此方法有助于检测和共同本地化单个低温中的多个生物标志物，包括石蜡部分通常无法检测到的标记。使用这种实验染色方法，染色时间显著缩短，可以在任何实验室中执行该方法。演示此方法将是迪内什· 贾尚卡尔。
他是实验室的熟练博士后，也是免疫治疗评估核心，设施经理。在选择用于分析的抗体时，请考虑半自动成像系统上可用的激发和发射滤波器集。在测试各种氟磷结合原抗体组合后，准备使用荧光团，以便您具有表中所示的最小光谱重叠。
对于多路复用染色，在预定的最佳错觉下准备含有相容荧光的抗体鸡尾酒，并将鸡尾酒添加到感兴趣的组织部分。对于单标记染色，仅将原联偶抗体添加到幻灯片中。对于所有染色，包括一个控制无污染的幻灯片，经过相同的染色过程，而无需添加原联偶抗体。
在室温下孵育一小时后，用PBS清洗幻灯片两次，每次洗涤五分钟。第二次洗涤后，用DAPI将多路复用染色的幻灯片在室温下用DAPI进行7分钟的反染色，然后用PBS进行两次5分钟的洗涤。要创建光谱库，请将多光谱成像系统的灯功率设置为 100%，并打开显微镜操作软件。
选择编辑协议和新协议。输入协议名称，并在成像模式下选择荧光。然后提供一个研究名称，并加载单个彩色幻灯片到舞台上。
单击"编辑曝光"，并使用自动对焦和自动曝光选项调整曝光时间并获取单个彩色幻灯片的快照。成像单个彩色幻灯片后，保存协议。在"构建库"选项卡下的机器学习软件中，加载每个彩色图像。
选择适当的楼层并单击"提取"。该软件将自动提取在地板上选择的荧光信号。若要保存提取的颜色，请单击"保存以存储"。
可以创建一个新组，也可以将提取的颜色存储到现有组。对于多光谱成像，创建和验证光谱库后，如演示的，调整多路复用彩色幻灯片上的焦点和曝光时间，并打开扫描的幻灯片以创建新任务。提供幻灯片 ID 并选择协议。
在"任务"下，选择整个幻灯片扫描，以在多路复用彩色幻灯片上执行整个幻灯片扫描。在整个幻灯片扫描图像中，选择整个图像中感兴趣的区域。这些区域将使用多路复用幻灯片上先前设置的曝光时间进行扫描，用于频谱解混和分析。
在显微镜操作软件中，选择获取任务中的 MSI 字段，然后单击"过程幻灯片"以 20 倍的放大倍率获取感兴趣的区域。获取感兴趣区域后，在机器学习软件中，单击手动分析选项卡下的"文件"和"打开"以加载多路复用彩色图像。选择光谱库源，然后单击"选择楼层"以选择以前保存的光谱库。
单击"文件"和"打开"可加载未污染的图像。然后单击自动荧光油墨标记图标，并在未污染的幻灯片上绘制一条线或区域，以识别组织内的自动荧光。然后在"编辑标记和颜色"选项卡下，为每个标记分配名称，然后单击"全部准备"。
在验证光谱上未混合的图像后，在机器学习软件中，从面板中选择细胞质膜和标记选项。并使用省略号按钮，选择使用此信号查找，以配置标记来检测核、细胞质或膜。当选择细胞质或膜标记时，选择"使用信号"以帮助进行核分裂选项。
该软件将自动检测和创建细胞核、细胞质和膜的单个掩码。使用特定标记的病理视图和软件中的配置选项调整蒙版，然后单击"全部分段"以创建细胞分段图。细胞分割后，选择标记以表型正细胞。
此外，选择至少五个未沾染所选标记的细胞来表型负细胞。然后单击"训练分类器"以训练软件，以自动检测图像中沾染所选标记的所有单元格。将创建表型贴图。
正如这些图像显示的，用于流式细胞学验证的抗体可用于使用半自动成像系统中的液晶可调滤波器来可视化组织染色。在这里，可以观察到冷冻人类扁桃体的光谱未混合图像，包括卵泡胚芽中心内的B细胞和增殖细胞的标签，以及卵泡T细胞间区域。病理视图选项允许可视化感兴趣的组织内每个标记的单个染色模式，表明多路复用染色方法和光谱成像工作在冷冻组织。
如冷冻小鼠肿瘤部分所证明，多光谱成像也可用于可视化肿瘤渗透T细胞，以及其他骨髓细胞谱系，包括肿瘤相关巨噬细胞。可以生成细胞分割和表型图，以及软件分析的每个标记的染色细胞数量，表明该软件可用于定量冷冻组织上的多光谱染色。对于新到该技术的人，了解氟化物的具体特征，并准备高质量的库幻灯片，以便以最小的光谱重叠进行光谱解混合，这一点非常重要。
执行抗体滴定也很重要。我们认为，这种方法可以提供有关免疫治疗对癌症和其他治疗应用的疗效的床边信息，特别是当时机至关重要时。
