使用纤连蛋白粘附和迁移测定分离软骨细胞和软骨生成器

在软骨组织工程和再生医学领域，在改进正在进行的治疗和开发新的治疗策略方面，仍然需要提高生物学和功能结果。目前的临床前研究指出，软骨衍生的软骨形成剂可能被用作软骨愈合的可行选择。目前的研究包括通过使用额外的生长因子和基因重组技术进一步增强软骨形成潜力，同时保持较低的肥厚效力的策略。

软骨遗传学面临实验挑战，包括对命名法缺乏共识、不同的分离技术、表征困难、培养条件的可变性以及对潜在机制的理解有限。临床证明，与常用细胞相比，软骨形成器产生积极的结果可以显着减轻与软骨相关病理相关的整体负担。使用无细胞替代品（例如源自祖细胞的细胞外囊泡）的改进疗法的进化，并使用重组策略再生真正的透明样软骨。

首先，在无菌条件下，在 1X PBS 中从人类供体那里获得胫股关节或膝关节，然后将收获的关节转移到引擎盖中的无菌底垫上。为了稳定关节，请握住软骨下骨，软骨朝上。使用 22 号手术刀刀片，从非承重区域收获矩形软骨屑。

将软骨从浅层到深层切成 8 毫米 x 10 毫米的切片。用 PBS 洗涤切片后，将它们放入含有 1 至 2 毫升普通 Dulbecco 改性 Eagle 培养基或 DMEM 的培养皿中。接下来，使用 22 号手术刀刀片，将软骨片切成小于 1 毫米立方的大小。

首先，从提取的人类膝关节中获取切碎的软骨。将切碎的软骨放入装有 10 毫升无血清 DMEM/F-12 和 0.15% II 型胶原酶的直立式 T25 培养瓶中，用于酶消化。将培养瓶置于二氧化碳培养箱中 12 至 14 小时，不受干扰。

过夜消化后，将含有释放的软骨细胞的培养基转移到新鲜的无菌离心管中。使用细胞过滤器将细胞与碎片分离。添加等体积的 DMEM/F-12 和 10% 胎牛血清或 FBS。

将过滤后的细胞在 37 °C 下以 1， 200 G 离心 5 分钟。弃去上清液后，在 1 毫升培养基中复溶沉淀。使用台盼蓝排除测定法对活细胞进行计数。

接下来，将软骨细胞以每平方厘米 10， 000 个细胞的浓度加载到 T25 培养瓶中。使用含有 10% FBS 的 DMEM/F-12 将细胞扩增至所需的传代次数。在亚汇合处使用含有 EDTA 的 0.125% 胰蛋白酶收获细胞之前，每三天刷新一次培养基。

软骨细胞在加载后立即粘附，并随着它们的扩张从圆形鹅卵石形状转变为成纤维细胞外观。首先，从提取的人类胫股关节或膝关节中获取软骨屑。将软骨屑进行连续的过夜酶消化，首先使用 0.2% 链霉蛋白酶 3 小时，然后在保持 37 摄氏度的摇动水浴中使用 0.04% II 型胶原酶 12 小时。

然后，用 1.5 毫升 PBS 纤连蛋白溶液包被所需数量的六孔板。将板密封，并在 4 摄氏度下冷藏过夜。第二天，从冰箱中取出纤连蛋白包被的六孔板。

去除多余的纤连蛋白后，向包被孔中加入 2 至 3 毫升普通 DMEM/F-12 培养基。将释放的软骨细胞以每孔 4， 000 个细胞的密度接种到包被的孔上，并保持板 20 分钟不受干扰。孵育后，吸出多余的培养基和非贴壁细胞。

向孔中加入 2 至 3 毫升含 10% 胎牛血清的 DMEM/F-12。将贴壁细胞在标准培养条件下维持 10 至 12 天，以获得软骨形成祖细胞或 CPC 克隆，然后使用 0.125% 胰蛋白酶 EDTA 分离 CPC 克隆 180 秒，然后以每 5 平方厘米一个克隆的比例重放。将富集的多克隆 CPC 扩增至所需的汇合度。

经受纤连蛋白粘附测定的软骨细胞显示克隆生长，到第 10 天达到 5 个种群倍增。首先，在补充的 DMEM/F-12 培养基中从收获的关节关节获得剃光的软骨外植体。将带有外植体的板放入 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 48 小时。

两天后，将外植体转移到含有 10 毫升 0.1% 胶原酶溶液的离心管中，用于酶消化。将试管在 37 摄氏度下孵育 2 小时。消化后，用 1X PBS 冲洗外植体，并将它们放回含有新鲜补充的 DMEM/F-12 培养基的板中的相同孔中。

在标准培养条件下将板保持在培养箱中，并在随后几天监测软骨形成细胞的迁移。一旦外植体达到亚汇合，使用 0.125% 胰蛋白酶 EDTA 溶液收获间充质软骨形成细胞或 MCP。使用补充的 DMEM/F-12 培养基扩增 MCP。

在培养的第 10 天，软骨形成器开始从外植体的边缘迁移，表现出纺锤形生长模式并进一步扩展。