可扩展的生物制造工作流程，用于生产和分离基于自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡癌症生物治疗药物

我们的研究重点是由一种免疫细胞产生的小囊泡，这些小囊泡天然可有效杀死癌细胞。这些囊泡在治疗原发性和继发性部位（如大脑）的实体瘤方面具有广阔的治疗潜力。在本研究中，我们使用双峰树脂通过尺寸排阻色谱分离囊泡，通过物理分离囊泡与污染物来最大限度地提高产品纯度，同时通过静电力进一步将污染物捕获在树脂内。

然后，我们在使用前对囊泡进行消毒、浓缩和缓冲交换本视频中的生物制造工作流程使用临床相关条件，并且可以根据成本进行扩展，从而有效地生产大量高纯度细胞外囊泡。这使得学术实验室能够使用该技术，自信地投入资源，通过可靠的生产和分离过程研究此类疗法。我们目前正在研究这些囊泡和临床前模型的治疗潜力，并进一步加强我们对它们工作原理的理解。

首先，根据制造商的说明进行快速蛋白质液相色谱系统启动。使用滴滴法进行连接，以确保塔内没有空气引入。使用适当的收集管设置馏分收集器以收集样品。

将分馏设置更改为所需的收集体积。从 80 摄氏度冰箱中取出 40 至 80 毫升先前制备的细胞外囊泡或富含 EV 的条件培养基，并在 37 摄氏度下快速解冻。将样品在 4 摄氏度下以 10， 000 G 离心 30 分钟，然后将上清液转移到新试管中。

为了降低双链 DNA 水平，用 5 毫摩尔氯化镁和 50 单位/毫升核酸内切酶处理富含 EV 的条件培养基。将样品在 37 摄氏度下孵育 2 至 4 小时，并适度混合。层析系统准备就绪后，将富含 EV 的调节培养基装入 60 毫升注射器中，并将其连接到样品管线。

单击 Manual Run 启动系统并将流速设置为零。按照软件提示抢先保存运行。然后单击 Start。

选择 Line Beat 双滤 PBS，以每分钟 2 mL 的流速运行，确保溶液流经色谱柱。吸收剂稳定后，按 Auto Zero UV。更改流路，将样品引导至色谱柱前的废液瓶。5 到 20 秒后，将样品对准色谱柱。

当 UV 读数达到大约 230 毫吸光度单位时，单击 Fractionation（分馏）。样品完全进样后，将缓冲系统切换到双滤 PBS 以继续纯化。当 UV 值达到大约 1， 600 毫吸光度单位时，再次单击 Fractionation（分馏）。

运行停止后，将色谱图另存为 PDF 文档。用 20 至 30 毫升 90% 乙醇冲洗超滤仪的每个组件。以 4， 000 G 离心 5 到 10 分钟，然后丢弃流出物。

然后用无菌 PBS 进行冲洗以平衡设备并像以前一样重复离心步骤。混合所有稀释的 NK-EV 组分。为了最大限度地提高无菌性，使用 0.22 微米针式过滤器过滤稀释的 NK-EV 溶液，用双重过滤的 PBS 预湿。

将滤液收集到灭菌的浓缩装置中。将滤液以 4， 000 G 离心 15 至 40 分钟。旋转后，使用血清移液管在顶部过滤室内混合溶液。

再次以 4， 000 G 离心 10 分钟。倒置过滤装置并将其连接到收集装置以收集 NK-EV。将 NK-EV 以 2， 000 G 离心 2 分钟，然后将纯化产物转移到无菌管中。

根据制造商的说明启动纳米粒子跟踪分析系统。观察流通池是否有气泡。如果存在气泡，请用 20% 乙醇和双重过滤水冲洗流通池以将其去除。

清除后，小心地将激光模块重新插入纳米粒子跟踪分析仪器中。关上门，然后单击 Start Camera。将捕捉设置更改为 2 的屏幕增益和 14 的摄像机级别。

打开加热器以稳定流通池的温度。单击 Standard Measurement（标准测量）在 SOP 选项卡下创建一个脚本，用于在 23 摄氏度下以 30 的流速在一分钟内收集一次捕获。将文件夹和文件名添加到路径名称中以保存数据。

涡旋纯化的 NK-EV 产物，并使用双过滤 PBS 制备其稀释液。涡旋稀释的样品后，将其加载到 1 mL 采集注射器中，不要引入气泡。小心地将注射器连接到仪器加载线。

缓慢推动一半的样品，在注射器中留下大约 0.5 毫升。一旦粒子在屏幕上可见，聚焦相机以在每个粒子周围最多有一个光晕，在"硬件"选项卡下，单击"注入"并将速率设置为 1， 000，持续五秒钟。然后将速率降低到 30。

按 Run Script。确保设置正确后，单击 有 并按照软件提示进行作。完成捕获后，单击 取消 当软件要求处理或导出文件时。

每次稀释记录 5 次捕获后，导入所有 5 次捕获进行分析。突出显示文件，然后单击 Process Selected Files（处理所选文件）。在 Process 选项卡下，将分析设置调整为 Screen Gain （屏幕增益） 为 2，检测阈值为 15。

检查并单击 OK 进行分析。处理后，单击 Yes （是） 而不单击其他框，或单击 Export 导出文件。纯化的 NK-EV 粒径范围为 76.30 至 174.30 纳米，平均浓度为 1.39 乘以 10 至每毫升 12 EV 的幂。

此外，荧光计定量显示蛋白质浓度约为 300 毫克/毫升，双链 DNA 浓度为 225 毫克/毫升。用 NK-EV 处理人 K562 白血病细胞显示细胞活力呈剂量依赖性降低，EC 50 为 9.33 乘以 10，是每毫升 9 个 EV 的幂。