使用 PRIMO 微模式系统对蛋白质的光诱导分子吸附，研究细胞对细胞外基质蛋白的反应

微模式是一个非常强大的工具，因为它允许研究细胞反应，以定义细胞在生物体中遇到的生化和生物物理信号。与其他方法相比，所述方法对于模式生成更为灵活。例如，它允许生产具有高可重复性多蛋白质的梯度和微模式。

我们的小组不仅使用LIMAP研究神经元路径查找，还研究其他细胞对影响细胞增殖、分化和迁移的信号的反应。微模式用于回答细胞生物学中的基本问题。获得的知识可用于修改再生医学中的现有设备，例如，周围神经损伤后的神经修复。

首先设计数字绘图软件的图案模板。选择长度为 1，824 像素和宽度为 1，140 像素的图像大小。设计模板，将模板另存为 8 位 TIFF 文件。

在进行阵列之前，使用等离子清洁剂清洁和激活表面，使用 1，000 至 1，300 毫托雷和 29.6 瓦的功率，使用 1 到 5 分钟的功率。使用 20 毫米内井尺寸和 0.16 至 0.19 毫米的玻璃底盘。选择六井或单井菜，具体取决于测试的条件数。

在无菌条件下切割 PDMS 模具，以确保它们适合内部玻璃底井。用无菌钳子拆下内部微井填充物，将模具粘在玻璃井上。在 PBS 中准备 0.1 毫克每毫升 PLL-PEG 溶液，并在每个微孔中添加 20 微升。

然后，在室温下孵育一小时。孵育后，从每口井中去除15微升的PLL-PEG，用20微升PBS洗5次，不让它干燥。准备一个微井，通过从单个井中去除 18 微升 PBS 并添加 5 微升光启动器来创建参考模式，将 PBS 留在剩余的微井中。

然后，使用荧光荧光笔标记空的内玻璃井。将目标放在目标上方，并调整目标焦点，直到 PRIMO 徽标和标语照顾您的细胞"处于焦点位置。然后，记录焦平面的 Z 位置。

要创建参考模式，请使用通过摄像机传输的光使用光启动器可视化微井的边缘，然后从右侧菜单中选择 ROI 符号。选择 PRIMO 上传所需的模式模板，该模板将投影到 ROI 作为设计单元。导航到微井的外围区域，选择"锁定"，然后将焦点调整到校准的 Z 位置。

然后，选择"播放"以开始对参考图案进行照片模式。用 20 微升 PBS 清洗参考图案微井三次，以去除光启动器。然后，加入20微升荧光标记的细胞外基质，或ECM蛋白溶液。

在室温下孵育该盘10至20分钟，确保保护参考井免受光线影响。孵育后，去除18微升蛋白质溶液，用20微升PBS洗井三次。使用荧光显微镜可视化参考模式。

通过摄像机路径调整阵列边缘的焦点，并根据最佳焦点记录 Z 位置。此位置将是用于后续阵列的最佳激光焦点。在无菌条件下，从所有微井中去除 18 微升 PBS。

在每个井中添加五个光启动器的微升，通过上下移液实现均匀化。如果在同一微井中阵列多个蛋白质，请同时上传所有所需的模式模板集。然后，选择行数、列数和剂量数。

将模板配置保存为软件中的文件。导航到生成参考图案的区域，并调整焦点以最佳 Z 位置。然后，选择"播放"以启动照片模式。

随着照片模式完成，设计单元从红色变成蓝色。用 20 微升 PBS 洗三次，将光启动器从微井中去除。上次洗涤后，从每个微井中去除 18 微升 PBS，并加入 20 微升 ECM 蛋白溶液。

在室温下孵育盘子20至30分钟，确保防止其光线。接下来，去除 ECM 蛋白溶液的 15 微升，并使用 20 微升 PBS 洗涤三次。为了防止交叉结合，在微孔中加入20微升的PLL-PEG（BSA），并在室温下在黑暗中孵育一小时。

然后，取出15微升的阻尼剂，用20微升PBS洗涤所有微升三次。去除 18 微升 PBS，并将 5 微升光启动器添加到每个微井中，确保光启动器在微井的整个表面上是均匀的。导航到第一个微井，并加载以前保存的模板配置。

然后，为第二轮照片模式选择要图案的操作，确保取消选择第一作。照相模式后，使用 PBS 清洗取出 PLPP。然后，用第二个ECM蛋白溶液孵育20分钟，用20微升PBS洗涤微井三次。

使用荧光显微镜可视化和成像打印的图案。当准备板制细胞时，在内部玻璃井中加入一毫升的介质，确保覆盖所有微井。将培养皿放在37摄氏度和5%的二氧化碳孵化器中。

为了确保生成的模式是模板的精确表示形式，沿条带和每个条带上方的相应背景区域获取荧光强度测量。可重复定义的微图案宽度为 20 至 2 微米，但打印特征为 20 微米或更宽时，可以观察到边缘效果。定义的蛋白质浓度是通过以不同浓度的蛋白质孵育获得的，或者通过改变用于切割抗紧膜的激光剂量获得。

激光强度与模板的灰度水平成正比，产生紫外线照明的梯度。沿梯度条纹的荧光强度剖面测量在图案模板中和生成的梯度图案中是线性的。该协议可用于在同一微井中创建具有多种蛋白质的微图案，例如具有纤维素水平条纹的交叉图案和层压素的垂直条纹。

但是，防止蛋白质交叉结合是必要的阻塞步骤。生成的交叉模式随后可用于神经元细胞系或CAD细胞或原发神经元、大鼠 DRG 的细胞测定。执行此协议时，需要记住的最重要的方面是进行正确的系统校准，不要让微井在多个洗涤步骤中干燥，并使用正确的参数进行蛋白质孵化和阻断。

细胞行为分析通常涉及显微镜，如荧光、延时、AFM。进一步表征可以包括其他生化方法，如基因表达分析。