass die große Anzahl von basischen Resten, einschließlich einer Poly-Lysin Strecke im Kindlin-3 F1 Domäne, stark mit den negativ geladenen Sulfatgruppen interagieren würde, der Spalte. Diese Strategie ist besonders nützlich für die DNA-und RNA-bindende Proteine ​​mit grundlegenden Nukleinsäure-Bindungsbereiche, beispielsweise der RNA-Bindeanschluß uridylyltransferase CID1 ^32. Schließlich Kindlin-3-Reinheit durch Größenausschluss-Chromatographie "poliert", um Aggregate zu entfernen und Homogenität zu erreichen, wie in gezeigt4. Die in den Protokollen festgelegten Puffer sind Standardpuffer häufig bei der Proteinreinigung für die Strukturanalyse verwendet. Im Allgemeinen werden Puffer auf Phosphatbasis zur Reinigung von Proteinen für Strukturuntersuchungen vermieden, insbesondere Kristallisation Screening auf die Bildung der Phosphatkristalle in den Kristallisationstropfen (insbesondere für die Experimente bei 4 ° C). Jedoch führten wir eine Thermofluor-basierten thermischen Shift-Assay zu bestimmen, welcher Puffer wurden für Kindlin-3 Stabilisierung, wie in Fig. 5 gezeigt. Kurz gesagt, wird eine gereinigte Proteinlösung in Puffer, die einen Bereich von pH-und Natriumchlorid-Konzentrationen decken verdünnt, bildet also einen 2-dimensionalen Bildschirm. Das Schmelzen des Proteins wird durch die Beobachtung der Fluoreszenz von Sypro Orange-Farbstoff (Molecular Probes), die an hydrophobe Reste in dem gefalteten Proteinkern, über den Temperaturbereich 20-95 º C (293-368 K) bindet, gemessen. Die Temperaturmittelpunkt, an dem the Protein entfaltet (Übergangstemperatur, T _m) wurde mit der Opticon Monitor-Software berechnet und wird an anderer Stelle beschrieben ^33. Kindlin-3 wurde beobachtet, dass bei hohen Natriumchloridkonzentrationen (500 mM) stabil im pH-Bereich 7,0-9,0, mit einem einheitlichen Übergangstemperatur (T _m) von 55 ° C. Es wurde auch beobachtet, dass die T _m der Kindlin-3 betrug etwa 55 ° C im pH-Bereich 7,0-7,5 unabhängig von Natriumchlorid-Konzentration.

Wir fanden, dass es nur begrenzte Proteolyse Kindlin-3 während der Reinigung, aber SDS-PAGE-Analyse von hochkonzentrierten Protein (~ 15 mg / ml) zeigten begrenzte Verunreinigung mit zwei zusätzlichen Polypeptiden von gleicher Intensität. Seltsam, aber es gibt keinen Hinweis auf weitere Spezies durch Größenausschlusschromatographie, wie in Fig. 4 gezeigt. Es wird daher vermutet, dass das Protein durch Proteasen eingekerbt bleibt jedoch gefaltet und HydroDynamically nicht von Protein voller Länge. Interessant ist, dass Calpain eine bekannte Protease, spaltet Kindlin-3 bei Tyrosine373, die in der β1-β2 Schleife des Pleckstrin Homologie (PH)-Domäne ist ³⁴ und kann unsere Beobachtungen zu erklären. Weiterhin zeigt Western Blot, dass einer der Polypeptid Dubletts einen C-terminalen His-Tag und das scheinbare Molekulargewicht des Dubletts besitzt, in der Summe gleich 75 kDa, das gleiche Molekulargewicht wie das native Protein. Die Ausbeute des gereinigten rekombinanten Kindlin-3 pro Liter von Sf9-Zellen (~ 2 g Zellgewicht) ist, bestenfalls 5 mg.

Fig. 1 ist. Übersicht der Baculovirus-infizierten Insektenzellen heterologe Proteinexpression. (A) Eine schematisierte Übersicht über Baculovirus genen und die Expression von Kindlin-3 in Sf9-Zellen. In der DNA-Vektor, Schaltpläne, wird 5'UTR / ORF603 in rot gefärbt, die ORF1629 ist grün gefärbt und das Gen des Proteins von Interesse (POI) ist blau eingefärbt. (B) Western-Blot, unter Verwendung eines Anti-His _{6-Antikörper,} der sechs kleinen Maßstab (2 ml Mono) Kulturen (Bahnen nach Kultur markiert) von Sf9-Zellen, die rekombinantes Baculovirus und rekombinantem murinem Kindlin-3. (C) Lichtmikroskopische Aufnahme von gesunden Sf9-Zellen in Suspension in Sf-900 II SFM gezüchtet, mit Antibiotika und einer 35-mm-Gewebekulturschale (siehe Protokoll) übertragen. Das Bild ist 20-facher Vergrößerung.

