测定带状纤维粘弹性的生物制备及机械技术

该协议描述了研究细胞外基质粘弹性及其对蛋白质组成或环境因素的依赖性的方法。目标基质系统是鼠标区域。通过比较野生型带状纤维与缺乏微纤维相关糖蛋白-1的粘弹性行为来证明该方法的性能。

弹性对于血管、肌肉和肺等组织的功能至关重要。这种性质主要来自细胞外基质（ECM），这是将细胞和组织结合在一起的蛋白质网状物。ECM网络的弹性特性如何与其组成相关，以及ECM的弛豫特性是否起生理作用，都是尚未完全解决的问题。部分挑战在于大多数 ECM 系统的复杂架构，以及在不影响其结构的情况下隔离 ECM 组件的困难。一个例外是区域，这是一种在脊椎动物眼中发现的ECM系统。该区域由数百至数千微米长的纤维组成，横跨晶状体和眼壁之间的无细胞空间。在本报告中，我们描述了一种机械技术，该技术利用区域的高度组织结构来量化其粘弹性并确定单个蛋白质组分的贡献。该方法涉及解剖固定的眼睛以暴露晶状体和区域，并采用引体向上技术，在监测其张力的同时均匀拉伸带状纤维。该技术相对便宜，但灵敏度足以检测缺乏特定区域蛋白或随着年龄的增长而产生的小鼠中区域纤维粘弹性特性的改变。虽然这里介绍的方法主要用于研究眼发育和疾病，但它也可以作为一个实验模型，用于探索有关弹性ECM的粘弹性性质以及外部因素（如离子浓度，温度和与信号分子的相互作用）的作用的更广泛问题。

脊椎动物的眼睛包含一个活的光学晶状体，有助于将图像聚焦在视网膜上¹。透镜通过一组精密的径向光纤悬挂在光轴上，如图1A所示。在一端，纤维附着在晶状体赤道上，在另一端，附着在睫状体的表面上。它们的长度范围从小鼠的150μm到人类的1 mm。这些纤维统称为^Zinn2的带状体，睫状状体，或简称为状状带。眼外伤、疾病和某些遗传性疾病可影响区域纤维的完整性³，导致其最终衰竭并伴随视力丧失。在小鼠中，纤维的核心主要由蛋白质纤维菌素-2组成，周围是富含纤毛素-¹⁴的地幔。虽然区域纤维是眼睛独有的，但它们与身体其他部位发现的基于弹性蛋白的ECM纤维有许多相似之处。后者由纤毛素-1地幔⁵覆盖，并且具有与带状纤维相似的尺寸⁶。其他蛋白质，如潜伏转化生长因子β结合蛋白（LTBPs）和微纤维相关糖蛋白-1（MAGP-1），与两种类型的纤维有关^{7，8，9，10，11}。带状纤维的弹性模量在0.18~1.50 ^{MPa12、13、14、15、16}之间，与弹性蛋白基纤维（0.3~1.2 MPa）^相当17.这些结构和机械上的相似性使我们相信，对区域相关蛋白质的作用的任何见解都可能有助于阐明它们在其他ECM弹性纤维中的作用。

开发这里描述的方法的主要目的是深入了解特定区域蛋白在遗传性眼病进展中的作用。一般方法是将野生型小鼠中带状纤维的粘弹性与携带编码区状蛋白基因的靶向突变的小鼠的粘弹性特性进行比较。虽然以前已经使用了几种方法来测量带状纤维的弹性力学性能，但所有这些都是为更大的动物的眼睛设计的^{12，13，14，15，16}。由于这些模型在遗传上是不可处理的;我们试图开发一种更适合小鼠小而细腻的眼睛的实验方法。

