流式细胞术测定小鼠胸腺、胰腺干淋巴结和脾脏的调节 t 细胞亚群

该协议有助于研究免疫细胞在特定器官在健康和病理学中的作用。这种技术的主要优点是，这是一种经济高效的技术，因为它是一种手动技术。演示手术的将是我实验室的博士生罗正康。

首先，将以前安乐死小鼠的胸腺和盐水放入20毫升闪烁的磷或15毫升锥形管中，填充5毫升汉克的平衡盐溶液。将胰腺排干淋巴结放入1.5毫升微管中，内注1mlRPMI-1640。确保使用整个胸腺和脾脏，以及所有的PDLN。

在整个过程中，将器官放在冰上。用一把剪刀，彻底挤压胸腺和脾脏，释放免疫细胞。丢弃剩余的胸腺和胶囊。

将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中。在433倍g和4摄氏度下离心5分钟，并丢弃上一代。为了对红血球进行解酶，在5ml的0.2摩尔氯化铵中重新悬浮细胞悬浮，并在室温下孵育10分钟。

每两分钟轻轻反转一次管子。在孵育结束时，加入5mlHSSS，以阻止溶解。在433倍g和4摄氏度下离心管5分钟。

丢弃上一级，并在约5ml的HSSS中重新悬浮细胞。然后，用HSSS填充管子。重复此过程，从离心样品到用 HBSS 填充管，一次。

将管子再次以433倍g和4摄氏度离心5分钟。丢弃上一液，并在HSSS中重新悬浮颗粒。获得5毫升圆底管与细胞过滤器盖。

通过将悬浮液应用于细胞应变盖，将 1 ml 的胸腺细胞悬浮液和 500 微升的胸腺细胞悬浮液转移到管中。首先，将15毫升锥形管放入机架中。将无菌的 250 微米金属网放在管子上。

用 1 ml 的 RPMI 冲洗网格。接下来，将淋巴结转移到金属网，并使用一对钳子通过网格研磨它们。在网格上涂抹 1 ml RPMI，将细胞冲洗到管中。

重复此过程，对每个样品进行三次淋巴结的转移和研磨，然后移除网格。将管子在433倍g和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上一提液，在大约 5 ml 的 RPMI 中重新悬浮细胞。

然后，用 RPMI 填充管子。重复此过程，从离心样品到用 RPMI 填充管，一次。再次以 433 倍 g 和 4 摄氏度离心管，5 分钟。

丢弃上一提液，并在2mlRPMI中重新悬浮细胞颗粒。将 2 ml 的细胞悬浮液转移到 5 ml 圆底管中，带细胞应变盖。首先，将胸腺、脾脏和PDLN样品的悬浮液从433倍g和4摄氏度下离心5分钟。

丢弃上一杯。用文本协议中概述的表面抗体染色细胞，并在冰上孵化管子40分钟。接下来，向每个管添加 200 微升的 FACS 缓冲液。

在433倍g和4摄氏度下离心5分钟，然后丢弃上一代。重复此过程，添加缓冲区，离心，并丢弃上流液，一次。将细胞颗粒重新悬浮在500微升的渗透固定缓冲液中，以固定和渗透细胞。

一夜之间将管子转移到四摄氏度的冰箱上。第二天，将管以433倍g和4摄氏度离心5分钟。丢弃上流剂，将细胞颗粒重新悬浮在500微升的渗透洗涤缓冲液中。

将细胞再次以433倍g和4摄氏度离心5分钟，然后丢弃上一代。如文本协议中所述，用细胞内抗体染色细胞。在冰上孵化管子1小时。

在此之后，在每个管中加入500微升的渗透洗涤缓冲液。在433倍g和4摄氏度的离心机5分钟。丢弃上流液，并在 500 微升渗透洗涤缓冲液中重新悬浮颗粒。

在433倍g和4摄氏度下再次离心5分钟。丢弃上流液，在 300 微升 FACS 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。然后，分析流式细胞仪上的细胞，如文本协议中所述。

在这项研究中，单细胞从正常血糖NOD小鼠的胸腺、PDLN和孢子分离，并染色与特雷格细胞标记、CD4、CD25、Foxp3、Helios和神经皮林-1进行流动细胞测量分析。结果被分析，并在这里显示为具有代表性的浇注策略。CD4阳性、CD8阴性、CD25阳性、Foxp3阳性Treg细胞中的太阳阳性细胞比例高于所有三个器官的Nrp1阳性细胞的比例。

胸腺中超过80%的Treg细胞被看到表达太阳，高于PDLN和脾脏。在PDLN中，NrP1阳性细胞的比例高于胸腺或脾脏。大多数Nrp1阳性的Treg细胞也表达赫利奥斯，Nrp1阳性Treg细胞中赫利奥斯阳性细胞的比例在胸腺和脾脏中比在PDLN中高。

总之，这些结果表明，Helios是检测T Treg细胞比Nrp1更好的标记。 淋巴结很小，但一些细胞内标记需要大量的细胞才能在流动细胞学中发出良好的信号。此过程后无法执行其他方法，因为单元格已染色和死亡。

但是动物的四个细胞标记可以被替换，以研究其他类型的免疫细胞。