Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe zur Bekämpfung von humanpathogenen Arenaviren.

Die Entwicklung und Umsetzung von Arenavirus reversen Genetik stellt einen bedeutenden Durchbruch in der Arenavirus Feld ^4. Die Verwendung von zellbasierten Arenavirus Minigenom Systeme zusammen mit der Fähigkeit, rekombinante infektiöse Arenaviren mit vorgegebenen Mutationen in ihrem Genom erzeugen hat die Untersuchung der Beteiligung von viralen Faktoren zu den verschiedenen Stufen des Lebenszyklus Arenavirus sowie Virus-Wirt erleichtert Wechselwirkungen und Mechanismen der Pathogenese Arenavirus ^{1, 3, 11.} Darüber hinaus hat die Entwicklung von trisegmented Arenaviren die Verwendung der Arenavirus Genom zusätzliche fremde Gene von Interesse exprimieren gestattet und eröffnet damit die Möglichkeit, Arenavirus basierender Impfstoff Vektor Anwendungen ^5. Ebenso bietet die Entwicklung von Single-Cycle-infektiösen Arenaviren auszudrücken vermag Reportergene ein neues experimentelles Werkzeug, um die Sicherheit der Forschung mit highl verbesserny pathogenen menschlichen Arenaviren ^16. Die Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken bislang auf die Verwendung von Nagetier-Zelllinien ^7,19, die einige Hindernisse für die Entwicklung der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Impfstoff-oder Vakzinvektoren Posen verlassen. Um dieses Hindernis zu überwinden, beschreiben wir hier die effiziente Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen.

Arenaviren sind umhüllte Viren mit einem bisegmented negative RNA-Genom, dass ³ der Arenaviridae Familie gehören. Die Arenavirus Genom kodiert vier Proteine ​​in einer AmbiSense Mode aus zwei getrennten viralen Segmente ^3. Der große (L)-Segment kodiert für das RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L) und die kleine RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z), die als die wichtigste treibende Kraft der Virusknospung dient. Die kleinen (S)-Segment kodiert für das virale nucleoprotein (NP) und die Oberflächen-Glykoprotein (GP) (Abbildung 1).

Mehrere Mitglieder der Familie Arenaviridae sind verantwortlich für die tödlichen hämorrhagischen Fieber (HF) in Menschen ^3. Grundsätzlich Bedenken sind Lassa-Virus (LASV) und Junín Virus (JUNV), die bekanntlich hohe Mortalität bei hospitalisierten Patienten ^{8, 9} verursachen. Obwohl diese Viren sind endemisch in Westafrika und ländlichen Argentinien, bzw.mehren sich die Bedenken der Einfuhr von LASV und JUNV zu nicht-endemischen Gebieten aufgrund der erhöhten Reise ^10. Dazu kommt, obwohl in der Regel nicht mit einer schweren Krankheit in den Menschen verbunden sind, wird die prototypische Arenavirus lymphatischer Choriomeningitisvirus (LCMV) einen vernachlässigten Erreger gilt als es Fälle von tödlichen Infektionen bei immungeschwächten Patienten ^{6, 15} und ist verantwortlich für angeborene Missbildungen und Fehlgeburten bei schwangeren Frauen ^{2, 13.} Derzeit gibt es keine FDA-zugelassenen Impfstoffe gegen Arenaviren und Behandlung der Nukleosid-Analogon Ribavirin, die nur teilweise wirksam ist und oft mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ist, begrenzt.

Die Einführung von Plasmid-basierte reverse genetics ⁴ und Erzeugung rekombinanter Arenaviren ^{7, 19} haben stark auf dem Gebiet der Forschung Arenavirus fortgeschritten. Derzeit werden Nagerzellen (wie BHK-21) für die Gener verwendetation von rekombinanten Arenaviren aufgrund der artspezifischen murine RNA-Polymerase I (pol-I) Promotor, der die anfängliche Transkription der S-und L-Segmente. Allerdings Virus Rettung in BHK-21-Zellen sind keine anerkannte Methode zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine Saatgut Kandidaten. Hier dokumentieren wir die Verwendung des menschlichen pol-I-Promotor für eine effiziente Rettung des prototypischen Alten Welt (OW) LCMV und der Neuen Welt (NW) JUNV Candid # 1-Stamm in Vero-Zellen. Mit einer ähnlichen Methode erzielten wir rekombinantes trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) Arenaviren, die zwei zusätzliche fremde Gene in zwei verschiedene S RNA Segmente ⁵ codiert enthalten. Dieses neue System nicht nur folgt eine hohe Reproduzierbarkeit und einfache Protokoll, sondern sofort in der Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine oder Impfvektor Samen eingeführt werden.