我们开发的用于评估小鼠区域纤维粘弹性的方法是我们称之为上拉测定^法4，18的技术，如图1直观地总结。下面详细介绍了上拉方法和对结果的分析。我们首先描述设备的构造，包括项目中使用的三维（3D）打印部件。接下来，我们详细介绍了用于获取和准备实验眼睛的方案。最后，我们提供了有关如何获取数据以确定带状纤维粘弹性的分步说明。在代表性结果部分，我们分享了以前未发表的数据，这些数据来自缺乏MAGP-119的小鼠的带状纤维的粘弹性特性，以及从年龄匹配的野生型动物获得的对照集。最后，我们总结了该方法的优点和局限性的一般性评论，并提出了可能阐明环境和生化因素如何影响ECM纤维粘弹性的潜在实验的建议。

所有动物实验均获得华盛顿大学动物研究委员会的批准，并遵守ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。

1. 专用零件的制造和设备的制造

1. 专用零件的制造
   1. 探头制造。以 图2A左面板所示的角度握住玻璃毛细管。从点烟器中取出一个火焰，从一端约2厘米处点燃，并保持在那里，直到末端弯曲90°，如图 2A的右面板所示。
   2. 示例平台制造。使用3D绘图软件，设计一个尺寸为30 x 30 x 5 mm的平台，其中包含直径为2.0，2.5和3.0 mm的半球形压痕，如图 2B所示。
   3. 探头支架制造。使用3D绘图软件，设计一个支架，用于固定毛细管探头并将其连接到显微操作器（见 图2C）。
      注:可根据通讯作者的要求，提供用于平台制造和探头支架制造的 STL 格式的示例 3D 文件。
   4. 负片镜头组件。如图1C和图1D所示，放置一个负圆柱透镜（焦距为-75 mm，高度和长度约为50 mm），以纠正因向培养皿中添加液体而引起的失真（添加流体会扭曲从侧面成像时解剖的眼睛的视野）。
   5. 将负片镜头粘在2槽底座之一上（有关底座上透镜的定位，请参见 图2D ）。
   6. 组装其余零件， 如图 2D 所示。
   7. 调整立柱的高度，使镜头几乎不会悬停在刻度上，并拧紧立柱支架中的螺钉。
2. 设备构造
   1. 在计算机上安装随秤、显微镜相机软件和电动千分尺控制器应用程序一起提供的日志记录程序。
   2. 将电动千分尺连接到伺服电机控制器，后者连接到计算机。启动电机控制器应用程序并编辑电机设置。
      注:下面列出的电机设置是在初步实验后选择的，该实验显示应力在10-20秒的时间尺度上放松。基于这一测定，我们选择了一种速度和加速度，允许电机在小于弛豫时间的时间内完成50μm的位移，但不会太短以避免震动样品。在这里，我们选择了大约5-10秒的位移时间。
   3. 将最大速度设置为 0.01 mm/s，将加速度设置为 0.005 mm/^s2。
   4. 将相机安装在检查显微镜中并测试相机成像软件。
   5. 将秤放在专用于设备的台式空间上。
   6. 将3D打印平台（从步骤1.1.2）粘合到培养皿中，并将2-3毫米的玻璃珠添加到其中一个孔中。将培养皿放在秤上，使磁珠位于平底锅中心附近。
   7. 将显微操作器上的手动千分尺更换为电动千分尺。
   8. 将两个4-40螺钉拧入探头支架。将探头支架连接到机械手， 如图1C所示。
   9. 如图 2A所示准备探头，将其放在探头支架内，弯曲部分朝下，然后拧紧螺钉。
   10. 将显微操作器放置在工作台上，使探头的尖端位于平台上的磁珠上方。将显微操作器贴在工作台上，以防止在实验过程中意外移动。
   11. 将侧显微镜放在桌子上，使珠子位于其视野的中心并聚焦。