Abbildung 2. Representative Reinigung Kindlin-3 durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC). SDS-PAGE von Nickel Affinität gereinigten rekombinanten murinen Kindlin-3 in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen (~ 2 g Zellgewicht) ausgedrückt. Adsorbierte Protein wurde mit einem Imidazol-Gradienten (oberhalb des Gels gezeigt) eluiert. Lanes sind wie folgt beschriftet; MW, Molekulargewichtsmarker; Lys, Ganzzelllysat, FT, fließen durch (ungebunden), WI, waschen 1, WII, waschen 2. Western-Blot-Analyse (unten) wurde auch mit den Elutionsfraktionen, um die Anwesenheit des konstruierten His-Tag auf dem rekombinanten Protein bestätigen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. REPREtreter Reinigung Kindlin-3 durch Heparin-Affinitätschromatographie. (A) Elutionsprofil bei 280 nm (blau) Anzeigen einer einzigen symmetrischen Peak eluiert unter einem linearen Natriumchlorid-Gradienten (grün) mit der NaCl-Konzentrationsbereich von 0,05-1,0 M. (beobachteten B) SDS-PAGE-Analyse des fraktionierten Elution zeigt die Anwesenheit des 75-kDa-Protein, Kindlin-3 (mit der Aufschrift K3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Vertreter Gelfiltrationschromatografie und konzentriert Kindlin-3. (A) Gel Filtration Elutionsprofil von gereinigtem Kindlin-3 miteine Superdex S200 (16/60) in Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 1 mM DTT bei 20 ° C. Bezogen auf das Elutionsvolumen als Kindlin-3 wandert ein 75 kDa-Protein erwartet, was nahe legt, dass es vorwiegend monomeren ist. (B) SDS-PAGE von hochkonzentrierte gereinigte rekombinante Kindlin-3 bei 14,5 mg / ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Thermofluor-basierten Thermo Shift Assay für Screening-Puffer. Kindlin-3 wurde in verschiedenen Puffern, die eine zweidimensionale Schirm des pH gegen Natriumchlorid-Konzentration. Übergangstemperaturen (Temperatur Mittelpunkten) wurden durch Fluoreszenz des beobachtetenhydrophob gebunden Farbstoff, Sypro Orange (molekulare Sonden) und berechnete mit der Opticon Monitor-Software. (A) Eine 3D-Histogramm der Übergangstemperatur wird zusammen mit (B) die Änderung der Übergangstemperatur von der berechneten Durchschnitt von 50,4 ° C aufgetragen Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden die Stäbe nach dem Temperaturbereich, dem sie entsprechen gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Baculovirus Expressionssysteme werden immer beliebter, und ein wichtiges Instrument für die Produktion von Milligramm-Mengen von rekombinantem Protein für Protein-Charakterisierung mit biophysikalischen Studien, darunter Röntgen-Kristallographie. Trotz mehr experimentell anspruchsvolle die Baculovirus-Expressionssysteme bieten mehrere Vorteile gegenüber E. coli, von denen eine nahe der nativen Umgebung für Proteine ​​eukaryotischen Ursprungs zB Gegenwart geeigneter Chaperone und Chance für posttranslationale Modifikation. In unserer eigenen Bemühungen um Kindlin-3 exprimieren, wurden alternative Expressionswirte verwendet werden, einschließlich Säugetierzelllinien und bakterielle Expressionsstämmen (unveröffentlichte Beobachtungen). Im Allgemeinen ist die viele E. coli-Stämme getestet erzeugt sehr geringe Mengen an rekombinanten Kindlin-3 (~ 0,5 mg / l Kultur, unveröffentlichte Beobachtungen). Jedoch die Baculovirus-gesteuerte Expression in Insektenzellen besonders wirksam war und in Zusammenarbeitmparison um eine transiente Expression in Säugerzellen empfänglicher für die Erzeugung der großen Biomasse zur Isolierung eines rekombinanten Milligramm cytoplasmatischen Proteinen (unveröffentlichte Beobachtungen) erforderlich. Wir spekulieren, dass die Anwesenheit eukaryotischen Chaperonen kann die effiziente Produktion von Kindlin-3 zu ermöglichen.

Die Baculoviridae Insektenzellen zu infizieren, und die Expression des rekombinanten Proteins von Baculovirus in dieser Arbeit verwendet wird, auf dem Autographa californica-Kernpolyedervirus (AcNPV) basiert. In der Natur der AcNPV, die die Autographa californica (Alfalfa-Astschere) Insektenlarven infiziert, bedarf der Polyhedrinprotein zu Verschlüsse, wodurch die Vironen werden in einer kristallinen Proteinmatrix verkapselt somit die notwendige Schutz für ihre Freilassung zu bilden. In kultivierten Zellen die Bildung von Einschlusskörper nicht zur Replikation benötigt und ist daher entbehrlich. Im Fall der Fremdproteine ​​exprimieren, können die Polyhedrinprotein Gen rin einem rekombinanten AcNPV mit dem Gen für das Protein von Interesse eplaced. AcNPV können andere lepidopteron Arten infizieren und für die Zwecke der rekombinanten Expression Armee Protein Wurm Spodoptera frugiperda Puppeneierstock-Zellen verwendet werden. In der hier skizzierten Vorgehensweise wird die AcNPV Bacmid (BAC10) entwickelt, so dass ein wesentlicher viralen Gens, ORF1629 wird durch die Einfügung von Chloramphenicol-Acetyl-Transferase, was zu einem Knock-out-Bacmid (BAC10: KO ₁₆₂₉₎ inaktiviert, so dass es nicht Infektions baculovirions ²⁸ zu bilden. Cotransfektion von Sf9-Zellen mit linearisierter BAC10: KO ₁₆₂₉ und die FERMT3 enthaltenden Transfervektor Reparatur der inaktive ORF1629, durch Umsetzung, was in einer lebensfähigen Genoms, die auch die FERMT3 Gen unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors ²⁸ eingebaut wurde.

