电子顺磁共振在生物样品环境温度和 77 k 的应用

调节性氧化还原信号与各种疾病的发病机制有关。氧化还原生物学的研究要求准确检测不同细胞和组织区中的活性氧物种。EPR光谱是明确测量自由基的唯一方法。

该协议演示了一种处理和存储EPR光谱生物样品的实用方法。这些协议说明了在两个代表性模型中使用EPR和自旋探头。虽然它们可以适应在其他生物环境中评估活性物种。

实验的设计以及样品的处理对于其可重复性至关重要。我们建议考虑细胞密度，并确保适当的时间匹配控制。首先用每井一毫升的克雷布斯-亨塞利特缓冲液或KHB轻轻清洗生的264.7个细胞。

用500微升KHB，每井补充100微米DTPA。要预处理超氧化物脱木酶，请在每个井中加入15微升的超氧化物脱化酶储存或车辆，并将板在37摄氏度下放置10分钟。在超氧化物去液化预处理结束时，将12.5微升10毫摩尔CMH和40微升125微摩尔PMA工作溶液加入到适当的井中，并在37摄氏度下孵育50分钟。

立即将盘子放在冰上，将每个井的缓冲液收集到冰上单独的1.5毫升管中。接下来，将100微升新鲜KHB加DTPA添加到每一个井中，然后轻轻地从每一个井的底部刮取细胞。然后用移液重新悬浮细胞悬浮液，将细胞转移到冰上单独的1.5毫升管中。

在室温下进行超氧化物检测，首先将一个缓冲液或细胞样品的50微升装入毛细管并密封管。立即将管放入电子顺磁共振（EPR）光谱仪中，并设置室温测量的EPR采集参数。始终测试含有与对照器相同的实验条件下处理的相同浓度的探针的空白样品。

对于在 77 度开尔文的超氧化物检测，将一个样品的 150 微升装入一到两英寸的直聚四氟乙烯（PTFE）管中，一端有橡胶塞。用第二个塞子密封管的另一端，并在液氮中闪冻样品。然后快速拆下塞子，将 PTFE 管放在标有低温管中，以储存液氮。

对于 EPR 测量，用液氮填充 EPR 光谱仪的手指脱华，并将含有样品的 PTFE 管放在液氮中。将手指 dewar 放入 EPR 光谱仪中，将 77 开尔文的测量的 EPR 采集参数设置为 77 度。在冷冻肺组织中进行ROS检测时，将组织放在干冰上，用钳子将闪冻组织稳定在干冰上。

将样品切成五块15毫克，并在焦油1.5毫升管中称重。在样品中加入196微升KHB加DTPA和4微升CMH，在37摄氏度的水浴中孵育肺样本一小时，然后通过短暂的离心对组织片段进行造粒。然后将样品放在冰上，然后将 150 微升的上一液液转移到一块 PTFE 管中进行闪光冷冻，以准备 EPR 测量，正如刚刚演示的。

如证明，对用PMA刺激刺激的原始264.7细胞的总超氧化物产生情况的评估表明，由于自旋探针的渗透性质和快速平衡，在细胞悬浮液和PMA处理细胞缓冲液中，硝基氧化物浓度相似。与对照细胞相比，硝基基在受PMA刺激的原始264.7细胞中增加，但在使用细胞不渗透超氧化物不变性酶的预处理细胞中则不增加。使用PMA刺激后，在原始264.7细胞中低温获得的硝基氧化物浓度在与室温数据一致的超氧化物脱化酶的存在下也衰减。

与PBS治疗的对症小鼠和受伤动物相比，在血鼠和经过治疗的小鼠的血液和支气管中，以及从血小鼠和受伤动物中收获的肺组织片段的超级盐中，硝基氧化物浓度增加。此外，在逆轨道旋转探针注射后，与对控装置相比，蓝鼠和经过治疗的动物表现出更高的旋转探针信号。这些实用方案将允许研究人员通过EPR测试不同细胞隔间和生物样品中的自由基生产，包括低温测量。