2. 样品制备和数据采集

1. 眼睛固定和解剖
   1. 将野生型小鼠和 Magp1-null动物保持在相同的C57 / BL6J背景上。通过吸入_CO2 对1个月大或1岁的小鼠实施安乐死。
   2. 用细镊子取出眼睛，并将去核球体在4°C下在4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中过夜。如^所述，在固定过程中，眼睛中保持15-20 mmHg的正压6。
      注意:在雄性小鼠上进行实验，以控制眼球大小中可能存在的与性别相关的差异。正压确保球体保持充气，保持晶状体与眼壁之间的间隙，由带状纤维跨越。
   3. 在PBS中洗眼睛10分钟。使用眼科手术剪刀并在立体显微镜下工作，在靠近视神经头的眼睛壁上做一个全层切口。
   4. 将切口向前延伸到赤道，然后围绕眼睛的赤道周长。注意避免脆弱的睫状过程和相关的区域纤维。
   5. 取下地球背面，露出晶状体的后表面。
   6. 使用镊子从缓冲溶液中取出解剖的眼睛，并将其放在干燥的干湿巾上，角膜朝下。轻轻地将角膜拖过湿巾表面以使其干燥。
   7. 将3μL速溶胶水加入平台孔中，以容纳培养皿中的眼睛。
   8. 将盘子放在立体显微镜的舞台板上，以便可以看到带有胶水的井。
   9. 将眼睛从湿巾转移到含有胶水的井的边缘。然后，小心地将眼睛拖入孔中，并快速调整其方向，使镜片的背面最上方。
   10. 用干湿巾的一角轻轻擦拭镜片的外露面，将其擦干。
   11. 在50毫米培养皿的底部涂抹一点速溶胶，并将平台粘合到其上。
2. 测量区域粘弹性响应
   1. 打开秤，启动秤记录程序和相机软件。确保日志记录程序可以获取30分钟的数据，因为某些试验可以持续很长时间。
   2. 打开伺服电机控制器，然后在计算机上启动控制器应用程序。确保控制器设置为以 50 μm 为增量移动，使用的运动参数类似于步骤 1.2.2 中注释中概述的参数。
   3. 如步骤 1.1.1 中所述，在毛细管棒中创建 90° 弯曲。
   4. 将弯曲的毛细管滑入毛细管探头支架，然后拧紧固定螺钉。
      注意:为了尽量减少样品脱水，我们建议在眼部解剖之前或期间完成步骤1-4。
   5. 在毛细管尖端加入一小（~1毫米）UV固化胶珠。
   6. 使用机械手上的手动调整，移动毛细管探头的尖端，使其直接位于镜头的中心上方。从正面（通过目视检查）和侧面（通过显微镜相机）观察时，检查UV胶水的底部是否在镜头顶部居中。
   7. 在通过相机观察时，降低探头尖端，直到UV胶与镜头接触并覆盖其上表面的三分之一至一半。
   8. 使用低强度（~1 mW）、定向、近可见的紫外线（380-400nm）光源固化胶水。
      注意:这些规格足以在几秒钟内固化胶水，同时最大限度地减少诱导蛋白质交联的可能性。商用 UV 胶笔随附的 UV 光源符合这些规格。
   9. 将PBS溶液加入培养皿中，直到眼睛被液体覆盖至至少2毫米的深度。
   10. 将圆柱形透镜放在检查显微镜的前面，并尽可能靠近培养皿，不要触摸它。
   11. 同时启动日志记录程序和计时器程序。使用相机拍摄眼睛/探头的照片。
   12. 60秒后，再启动一次50μm位移，此后每60秒一次，直到实验完成，即直到所有纤维都断裂。请注意，由于实验过程中缓冲液蒸发，信号不会返回到基线水平。在数据分析过程中纠正读数中随后的漂移，如步骤2.2.14所示。
   13. 运行完成后，保存秤记录数据并将其导出为与电子表格兼容的格式，例如.csv格式。保存在运行过程中收集的镜头图片。
   14. 将数据导入电子表格。使用第一个和最后一个刻度读数来插值背景读数中由于蒸发而随时间变化的漂移（见 图3）。从每个时间点的读数中减去插值读数。
       注意:如果使用电子表格，则可以自动执行插值，方法是输入公式 = B2 - $B$2 +（$B$ 2 - @INDIRECT（"B"&COUNTA（B:B）））/（COUNTA（B:B）-2） * A2 在第一个刻度读数右侧的单元格中，然后将光标移动到单元格的右下角并将其向下拖动到最后一个数据值。该公式假定数据组织在一列中，第一个数据点出现在单元格 B2 中。如果需要，可以使用共同作者之一Matthew ^Riley4博士开发的准弹性粘弹性模型分析步骤2.2.14中处理的数据。

