分析黑 腹果蝇 幼虫脂肪体中饥饿诱导的自噬

该协议描述了如何通过氨基酸消耗在黑腹果蝇幼虫脂肪体中诱导自噬，以及如何分析突变克隆之间自噬的差异。由于自噬对培养条件下的营养可用性高度敏感，克隆分析是一种分析同一组织中突变细胞与野生型细胞的方法，在解剖自噬缺陷方面具有优势。首先将3只雄性和15只雌性成年果蝇引入带有标准玉米面或糖蜜或琼脂果蝇培养基的培养瓶中，在25摄氏度下进行交配。

在诱导后 48 小时，轻拍交配小瓶，直到苍蝇被击晕并落到小瓶底部的培养基上。拔下交配小瓶的插头，用未插拔的倒置培养瓶用新鲜培养基盖住其嘴。然后翻转并敲击小瓶，将苍蝇转移到新鲜培养瓶中。

塞上新鲜培养瓶并丢弃旧小瓶。将新鲜培养瓶放入25摄氏度的培养箱中，以便在新鲜培养基上产卵。产卵六小时后取出苍蝇，将苍蝇倒入含有75%乙醇的烧瓶中丢弃苍蝇。

将装有胚胎的小瓶在37摄氏度的水浴中孵育一小时，以诱导翻转酶表达。随后，将它们放入25摄氏度的培养箱中，让胚胎继续发育。使用实验室刮刀，在产卵后 75 小时将含有发育幼虫的培养基舀出到培养皿中。

向培养皿中加入1X PBS，并使用长镊子轻轻分离培养基和幼虫。然后选择10至15个早期第三龄幼虫。用 1X PBS 填充九孔玻璃凹陷点板的孔，并使用长镊子将分离的第三龄幼虫放入孔中。

彻底清洗幼虫以去除所有介质残留物。取5毫升20%蔗糖溶液放入空瓶中，用长镊子将干净的第三龄幼虫放入该溶液中。将该小瓶在 25 摄氏度的培养箱中孵育 6 小时，然后收获它们进行解剖。

向九孔玻璃凹陷点板的每个孔中加入1X PBS，并用长镊子将幼虫转移到孔中。将一只幼虫放入孔中，背侧朝上。用幼虫躯干中间的两个5镊子抓住幼虫的角质层，轻轻撕开角质层。

暴露的脂肪体以及其他幼虫内部组织仍将附着在幼虫的尸体上。拉力足以尽可能暴露内脏。对所有幼虫重复此步骤。

将幼虫尸体转移到含有500微升4%PFA的1.5毫升微量离心管中，并在25摄氏度下孵育30分钟而不摇动管。30分钟后，移出PFA溶液。将500微升1X PBS加入管中。

在平旋器上轻轻摇动试管10分钟，然后丢弃1X PBS溶液。重复此操作三次。使用长镊子，将固定和洗涤的幼虫尸体转移到充满1X PBS的九个凹陷点板中的孔中。

用5个镊子去除所有非脂肪身体组织。最后，使用80%甘油作为安装介质将脂肪体的碎片安装在显微镜载玻片上，并在顶部铺上盖玻片。突变体一和突变体二是X染色体上的两个独立的致命突变体，同质化的黄白色FRT 19A苍蝇在这里作为对照。

在对照、突变一或突变二镶嵌幼虫脂肪体中分析GFP-Atg8a模式，用RFP对突变克隆或对照克隆进行阴性标记。在对照克隆中，GFP-Atg8a Puncta的模式与周围RFP阳性细胞中的模式相似。在突变一突变克隆中，GFP-Atg8a Puncta大大减少。

在突变的两个突变克隆中，GFP-Atg8a Puncta的数量和大小增加。幼虫发育阶段在这里至关重要。开发时间和饥饿持续时间需要根据每个实验室的培养基配方进行修改。

该程序可用于探索选择性自噬。例如，可以通过将荧光蛋白连接到线粒体靶向序列来监测苍蝇脂肪体中的线粒体自噬。