在重力和自制微型生物反应器下使用低粘附条件从各种软骨细胞生成球状体

慢性关节病中的软骨修复需要先进的基于细胞的疗法来有效地再生受损组织。该方案提供了一种将诱导多能干细胞分化为基于软骨细胞的球体的分步方法，支持组织工程和细胞治疗应用。慢性关节病中的软骨修复需要先进的基于细胞的疗法来充分再生受损组织。

该方案提供了一种将诱导多能干细胞分化为基于软骨细胞的球体的分步方法，支持组织工程和细胞治疗应用。主要挑战是最大限度地减少 iPSC 衍生细胞中的 1 型胶原蛋白表达以防止纤维软骨，为成熟的高线软骨形成创造条件，改进球状体稳定性的 3D 培养方法，以及开发生产临床体积细胞材料的可扩展方法。该方案通过使用 iPSC 作为软骨细胞的替代来源提供了优势，无需侵入性程序即可进行可扩展生产。

它确保通过 3D 培养更好地维持软骨细胞表型，并模拟自然软骨发育，使细胞与天然软骨细胞非常相似，软骨特异性标志物表达高。开发有效的方法来增强 iPSC 衍生的软骨细胞成熟度和功能，确保体内的长期稳定性，创建纤维化三维培养材料，并开发用于临床应用的细胞材料的可扩展生产。首先，在设置为 121 摄氏度、每平方英寸 15 磅的高压灭菌器中对剪刀消毒 30 分钟。

剪刀干燥后，将离心管切成 7 到 8 毫米高的环。现在使用适当的粉碎工具将低粘附力、未经处理或微生物培养皿粉碎成小块。将大约 1 克塑料颗粒溶解在 10 毫升氯仿中，在通风橱内过夜。

验证液态塑料溶液的粘度，以确保其适合移液。如果溶液太稀，请添加 1 到 3 克额外的塑料颗粒。如果它变得太稠，用大约 5 毫升的氯仿稀释。

将高压灭菌器塑料环放在 60 毫米培养皿的中心。然后在环内涂抹液态塑料，形成一个塑料旋钮。让餐具在层流罩中不加盖地干燥 2 到 3 小时。

干燥后，将菜肴暴露在紫外线照射下 20 到 30 分钟。首先，获得含有塑料旋钮的改良培养皿。软骨收获后两天，使用 60 毫米培养皿在 Hank 溶液中清洗软骨块。

然后使用高压灭菌器将软骨切成直径约 1 到 2 毫米的碎片。将软骨块转移到 15 毫升试管中，并在轨道摇床培养箱中用 0.01% 胶原酶 2 型 DMEM 溶液消化 8 至 12 小时。消化后，加入含 DMEM 的软骨碎片，并以 300 G 离心试管 10 分钟。

弃去洗涤液后，将片段重悬于软骨细胞培养基中，并将它们接种到预涂有 0.1% 明胶溶液的粘合剂 T25 培养瓶上并孵育。接下来，在预涂有含有细胞外蛋白的基质的六孔板中培养诱导多能干细胞。为了开始向软骨细胞系分化，在前两天在培养基 A 中培养 iPSC。

第三天，用排除 CHIR-99021 和 rho 激酶抑制剂的溶液替换培养基 A，同时保持所有其他成分不变。第 10 天，将软骨细胞样细胞转移到为促进软骨生成而配制的培养基 B 中，然后在微波炉中以 700 瓦的功率熔化 1.5% 精氨酸糖浆约 60 至 90 秒。液化后，向 96 孔细胞悬浮培养板的每个孔中加入 75 微升琼脂糖，并使其在室温下硬化。

接下来，向每个孔中加入 150 μL DMEM，并将板在二氧化碳培养箱中孵育至少 12 小时。在第 12 天，观察与雄激素生成相关的表型变化，以进行球状体起始。使用 0.05% 胰蛋白酶溶液从板中分离 80% 汇合度的细胞。

加入等体积的含 10% FBS 的 DMEM 后，将细胞转移至 15 mL 试管中，并以 200 G 离心 5 分钟。将细胞重悬于一毫升培养基 B 中，并将它们转移到预涂有 0.1% 明胶溶液的 75 平方厘米细胞培养瓶中。一旦细胞达到 80% 汇合度为单层，再次用胰蛋白酶分离它们并将它们重新悬浮在培养基中 B.现在将细胞分配到涂有 1.5% 琼脂糖的 96 孔板中，密度为每孔 100， 000 个细胞，以及 150 微升培养基 B.孵育细胞最少一天，最多三天，直到形成球状体。

然后使用 1 毫升移液器吸头将球体从孔中转移至 15 毫升试管中。让球状体静置 2 到 3 分钟，然后去除上清液。现在将球体浸入新鲜解冻的未稀释基底膜基质溶液中，并在 4 摄氏度下回火。

30 分钟后，将试管以 100 G 离心 1 分钟以收集球状体。最后，将球体转移到准备好的微型生物反应器中，并加入 6 毫升培养基 B.将微型生物反应器放入二氧化碳培养箱中。分化 19 天后，99% 的细胞表达软骨形成标志物聚集蛋白聚糖、 1 型胶原蛋白、 2 型胶原蛋白和 SOX9。

在分化第 30 天通过基因表达分析评估，将高质量的软骨球鉴定为软骨细胞基因标志物表达至少 90% 至 95% 的软骨球。成熟的球体表现出一致的形态发生，两个月后长到 1 到 2 毫米的典型直径，较大的球体显示出带有空腔或坏死的中心区域。