1. Arenavirus Rettung Transfektion

Unsere Rettungssystem auf der Verwendung beider Polymerase II-Protein-Expressionsplasmide Codieren des Nucleoprotein (NP) und RNA-abhängige RNA-Polymerase-(L), die viralen trans-wirkende Faktoren für die RNA-Replikation und Genexpression des Arenavirus Genoms erforderlich basierend ^{7, 19,} und in der Lage, Plasmide intrazellulären Synthese über die zelluläre RNA-Polymerase I (Pol-I), der S-und L-Antigenom RNA-Spezies ⁷ leiten. In unseren Untersuchungen verwenden wir die pCAGGS Proteinexpression Plasmid, das das Huhn β-Actin-Promotor und polyadenylanation (pA) Signalsequenzen verwendet, und die menschliche pol-I-Plasmid, die den menschlichen Polymerase I verwendet Promotor und Terminator-Sequenzen der Maus (Abbildung 2) . Die S-und L-RNA-Segmente in das HPOL-I-Plasmid in einer antigenomische Orientierung für die Erzeugung von genomischer RNA-Segmente bei der Transkription von HPOL-I lassen kloniert. Für die Rettung von Wildtyp-type rekombinanten LCMV (rLCMV) und offenen # 1 (rCandid # 1) der pCAGGS NP und L von jedem Virus zusammen mit ihren jeweiligen menschlichen Pol-I S und L RNA-Segmente (3) co-transfiziert. Erzeugung von rekombinantem trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) folgte ein ähnliches Protokoll, aber die S-Segment wurde in zwei verschiedenen pol-I S Plasmide, die jeweils für ein unverwechselbares Reportergen aufgeteilt: in eine, die NP open reading Frame (ORF) wurde mit dem Green Fluorescent Protein (GFP)-Reportergen (HPOL-I S GFP / GP) und in der anderen, die virale Glycoprotein Vorstufe (GPC) ORF mit dem Gaussia Luciferase (Gluc) Reporter-Gen ersetzt ist (HPOL-I S NP / Gluc). Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 4 dargestellt. Die folgende Transfektion und Infektion Protokoll wurde für 6-well-Platten aufgebaut.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) Mischung: Bereiten Sie 250 ul OptiMEM Medien und jeauf das Virus zu retten, 10 - 12 ug LPF2000 (1 ug / ul) pro Transfektion (Tabelle 1). Ein Verhältnis von 2,5 ug LPF2000 pro ug DNA wird empfohlen. Inkubation für 5 - 10 min bei RT. Unterdessen bereiten die Plasmidtransfektion Mischung in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchens (Schritt 1.2).
2. Plasmid-DNA Transfektion Mischung: Bereiten Sie die Plasmidtransfektion Cocktail in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit den empfohlenen Mengen für jeden Virus Rettung (siehe Tabelle 1). Bringen Sie das Endvolumen auf 50 ul mit OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung: In 250 ul der OptiMEM-LPF2000 Mischung (Schritt 1.1) in das Plasmid DNA Transfektion Mischung (Schritt 1.2). Inkubieren dieser Mischung für 20 - 30 min bei RT. Unterdessen bereiten und zählen 1 x 10 ⁶ Zellen pro Vero Transfektionsreaktion. Vero-Zellen in Suspension transfiziert werden.