这里描述的引体向上技术为确定小鼠中带状纤维的粘弹性特性提供了一种直接的方法。简而言之，首先通过在生理眼内压下注射固定剂来保存小鼠眼睛。这种方法保持了眼睛的自然膨胀，并保持纤维适当的预张紧（在初步实验证明它不会显着改变纤维的弹性或强度后，固定被认为是可以接受的）。然后通过解剖去除小鼠眼睛的后部，以暴露晶状体和悬挂它的带状纤维。眼睛的前部固定在平台上，并放置在数字秤上的培养皿内。接下来，连接到显微操纵器的玻璃毛细管被粘合到晶状体的后表面。然后以50μm的增量升高透镜，同时记录刻度上的力。制剂表观重量的减少提供了有关拉伸纤维的力的信息。每次位移之后是持续约1分钟的平衡期，以观察位移引起的应力的任何松弛。最后，使用专为小鼠带状纤维的几何形状和用于测定的拉入方向设计的准线性粘弹性模型分析结果⁴。

使用我们的方法获得的典型粘弹性数据如图 3所示。曲线呈倒置（负），因为镜头上的提升力使秤上碟形/平台/眼睛组件的重量减少了等量。响应包括透镜50 μm垂直位移期间的每个瞬时力峰值，然后是寿命约为10 s的弛豫阶段。在牛带状纤维中也观察到类似的应力松弛¹²。瞬时和放松力的大小随着每一步增加到约1000秒（约800μm总位移），然后随着纤维开始失效而开始下降。区域故障在 1，500 s 时间点（~1.25 mm 总位移）之前完成。请注意，由于实验过程中缓冲液的蒸发，在晶状体从眼睛中释放后，曲线不会返回到初始读数。

图4 对比了 喜鹊-1 敲除小鼠（红色曲线）和年龄匹配的野生型动物（蓝色曲线）获得的反应。这些曲线已经过蒸发校正，倒置，质量的原始测量值（见 图3）现在表示为力（以mN为单位）。 Magp-1耗尽区（时间0-600 s）的初始粘弹性响应与野生型非常相似，这表明带的粘弹性特性没有因 Magp-1的缺失而显着改变。然而，与野生型纤维相比，纤维似乎以低得多的张力破裂。

为了说明该方法的可靠性，我们从多只动物那里收集了有关在纤维破裂之前施加在眼睛上的最大瞬时力的数据。结果如图 5 所示。尽管使用的样本数量相对较少（n = 5或6），但1个月大小鼠的数据显示出非常小的平均值（SEM）标准误差值，这表明可重复性很高。结果表明，两种基因型之间的纤维强度差异显著（p值= 2.4 x ^10-6）。图中未显示的结果还表明，野生型动物的断裂力随着年龄的增长而有细微但具有统计学意义的增加（p值= 0.024）。

上拉法还可以生成粘弹性参数的定量估计值，这些参数考虑了观察到的时间响应变化。 表 1 总结了 MAGP-1 数据的最佳拟合参数，这些数据是使用前面描述的准线性粘弹性模型获得的⁴。结果表明，MAGP-1的缺失和老化都会对区域纤维的某些机械性能产生非常显著的影响。

