我们的研究重点是白血病，特别是骨髓增生异常综合征或骨髓增生异常肿瘤。这是一种起源于造血干细胞的干细胞疾病。它影响各种血细胞谱系，尤其是负责心脏血细胞生成的红细胞谱系。
这种谱系的破坏会导致贫血，这在 MDS 患者中很常见。我们在本文中提供的管道允许一种稳健且简化的方法来评估基因修饰或药物治疗后人类成红细胞的体外效率。造血干细胞从出生到我们生命的最后一刻都存在。
我们的机体中不再有增殖组织，每天产生数万亿个细胞。还有很多事情需要了解，因此我们将继续研究健康氨基组织中的这些神奇细胞，重点关注蛋白质稳态和 RNA 生物学。首先，将小瓶浸入设置为 37 摄氏度的水浴中 30 秒，解冻 100， 000 个 CD34+UCB 细胞。
向小瓶中滴加 1 mL 解冻培养基，然后通过上下吹打轻轻重悬细胞。将重悬的细胞悬液逐滴转移到 5 mL 解冻培养基中。然后在室温下以 320 G 离心细胞悬液 8 分钟。
在 10 毫升荧光激活的细胞分选或含 DNAse 的 FACS 缓冲液中洗涤细胞。再次离心细胞后，将沉淀重悬于 2 mL 刺激培养基中。将 2 mL 细胞悬液转移到 24 孔板中，并在 37 摄氏度下孵育板 4 至 6 小时。
然后将细胞收集在荧光激活的细胞分选管中，并用 1 毫升干细胞培养基加满。解冻病毒后，向刺激培养基中加入所需体积，以达到 30 的感染倍数。将沉淀的细胞重悬于含病毒的培养基中，密度为每 100 μL 病毒 100， 000 个细胞，并将它们转移到 96 孔板的一个孔中。
将 PBS 添加到空孔中，并在 37 摄氏度下孵育过夜。然后将全体积的细胞悬液从 96 孔板的孔中转移到含有 1 毫升干细胞培养基的 FACS 管中。用干细胞培养基清洗孔和移液器吸头，向 FACS 管中加入 2 毫升干细胞培养基。
离心 FACS 管后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 2 毫升扩增培养基中。将悬浮液转移到 24 孔板的孔中并孵育细胞。首先，将用 EGFP 报告基因转导的全体积 CD34 + 细胞转移到单独的 FACS 管中。
在室温下以 320 G 离心 8 分钟。将沉淀的细胞重悬于 100 微升 FACS 缓冲液中。每管加入 5 μL CD34 抗体，并在 4 摄氏度的避光下孵育试管 20 分钟。
然后将细胞重悬于一毫升含有 DAPI 的 FACS 缓冲液中，并在室温下以 320 G 离心 8 分钟。将细胞重悬于 200 μL 含有 DAPI 的 FACS 缓冲液中后，在分选前通过 40 μm 过滤器过滤细胞悬液。接下来，在 100 μL PBS 中加入 0.5 μL CD34 抗体到 1 滴珠子中。
将混合物在 4 摄氏度的黑暗中孵育 20 分钟。然后在混合物中加入 1 毫升 PBS。在室温下以 320 G 离心 8 分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。接下来，将 GFP 阴性和 GFP 阳性白血病细胞添加到 FACS 管中。在一毫升 FACS 缓冲液中洗涤细胞。
离心细胞后，重悬 100， 000 个 GFP 阴性细胞和 100， 000 个 GFP 阳性细胞，每个细胞在 500 微升 FACS 缓冲液中。分选前通过 40 微米过滤器过滤细胞悬液。然后在干细胞培养基中收集分选的细胞。
在室温下以 320 G 离心细胞 8 分钟。然后将细胞重悬于 3 mL 红系分化培养基中。现在将 1 毫升重悬的细胞分配到 24 孔板的三个孔中。
用 PBS 填充所有外孔。要刷新培养基，请确保细胞已沉淀在板的底部。轻轻倾斜板并去除 500 μL 培养基。
然后加入 500 μL 2X 细胞因子红细胞分化培养基以刷新板。第 6 天，将细胞转移到 12 孔板中，并向每个孔中加入 1 mL 培养基，以达到 2 mL 的最终体积。从 12 孔板的每个孔中收集 200 微升细胞。
用 250 μL 2X 红细胞分化培养基替换去除的体积。向每个收集管中加入 1 毫升 FACS 缓冲液。离心试管后，将沉淀的细胞重悬于 100 微升 FACS 缓冲液中。
向试管中加入 CD71、CD34 和 CD235a 抗体各 1 微升。然后将细胞重悬于一毫升含有 DAPI 的 FACS 缓冲液中。在室温下以 320 G 离心试管 8 分钟。
用 DAPI 将细胞重悬于 200 微升 FACS 缓冲液中。设置 DAPI 与侧向散射或 SSC 以排除死细胞。设置 SSC 高度与 SSC 面积以排除聚集体并选择单个单元格。
设置前向散射区域与 SSCA 以根据大小去除碎片。设置 CD235a 与 CD71。设置 CD34 与 SSCA。
运行微珠 GFP 阳性细胞和 DAPI 染色细胞。补偿读数并将补偿应用于细胞仪设置。来自脐带血的 CD34 阳性细胞显示 Annexin V 阳性凋亡细胞从第 4 天的 14.4% 增加到第 17 天的 34.2%。
条形图显示，到第 17 天，膜联蛋白 V 阳性细胞的百分比显著增加，达到约 40%