4. Vorbereitung von Vero-Zellen: Vero cells werden in 100 mm Schalen kultiviert. Vor dem Start bringen 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS Medien und Trypsin-EDTA Gemisch auf 37 ° C.
   1. Waschen der Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS.
   2. Trypsinize Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen getrennt werden (ca. 5 min). Antippen vielleicht erforderlich, um vollständig lösen die Zellen von den Gerichten.
   3. Vorsichtig die Zellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen.
   4. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 1000 rpm in einer Zentrifuge.
   5. Resuspendieren der Zellen in 10 ml DMEM-10% FBS 1% PS und Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und stellen Konzentration auf 1 x 10 ⁶ Zellen / ml. Es wurde festgestellt, daß 0,5 - 1 x 10 ⁶ Vero Zellen pro Transfektion wurden die besten Ergebnisse erzielt.
5. Mix LPF2000/DNA und Zellen: Nach 20 - 30 min Inkubation bei Raumtemperatur (Schritt 1.3), 1 ml von Vero-Zellen (1 x 10 ⁶⁾ (Schritt 1.4) zudie OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
6. Seed LPF2000/DNA-cell Mischung in 6-well-Platten: Fügen Sie die DNA-LPF2000-Vero Mischung (Schritt 1.5) in die Vertiefungen der 6-Well-Platte. Schütteln Sie die 6-well-Platte und lassen Sie die Transfektion Inkubation über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2.
7. Ändern Transfektionsmedium: Etwa 16 - 24 h nach der Transfektion, entfernen Sie die Transfektion Medien, 2 ml Infektion Medien und Inkubation transfizierter Zellen für eine zusätzliche 48 Stunden.
8. Zellpassage: Nach 48 Stunden Inkubation in Medien Infektion, entfernen Sie die Gewebekulturüberstand (TCS) und passieren die transfizierten Zellen in einer 100 mm-Schale. Der TCS selten enthält infektiösen Virus, weil die transfizierten Zellen zusätzliche Inkubation müssen Viruspartikel zu generieren. Für die Zellpassage:
   1. Waschen der Zellen zweimal mit 2 ml 1x PBS.
   2. Trypsinize Zellen w it 0,5 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen lösen.
   3. Die Zellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 1,5-ml-Röhrchen.
   4. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 5000 rpm, 4 ° C in einer Mikrozentrifuge.
   5. Vorsichtig werden die Zellen in 1 ml einer Infektion Medien und die Übertragung der Zellen in einer 100 mm-Schale. Um das Gesamtvolumen in der Platte, mit infektiösen Medien bis 8 ml, ein ausreichendes Volumen, um die Trocknung der Zellen, sowie zum Konzentrieren des Virus zu verhindern.
9. Schütteln Sie die 100 mm-Schale und setzen die Inkubation von Vero-Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 72 Stunden.
10. Sammlung von TCS: Nach 72-stündiger Inkubation, sammeln die TCS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 2500 rpm in einer Zentrifuge. Infektiöse Arenavirus im TCS gefunden wird, so von der Zelltrümmer Pellet Entfernung und Speicherung des TCS bei -80 ° C.

