填充海马 ca2 间神经元的生物环素恢复与三维重建

该方法有助于对神经元亚型进行分类，并扩展我们对皮质电路功能图的理解。该协议已经优化，以保持神经元的超结构，并获得良好的恢复树突和轴突树干，允许高品质的重建。在电生理记录结束时，将包含记录细胞的切片转移到ACSF的小盘中。

在烟罩中工作时，将切片卷到一小块优质滤纸上，然后将另一块湿润滤纸放在切片上。将组织放在一个小塑料锅中，里面装着5至10毫升的固定溶液，并储存在4摄氏度过夜。第二天，将组织从装有固定溶液的容器转移到装有两毫升0.1摩尔磷酸盐缓冲液的容器中，以便冲洗，并用手术刀刀片切掉多余的组织。

将切片放入培养皿中去除多余的组织，然后用手术刀刀片切掉多余的组织。将修剪过的纸巾转移到干净的培养皿中，确保其平躺，无褶皱或折痕。使用干漆刷拆下多余的缓冲液。

用温暖的明胶溶液盖住组织，将培养皿放在冷冻块上，快速冷却溶液。然后，将明胶设置为 4 摄氏度的菜盘 30 至 60 分钟。在烟罩中，使用手术刀刀片切出含有明胶嵌入组织的 1 X 1 厘米小块。

使用小铲子提起方块，小心地转移到新鲜的固定溶液中。允许在4摄氏度下固定至少30分钟。第二次固定后，用五毫升 PB 清洗明胶块三次。

洗涤后，用一张纸纸巾擦干块。然后用少量的氰丙烯酸酯胶水将块粘住，用顶部的组织定向，使用超级胶水将振动器卡车粘上。使用振动器将切片切成 50 微米厚度，并小心地将每个切片放在含有 10% 蔗糖的玻璃瓶中。

分段后，小心地从小瓶中拾起一个截面，并平放在培养皿盖中。然后使用新鲜的手术刀刀片从部分周围去除明胶。将部分放入含有2毫升新鲜10%蔗糖的小瓶中，搅拌10分钟，开始低温保护过程。

在低温保护之后，使用油漆刷将部分平放在铝箔的小矩形上。从部分中去除多余的液体，并小心地将铝箔折叠成包裹。将铝箔靠近液氮表面，无需接触表面 30 秒。

然后让部分完全解冻约 30 秒。再重复两次冻结解冻。用画笔从铝箔上取下所有部分，并放入含有两毫升 PB 的玻璃小瓶中，在不断搅拌下洗掉多余的蔗糖。

进行荧光成像的免疫抹布后，将幻灯片放入含有 PBS 的玻璃培养皿中，并小心地取出盖板。然后使用巴斯德移液器中的 PBS 的温和脉冲将幻灯片上的部分洗净。将部分放入含有 PBS 的清洁玻璃瓶中。

通过首先孵育 Avidin 生物素复合物或 ABC 中的部分，执行 Avidin HRP 反应，至少两个小时，以放大 HRP 反应产品。接下来，用 PBS 清洗部分 3 次 10 分钟，然后用三轮车缓冲液洗涤 10 分钟。去除最后的三分缓冲液洗涤后，快速将一滴 8% 的氯化镍溶液添加到二甲苯胺溶液或 DAB 溶液中。

然后移液解，混合和快速添加一毫升的溶液在部分。孵育此解决方案中的部分 15 分钟。然后向 DAB 溶液中加入 10 微升 1% 过氧化氢。

让反应在不断的搅拌下在黑暗中持续约一到两分钟，直到细胞被标记。在烟罩中，将一小圈滤纸放入培养皿中，用 PB 进行阻尼。使用油漆刷一次从玻璃瓶中提起各部分，并小心地将它们平放在纸上。用另一个湿润的滤纸圈覆盖这些部分，通过轻轻将纸巾触摸到表面来去除多余的缓冲液。

在 PB 中涂抹八到九滴百分之一的三氧化二氮。盖上盘子，在烟罩中保留至少30分钟，但不超过1小时。冲洗、安装和覆盖各部分后，通过一系列 50%、70%、95% 和 100% 的酒精溶液脱水。

脱水步骤后，将部分转移到装有 100% 乙醇的玻璃瓶中，在摇床上进行大约 5 分钟。用氧化丙烯代替酒精溶液，洗涤三次五分钟。上次洗涤后，在小瓶中保留约两毫升的环氧丙烷，然后以1:1的比例加入树脂。

确保树脂溶解，并保持各部分持续搅拌 30 分钟。30分钟后，用木棍将每个部分放在含有环氧树脂的铝木板中，并孵育过夜。第二天，将木板放在热板上约10分钟。

然后用木棍拿起每个部分，放在干净的滑梯上。将所有部分转移到幻灯片上后，在解剖显微镜下查看幻灯片，以检查切片的方向，并在切片上放置盖玻片。在56摄氏度下在烤箱中治疗48小时。

使用低放大镜将焦点放在包含细胞主体的主页部分。然后使用 100 倍目标，聚焦单元格主体，然后在中心单击以标记参考点。要使用 100 倍目标在 3D 中跟踪索马，请从跟踪选项卡中选择轮廓，然后选择单元格体轮廓。

使用操纵手柄将焦点移动到单元格体的顶部。通过单击当前焦点零件的周长来放置点。右键单击并选择关闭轮廓以完成第一个轮廓。

在不同的 z 位置重复此过程，直到到达细胞体的底部。要跟踪树突状的树突，请在神经元菜单中选择树突或树突。首先，使用鼠标滚轮跟踪每个树突的短初始段，以调整光标的直径以匹配树突的直径。

沿着每个树突追踪。当到达树中的节点时，右键单击从下拉菜单中选择分叉节点或三边形节点。若要标识与已完成部分匹配的节中的树突之间的匹配点，请单击"移动"选项卡并选择匹配点。

选择需要匹配的点数，然后按"确定"。单击已完成分支的结束，然后单击分支。对每个匹配点重复此项。一旦每个部分的所有树突被追踪，使用相同的过程跟踪轴突，此处显示的是使用绘图管使用受限树突和轴突的CA2篮子细胞的重建。

树突是黑色的，斧头是红色的。这是按照此处描述的 Avidin HRP 协议进行的生物细胞填充篮子细胞的示例图像。此处显示的是 CA2 篮子细胞的 3D 神经元重建视频。

树突是深粉色的，斧头是白色的。最后，此图像显示了 CA2 篮子单元格的树突图。精通此协议需要时间。

但是，这种优化的方法可以生成体外复杂皮质和海马结构的高分辨率图像。