图 1:上拉方法的直观摘要。 （A）脊椎动物眼睛的横截面图，显示晶状体和悬挂晶状体的带状纤维。（B）通过向上置换晶状体（远离角膜）来确定带状纤维中粘弹性行为的一般方法。（C）被解剖的眼睛被粘在平台上的实际视图，其镜头被连接到显微操纵器上的玻璃探针向上拉。（四）整个装置的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2:各种部件的制造。 （A） 玻璃探头的制造。玻璃毛细管以一定角度固定，火焰施加在距离一端约2厘米的地方。在几秒钟内，毛细血管的末端开始下降。当毛细管末端弯曲约90°时，火焰被除去。（B）眼平台的制造。该零件采用3D立体光刻（SLA）打印机制造。它的尺寸为30 x 30 x 5 mm，包含三个半球形压痕，直径分别为2.0，2.5和3.0 mm，其中粘合了各种尺寸的解剖眼睛。（C） 探头支架的制造。该部件也是用3D SLA打印机制造的。它由两根直径为7.3毫米的正交杆组成。下部杆在外表面上包含一个1.5 mm孔和两个2.5 mm通孔，以容纳将毛细管探头固定到位的金属螺钉。（D）负极镜头组件。由侧显微镜捕获的图像由于培养皿和缓冲溶液的曲率而包含散光畸变。镜头组件设计用于补偿失真，允许侧显微镜以清晰的焦点捕捉图像。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:通过测定获得的典型原始数据。 显示的图形是用记录软件记录的，该软件以0.01 g的精度记录来自数字秤的数据。图形的左边缘（时间 0）在没有提升力的情况下反映样品的重量。Y 轴以 g 为单位表示质量。然后以50μm的步长抬起透镜，直到所有带状纤维断裂，培养皿再次完全停留在秤上。请注意，结束读数与初始读数偏移。偏移是由于缓冲溶液在实验过程中逐渐蒸发，并且可以在数据分析过程中进行解释，如步骤2.2.14中所述。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:野生型和MAGP-1缺陷小鼠的代表性区域力位移曲线。 该图比较了透镜在离散位移远离其平衡位置后获得的粘弹性响应。 MAGP-1 敲除（KO）小鼠的眼睛的反应跟踪年龄匹配的野生型动物的反应，直到敲除小鼠中的纤维过早断裂。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5:使用引体向上方法获得的 MAGP-1 KO与野生型小鼠和两个年龄的带状纤维断裂力。 显示的所有测量值均基于 n = 5 或 6 只眼睛，误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。缩写:WT = 野生型;KO = 喜鹊-1 淘汰赛。 请点击此处查看此图的放大版本。

表1:使用准线性粘弹性（QLV）模型获得的粘弹性性能。 使用专门为上拉测定和小鼠区开发的QLV模型分析如图 4 所示的数据扫描。图中显示了瞬时 （_G0） 和平衡 （G_∞） 刚度、弛豫时间常数 （τ） 和极限拉伸强度 （σ _f） 的最佳拟合参数。缩写:SD = 标准偏差;CI = 置信区间。

区域是一种不寻常的ECM系统，其中光纤对称排列，并且可以通过沿光轴置换眼镜片来相同地操纵。该空间也可以很容易地进入而不会破坏细胞，从而允许在接近其原始状态的环境中研究纤维。引体向上技术利用这种ECM演示来操纵来自小鼠的脆弱纤维，这是一个遗传上可处理的系统，并准确地量化其机械性能。这使我们能够检查关键ECM蛋白（原纤维化素-¹¹⁸，LTBP-24和此处报道的MAGP-1）对带状纤维的生物力学特性的贡献。我们对纤维蛋白-1缺陷小鼠的分析显示，缺乏纤维蛋白-1的带状纤维随着年龄的增长而减弱并最终破裂，导致眼睛内晶状体的位移（在人类中，这种情况称为异位lentis）。值得注意的是，晶状体脱位在马凡氏综合征患者中也很常见，马凡氏综合征是由FBN1基因²⁰突变引起的疾病。因此，引体向上测定为模拟小鼠中人类结缔组织病的各个方面提供了机会。在缺乏LTPB-2（一种被认为参与微原纤维发生的蛋白质）的小鼠中，我们能够证明在没有该蛋白质的情况下产生区域纤维，但在显着较低的应激下破裂并最终随着年龄的增长而分解⁴。这些结果表明，LTBP-2有助于纤维的寿命，而不是它们的合成。在目前的研究中，我们确定MAGP-1缺陷纤维具有与野生型纤维相似的粘弹性，但在较低应力下破裂，没有进一步与年龄相关的降解迹象。这与缺乏MAGP-1的纤维一旦发展就本质上较弱的模型是一致的。