Nachweis einer erfolgreichen Rettung von rLCMV und rCandid # 1 ist über dem Schwerpunkt bildende Einheit (FFU) Immunofluoreszenz-Assay (IFA) erreicht. Für Wildtyp-Virus Rettung verwenden wir spezifische Antikörper gegen das virale NP. Die r3LCMV und r3Candid Nr. 1 kodieren zwei Reportergene (GFP und Gluc), so dass virale Detektion und Titration ohne die Notwendigkeit von Antikörpern durch Fluoreszenzmikroskopie (GFP) und / oder Lumineszenz (Gluc).

1. Bestätigen Wildtyp rekombinanten Arenavirus Rettung: Der Tag vor der Titration, waschen Vero-Zellen zweimal mit PBS, trypsinize und bereiten 96-Well-Platten bis 80 zu erreichen - 90% Zusammenfluss nächsten Tag (4 x 10 ⁴ Zellen / well). Schütteln Sie die Platten von Hand auf einen uniformierten Verteilung der Zellen zu erhalten. Kultur die Zellen über Nacht in der 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor mit der Infektion:
   1. Serienmäßig verdünnen (10 fache Verdünnungen) das Virus enthaltenden TCS erholte sich von den transfizierten Zellen in der 100-mm-Schale (Schritt 1.10) in OptiMEM.
   2. Entfernen Sie das Medium aus den gesäten Vero-Zellen, zweimal waschen mit 50 ul 1x PBS und infizieren Zellen mit 50 ul der seriell verdünnten Virus (Schritt 2.1). Infect Zellen für 1,5 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
   3. Nach der Infektion, entfernen Sie die Virusinokulum, fügen Sie 100 ul Infektion Medien / well und Inkubation der Zellen für 16 - 18 Stunden. Viral Re-Infektion kann nach 18-stündiger Inkubation führen, was in Überschätzung der viralen Titer führen.
   4. Bei 16 - 18 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie den TCS aus jeder Vertiefung und fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd in 1x PBS verdünnt, für 15 min bei RT.
   5. Dann entfernen Sie den Fixierungslösung und permeabilisieren die Zellen mit 0,1% Triton X-100 verdünnt in 1x PBS, für 10 min bei Raumtemperatur.
   6. Saugen Sie die Permeabilisierung Lösung, dann waschen Sie die Zellen 3 mal with 1x PBS.
   7. Blockieren der Zellen mit 2,5% Rinderserum Albumin (BSA) in 1x PBS (Blockierungslösung) für 1 h bei RT. Alternativ können die Zellen über Nacht bei 4 ° C blockiert und weiterhin mit Antikörper-Inkubation des folgenden Tages.
   8. Inzwischen bereitet die primären Antikörper. Verdünnen Sie die LCMV-und Candid # 1-spezifischen primären Antikörper in Blocking-Lösung und dann zentrifugiert den Antikörper / Blocking-Lösung für 15 min bei 3.500 Umdrehungen pro Minute. Der monoklonale anti-LCMV NP Antikörperklon 1.1.3 (1:30 Verdünnung) ¹⁶ und der monoklonale anti-NP JUNV Antikörper SA02-BG12 von BEI Ressourcen (1:500 Verdünnung) können für den Nachweis von rLCMV und rCandid Nr. 1 verwendet werden sind.
   9. Nach einer 1-stündigen Inkubation absaugen Blocking-Lösung und 50 ul des primären Antikörpers an die Zellen und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C.
   10. Zu diesem Zeitpunkt verdünnen sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, und dann zentrifugiert, die den Antikörper / Blockieren Lösung für 15 min bei 3.500 UpM. Das Polyklonalen Kaninchen-anti-Maus-IgG-FITC sekundären Antikörper für den Nachweis von primären monoklonalen Antikörper wurde verwendet, um Bilder in 5 beobachtet erhalten.
   11. Nach 1 Stunde Inkubation absaugen primärer Antikörper, 3 x waschen mit 1x PBS, und fügen Sie die sekundären Antikörper für 30 min bei 37 ° C
   12. Nach 30 min Inkubation absaugen sekundären Antikörper und waschen 3 mal mit 1x PBS. Die Zellen sind nun bereit, beobachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie sowohl bestimmen den Erfolg von viralen Rettung und Titration durch Zählen der Schwerpunkt bildende Einheiten pro ml (FFU / ml).
2. r3LCMV und r3Candid Nr. 1 virale Rettung: Da diese Viren zwei Reporter Gene exprimieren, rettet ihr kann durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, um die GFP-Expression oder Gluc Ausdruck in TCS erkennen. Rettung kann auch durch die Expression von Gluc werden in TCS bestätigt. Um die trisegmented Viren titrieren, wir Schritte 2.1 bis 2.1.4 folgen, jedoch Zellen nicht zu b brauchene befestigt, um eine erfolgreiche virale Rettung, weil der GFP-Expression zu bestimmen. Die Titration des Virus wird durch Zählen der FFU / ml bestimmt werden. Um eine erfolgreiche virale Rettung durch Gluc Ausdruck, Gluc Ausdruck von TCS bestimmen kann unter Verwendung eines Gluc Assay-Kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay Kit, New England Biolabs) werden. Zu diesem Zweck:
   1. Je 100 ul TCS in eine 96-Well-Platte, weiß (Flat Mikrotiterplatten, Fisher Scientific).
   2. Richten Sie das Luminometer (LumiCount, Packard Biosciences).
   3. In 50 - 100 ul Gluc Assay-Lösung (wie vom Hersteller empfohlen) zu jeder Probe und messen Sie die Gluc Reporter Genexpression mit dem Luminometer. Als Negativ-Kontrolle wurde Gluc Ausdruck des TCS von den Wildtyp-Viren infizierten Zellen gemessen.