Wir beschreiben ein Reinigungsprotokoll für die Isolierung von hochreinem rekombinantem Maus Kindlin-3 über eine threE chromatographischen Schritt-Ansatz. Die hier verwendeten Methoden könnten leicht auf andere His-markierte Proteine ​​angewendet werden. Wir verwendeten ein Ionenaustauschschritt zur weiteren Reinigung Kindlin-3, aber wir glauben, dass dies eine weitere Pseudo-Affinitätsschritt als Kindlin-3 besitzt eine große Anzahl von basischen Resten, einschließlich einer Poly-Lysin Strecke innerhalb seiner F1-Domäne. Zusätzlich wird Kindlin-3 als zu binden und die Interaktion mit der zytoplasmatischen Seite des Plasmamembran, wo es wirkt, und daher sagen wir, daß die Clusterbildung von basischen Resten können das Protein an die negativ geladene Membran entgegenzuwirken.

Die in den Reinigungsprotokolle beschrieben Puffer sind als Standard und werden häufig in der Strukturbiologie eingesetzt. Der Thermofluor-Assay (Fig. 5) zeigt, dass Kindlin-3 ist in den meisten Pufferbedingungen oberhalb pH 6,0 stabil. Dies war besonders nützlich und wichtig für die Information unserer Experimente, wenn das Studium kinldin-3: β1Ein Schwanz Wechselwirkung durch NMR, die ausgezeichnete Spektren mit niedrigen Konzentrationen von NaCl ¹² ergab bei pH 6,1.

Bevor eine biophysikalische Studien durchgeführt werden kann, ist es wichtig zu zeigen, daß das gereinigte Protein von Interesse tatsächlich korrekt gefaltet und funktionell aktiv ist. In einer früheren Veröffentlichung haben wir gezeigt, dass das rekombinante Kindlin-3 exprimiert und gereinigt unter Verwendung dieses Verfahrens war ein Monomer und monodisperse in Lösung, wie durch Größenausschluß-Chromatographie, dynamische Lichtstreuung, analytische Ultrazentrifugation und Kleinwinkelröntgenstreuung untersucht und war auch binden kann, und in Anerkennung der Membran-distalen NPXY und Upstream Serin / Threonin-Cluster von β _1A zytoplasmatischen Schwanz ¹⁴ und bestätigt damit, dass es sich wie das native Protein, das im Einklang mit früheren zelluläre und physiologische Studien ^14,20,22 ist. Die Verwendung eines thermischen Stabilität Assay ist eine zusätzliche Möglichkeit vorzuschlagen the richtige Faltung eines Proteins von Interesse, wie falsch gefaltete Protein wird in einer hohen Fluoreszenzhintergrund aufgrund ausgesetzt hydrophobe Reste führen.

Die Kindlin Familie von Proteinen hat sich seit ihrer unerwarteten Rolle als wesentlicher Co-Aktivatoren der Integrine in vivo entdeckt wurde, im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Das hat viel Mühe, sie rekombinant exprimieren und zu lösen, ihre Strukturen ausgelöst. Bisher hat nur begrenzten Erfolg bei der Expression Milligramm-Mengen in voller Länge rekombinanten Proteins berichtet, aber wir haben hier beschrieben die Verwendung eines Baculovirus-System, das in großem Maßstab Ausdruck auf Ebenen, wo strukturelle Untersuchungen möglich werden lässt. Durch die Erzeugung von großen Mengen von rekombinantem Kindlin-3 erwarten wir, dass dies weitere Studien dieses Proteins unterstützen. Das für die rekombinante murine Kindlin-3 beschriebenen Baculovirus-Verfahrens angetriebenen und Reinigung Workflow kann auch verwendet werden, um die anderen Kindlin Isoformen exprimieren und zu reinigen,, Die ebenfalls schwer auszudrücken und besitzen auch Poly-Lysin erstreckt, und kann ferner für andere cytoplasmatischen Proteine, wie Nukleinsäure-bindende Proteine, die in bakteriellen Stämmen exprimieren, angepasst werden.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir danken Weixan Lu für die technische Unterstützung in der Kultur und die Wartung der Sf9-Aktien. LAY wurde von einem Medical Research Council (MRC) Diplom-Stipendium unterstützt. RJCG war eine Universität Royal Society Research Fellow. Die Oxford-Bereich Strukturbiologie ist Teil des Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome-Trust-Core-Award Grant Number 090532/Z/09/Z.