我们注意到， 表1 中列出的极限拉伸强度是在假设纤维在中跨度某处断裂的情况下估计的。但是，我们不能排除光纤失效是由于与透镜表面或睫状体上的锚固点分离而导致的可能性。如果是这种情况，纤维的断裂拉伸强度可能高于 表1中列出的值。需要进行显微镜分析以区分这些可能性。这种分析远非微不足道，因为所涉及的纤维非常薄（宽度约为0.5-0.6μm），并且几乎与水的指数匹配，使它们基本上不可见。在没有这些附加信息的情况下，我们只能说 表1 中列出的极限拉伸强度代表其下限。原则上，检查力测量值是否因镜头被拉动的方向而异也很有趣。然而，在实践中，从前侧拉动晶状体需要去除虹膜，而不会损坏紧挨着下方的带状纤维。这种精确的解剖超出了我们目前用老鼠眼所能达到的。

该方法的相对简单性和其结果的高再现性是ECM机械性能比较研究的理想品质。此外，如本文所示，还可以使用上拉测定法，通过假设粘弹性模型并将时间曲线拟合到该模型上来获得粘弹性参数的绝对值。例如，使用标准的准线性粘弹性（QLV）模型，我们能够从野生型小鼠中提取瞬时（_G0）和平衡（G_∞）刚度，弛豫时间常数（τ）和最终拉伸强度（σ _f）的值，以及缺乏LTBP-24或MAGP-1的小鼠的条纹纤维。在这两项研究中，野生型动物获得的_G0和G_∞值从6.7 x ¹⁰⁴ Pa到2.3 x ¹⁰⁵ Pa不等，该范围与来自人类，牛和猪带（1.8 x ^105-1.5 x ¹⁰⁶ Pa）的更大纤维中发现的范围大致相当^{12，13，14，15，16}。物种之间的这种一致表明，这些是这些纤维的普遍特征，并让我们有信心用我们的方法提取有意义的粘弹性参数。

获得高质量粘弹性响应的关键步骤是将解剖的眼睛粘在平台上的方向（步骤2.1.9）。轻微的倾斜（小于10°）似乎不会对结果产生重大影响。超出此限制的实验可能会生成形状偏离 图 4 所示形状的曲线。例如，其中一些曲线可能具有两个宽峰，而不是一个。

理想情况下，本文中概述的程序将在没有眼睛固定的情况下进行，这限制了我们评估新鲜带状纤维的真实粘弹性参数的能力。然而，在我们的初步实验显示多聚甲醛固定样品和新鲜样品之间没有显着差异后，我们决定采用固定，因为它具有几个优点。正如议定书中提到的，使用固定组织有助于为引体向上实验保留纤维的天然拉伸。此外，我们发现固定促进UV胶水对眼囊的更大粘附，从而减少了探头在引体向上作用期间从晶状体上脱落的机会，就像新鲜样品通常经历的那样（探头脱落可以很容易地识别为力突然返回基线水平）。固定还防止了眼壁在拉力方向上的屈曲。尽管有这种局限性，我们的方法为确定蛋白质成分对带状纤维粘弹性性质的相对贡献提供了一种可靠的方法。

尽管我们迄今为止的工作主要集中在特定蛋白质的贡献上，但该方法可以很容易地用于研究纤维外部因素对其机械性能的影响。这些因素包括温度、pH值、钙浓度以及是否存在交联酶。使用我们的方法在差分模式下可以实现高精度测量，即通过用初始应力/应变预张紧带状纤维，然后读取外部条件改变时随之而来的张力差异。可以想象，其中一些干预措施可能会影响区域周围组织的弹性，从而产生与区域中产生的张力竞争的张力变化。需要使用分离的组织进行对照测量，以评估其与拟议实验的相关性。我们预计这种影响可以忽略不计，基于侧面摄像头的观察结果，连续组织表现为高度刚性材料，即使带状纤维完全拉伸，也基本上不会变形。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了NIH R01 EY029130（S.B.）和P30 EY002687（S.B.），R01 HL53325和Ines Mandl研究基金会（R.P.M.），马凡基金会的支持，以及华盛顿大学眼科和视觉科学系的无限制资助，用于预防失明。J.R.还获得了健康科学与药学院的资助，以支持该项目。