3. Passage von Gewebekulturüberstände

Viral Rettung hängt Transfektionseffizienzen. Vero-Zellen wurde gezeigt,zu niedrigeren Transfektionseffizienzen als andere Zelllinien ¹⁴ haben. Wenn Virustiter in der TCS niedrig sind, infizieren frisch Vero-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (LCMV) bzw. 0,1 (Candid # 1) für 72 Stunden, um das Virus zu verstärken.

Erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mit IFA (Fig. 5) bestätigt werden. Im Falle von rekombinanten Viren trisegmented können erfolgreiche virale Rettung durch Beobachtung GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (6A) beurteilt werden. Erfolgreiche Rettung wird weiter durch die Beurteilung Gluc Ausdruck (6B) bestätigt werden. Repräsentative Ergebnisse, welche die erfolgreiche Rettung von Wildtyp-und trisegmented Arenavirus wurden unter Verwendung der oben angegebenen Protokoll.

Abbildung 1. Arenavirus Genomorganisation und Virionstruktur. Arenaviren umhüllt sind, Negativ-RNA-Viren mit bisegmented Genome ^3. Jedes Segments ein AmbiSense Codierungsstrategie, um die Synthese von zwei viralen protei lenkenns ³ in entgegengesetzter Orientierung. Die Large (L)-Segment (7.2 kb) codiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase-(L) und die kleine RING-Finger-Protein (Z), die Matrix-ähnliche Funktionen wie die Leitung der Knospungsvorgang ³ aufweist. Der Small (S)-Segment (3,5 kb) kodiert für das Glykoprotein Vorstufe (GPC) und die nucleoprotein (NP). GPC posttranslational verarbeitet GP-1 und GP-2, die den Glycoprotein-Komplex (GP), die Spitzen an der Oberfläche des Virions Struktur für Rezeptor-Erkennung und Eintritt in die Zelle ^{17, 18} bilden assoziieren erzeugen. NP encapsidates die virale RNA (vRNA)-Genom und zusammen mit dem L-Protein bilden die virale Ribonukleoproteine ​​(vRNPs), die die minimalen Komponenten für die virale Replikation und Transkription ¹² sind. IGR: Zwischengenregion.

Abbildung 2. Arenavirus rescue Plasmide. Schematische Darstellung der Plasmide zur Erzeugung von rekombinanten Arenavirus in Vero-Zellen verwendet. Proteinexpression pCAGGS Plasmid verwendet das Huhn β-Actin-Promotor und dem Kaninchen β-Globin-Polyadenylierungssignal (pA) Signalsequenzen, die Synthese von viralen und L NP ^{4, 7} zu leiten. CMV-IE-Enhancer: Cytomegalovirus Immediate Early-Enhancer. Intron: chicken β-Actin-Intron-Sequenz. Die HPOL-I Plasmide verwendet den menschlichen Polymerase I-Promotor und Terminator-Sequenzen der Maus-Polymerase die Synthese der viralen RNA-Segmente zu leiten. Beide pCAGGS und HPOL-I Plasmide sind Ampicillin-resistente (Ampr).

Abbildung 3. . Wildtyp-und trisegmented Arenavirus rettung schwarzes Oval sind die Plasmide für die Erzeugung des rekombinanten Wildtyp-Arenavirus erforderlich: pCAGGS NP und L, und HPOL-I S und L. NP und L sind erforderlichd, um virale Transkription und Replikation zu initiieren. Die HPOL-I S und L direkte intrazelluläre Synthese über pol-I, S und L antigenomische RNA-Spezies. In dem roten oval sind die Plasmide für die Erzeugung von trisegmented Arenaviren erforderlich: pCAGGS NP und L, sowie die HPOL-I l Plasmid, das sind die gleichen wie die für Wildtyp-Arenavirus Rettung beschrieben. Die HPOL-I S wird in zwei getrennten Plasmiden: in einem Plasmid, NP mit GFP (HPOL-I S GFP / GP) ersetzt und in der anderen Plasmid, das GP von Gluc Gen (HPOL-I S NP / Gluc ersetzt ).

Abbildung 4. Arenavirus Rettungs-Protokoll. Arenavirus Rettung wird in Vero-Zellen unter Verwendung einer Platte mit 6 Vertiefungen-Format. Kurz gesagt, werden Vero-Zellen in Suspension an Tag 1 mit Lipofectamine 2000 transfiziert. Bei 24 Stunden nach der Transfektion wird das Medium mit frischem infektiösen Medien ersetzt. Transfizierte Zellen werden inkubiert eine zusätzliche 48 h und dann skaliert-up in einen 100-mm-Schalen (Tag 4). Vero-Zellen in den 100 mm Gerichte werden für eine zusätzliche 72 Stunden inkubiert. Am Tag 7 nach Transfektion TCS sind für die virale Erkennung entweder durch IFA (rLCMV und rCandid # 1) oder Fluoreszenz-Mikroskopie (r3LCMV und r3Candid # 1) nach der Infektion in Vero-Zellen frisch gesammelt. Wenn die virale Titer niedriger als erwartet sind, können verwendet werden, um frische TCS Vero-Zellen zu infizieren, um das Virus zu verstärken.

Abbildung 5. Bestätigung einer erfolgreichen viraler Wildtyp-Rettung. TCS von Zelle Durchgang (100 mm Geschirr) werden verwendet, um frische Vero-Zellen in 96-Well-Platten zu infizieren. Bei 24 Stunden nach der Infektion werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und blockiert, bevor Färbung mit LCMV-oder Ehrliche # 1-spezifischen Antikörpern. Vorhandensein von viralen Antigenen beobachtet mittels Fluoreszenzmikroskopie. Maßstab Bars, 100 um.

Tabelle 1. Lipofectamine / Plasmid-DNA-Konzentration für Arenavirus Rettung. Empfohlene DNA und LPF2000 Konzentrationen zur Erzeugung von rekombinanten wild-Art und trisegmented Arenaviren in Vero-Zellen sind angegeben.

Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken hat sich zu einem weit verbreiteten Ansatz zur Untersuchung der vielen verschiedenen Facetten der Arenavirus Biologie. Hier dokumentieren wir eine entscheidende Verbesserung des derzeitigen Systems durch Ausführen Arenavirus rettet in Vero-Zellen, so dass für das Potenzial Generation von FDA-zugelassenen Impfstoff-Kandidaten gegen Arenaviren und Vakzinvektoren gegen andere Infektionskrankheiten.

Die experimentellen Verfahren beteiligt sind in der Regel gut etabliert und sollte nicht vor erhebliche Hürden. Es gibt jedoch mehrere Faktoren, die sorgfältig überwacht werden, um einen dauerhaften Erfolg gewährleisten sollte. Richtige Wartung von Vero-Zellen ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Rettung. Darüber hinaus ist es zwingend notwendig, um gute Plasmidpräparationen müssen rekombinanten Arenavirus (siehe Protokoll für die richtige Zelle Wartung und Plasmid-Präparation) zu erzeugen. Für die Rettung von rLCMV und rCandid # 1 Wildtyp oder ihre trisegmented Versionen es drei unabhängigen Transfektionen für jedes rekombinante Virus wird empfohlen, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Rettung zu erhöhen, als Vero-Zellen nicht leicht ¹⁴ transfiziert. Wenn mehr als ein rekombinantes Virus Rettung versucht wird, skaliert die folgenden Schritte entsprechend zu der Anzahl von Viren befreit werden. Als negative Kontrolle, sind wir eine Transfektion in Abwesenheit pCAGGS NP (-pCAGGS NP).

Seit LCMV-und Candid # 1-infizierten Zellen nicht angezeigt klassischen cytopathischen Effekt (CPE), erfolgreiche virale Rettung von Wildtyp-und rLCMV rCandid # 1-Viren muss durch den Nachweis von infektiösen Nachkommen, die getan werden könnte beurteilt werden unter Verwendung eines klassischen Plaque-Assay oder über IFA. Wir empfehlen die Verwendung der IFA über die klassische Plaque-Test, weil der ehemalige innerhalb von 24 Stunden statt der 5 abgeschlossen werden kann - 6 Tage für die Entwicklung von Plaques erforderlich. Die r3LCMV oder r3Candid Nr. 1 gerettet kodieren zwei Reportergene (GFP und Gluc), so dass virale Detektion und Titration ohne die Notwendigkeit von Antikörpern durch Fluoreszenzmikroskopie (GFP) und / oder Lumineszenz (Gluc). Wie bei der Rettung von rekombinantem LCMV und Candid # 1 Wildtyp-Rettung wird ein erfolgloser trisegmented Virus Rettung in der mangelnden fluoreszierenden Vero-Zellen nach Impfung mit TCS aus transfizierten Zellen führen.

Da die S und L Segmente vom menschlichen polyermase I-Promotor angetrieben werden, kann dies Rettungssystem in anderen humanen Zellen eingesetzt werden. In der Tat haben wir auch erfolgreich sowohl rekombinante Wildtyp und trisegmented rLCMV und rCandid Nr. 1 Viren in 293T menschlichen embryonalen Nierenzellen mit hohem Wirkungsgrad erzeugt. Zusätzlich Transfektion in Zellmonoschichten auch zu Virus Rettung, wenn auch nicht so hoch wie bei der Transfektion von 293T-und Vero-Zellen in Suspension. In Bezug auf den Nachweis von Wildtyp-und LCMV Candid # 1 virale Rettung könnte Primärantikörper gegen andere virale Proteine ​​verwendet werden. In derbei der R3 Viren, könnten wir Gluc durch Lumineszenz anstelle der GFP-Expression nachzuweisen. Alternativ können andere Reportergene anstelle Gluc und GFP ⁵ verwendet werden.

Unsere Virus Rettungssystem hat sich als sehr leistungsfähig in unseren Händen, und hier bieten wir die besten Transfektionsbedingungen. Es wird dringend empfohlen, die angegebenen Mengen von Plasmiden verwenden. Wenn Virus Rettung in anderen menschlichen Zelllinien, die Menge von Zellen, DNA und / oder LPF2000 durchgeführt wird sollte getestet werden.

Die Erzeugung von Wildtyp-und trisegmented Arenavirus Verwendung von Plasmid-basierte reverse genetics in Vero-Zellen werden für das Studium mehrere Aspekte der Biologie von Arenavirus sowie für die künftige Entwicklung von FDA-zugelassenen Impfstoffe und Impfstoff-Vektoren zu ermöglichen.

Wir danken Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in JCT und LM-S Laboratorien für die Entwicklung und Verbesserung der Arenavirus reversen Genetik Techniken und Plasmide. Wir danken auch Snezhana Dimitrova für technische Unterstützung. Der monoklonale Antikörper, der gegen JUNV NP (SA02-BG12) wurde von BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infektionen Research Resources Repository) erhalten. BYHC wurde von Grant Number GM068411 von Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award unterstützt. EO-R ist ein Fulbright-Conicyt (BIO 2008) und eine Rochester Vaccine Fellowship (2012) Empfänger. EO-R aktuellen Unterstützung wird durch ein Postdoc-Fellowship für Diversity & Academic Excellence-vom Amt für Faculty Development & Diversity an der Universität von Rochester zur Verfügung gestellt. Research in LM-S Labor wird durch die NIH Zuschüsse RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, die NIAID Centers of Excellence für Forschung und Influenza Surveillance (HHSN266200700008C) finanziert undDie University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).

Forschung an JCT Labor wurde durch Zuschüsse RO1 AI047140, RO1 AI077719 und RO1 AI079665 von NIH unterstützt.