使用光学漫反射相关光谱，基于脑血流的休息状态功能连接

该协议演示如何使用定制的漫反射相关光谱仪测量人类前额叶皮层的静止状态功能连接。报告还讨论了实验的实际方面以及分析数据的详细步骤。

为了全面了解人脑，需要利用脑血流（CBF）作为造影源，因为它是与脑氧供应相关的一个关键血液动力学参数。基于氧合对比度的静息状态低频波动已被证明提供功能连接区域之间的相关性。提交的协议使用光学扩散相关光谱（DCS）来评估人脑中基于血流的静息状态功能连通性（RSFC）。基于CBF的RSFC在人前额叶皮层的结果表明，与两种皮质的区域间RSFC相比，区域内RSFC在左右皮质中明显更高。这种协议应该引起研究人员的兴趣，他们使用多模式成像技术来研究人脑功能，特别是在儿科人群中。

当大脑处于静止状态时，它显示功能相关区域的自发活动高度同步，这些区域可以位于接近或距离附近。这些同步区域称为功能网络^1,1、2、3、4、5、6、7、8、9。^{2,3,4,5,6,7,8,9}这一现象首先通过功能磁共振成像（fMRI）研究发现，该研究使用血液含氧水平依赖（BOLD）的信号，指示脑血^55，1010的氧合水平，也称为静息状态功能连接（RSFC）。RSFC的异常与脑疾病有关，如自闭症^11、阿尔茨海默氏症¹²和抑郁症^13。因此，RSFC 是研究难以执行基于任务的疾病患者的宝贵工具。然而，许多病人，如年轻的自闭症儿童，是fMRI评估的差劲候选人，因为它要求在^14，15,15年，它要求在密闭的空间内长时间留在密闭的空间内。光学成像速度快，可穿戴;因此，它适用于大多数病人，特别是儿科人口16，17，18，19，20，21，22，23，24。^{16,17,18,19,20,21,22,23,24}利用这些优势，功能性近红外光谱（fNIRS）可用于测量人类（包括儿科^{44、8、258,25}和自闭症患者^11）。该光谱可以量化大脑中的血红蛋白浓度和氧饱和度参数。

光漫反射相关光谱（DCS）是一种相对较新的光学技术，可以量化大脑血流，这是将氧气供应与代谢^{66、17、26、27、28、2917,26,27,28,29}相关的重要参数。与氧合对比度³⁰相比，DCS量化的光流对比度在大脑中具有更高的灵敏度。因此，利用DCS衍生的CBF参数来评估RSFC是有利的。

DCS对移动的血细胞很敏感。当扩散光子从移动的血细胞中散射时，这会导致检测到的光的强度随时间而波动。DCS 测量基于时间的强度自相关函数，其衰减率取决于光学参数和血流。这些值最终用于获取脑血流指数 （CBFi）。随着移动速度更快的血细胞，强度自相关功能衰变更快。因此，有关组织表面深处运动的信息可以从测量随时间^,推导^{27、31、32、33、34、35。,31,32,3334,35}DCS是一种与广为人知的fNIRS技术的补充，它测量血液氧合^{17，36。17,}由于fNIRS和DCS都是光学脑成像技术，在毫秒范围内具有高时态分辨率，因此光学成像设置对运动伪影的敏感程度远不如fMRI。它们还成功地用于儿科人群的功能性脑成像，包括¹⁶岁的婴儿。以前，表面血流测量已经用于评估RSFC在临床前研究小鼠^37。在这里，血流参数用于量化9个健康成年人的RSFC作为概念验证研究^{38，39。38,}

在这项研究中，使用了商用FD-fNIRS系统和定制DCS系统（参见材料表）。内部制造的 DCS 由两个 785 nm、100 mW 长相干长度连续波激光器组成，这些激光器与 FC 连接器耦合，8 台单光子计数机 （SPCM） 连接到自动腐蚀器。还专门为该系统制作了一个自定义软件图形用户界面 （GUI），以实时显示和保存每个 SPCM 通道的光子计数、自相关曲线和半定量血流。³⁹该系统的零件通常用于DCS 16、17、31、32、40、42、43、44，所得结果也经过内部验证，并在最近的一项研究中使用。^{16,17,31,32,40,42,43,44}

该议定书得到赖特州立大学机构审查委员会的批准，在实验前，每个参与者都征得了知情同意。

1. 主题准备

1. 在开始对主体进行任何测量之前，请为 FD-fNIRS 和 DCS 系统预热至少 10 分钟（有关详细信息，请参阅第 2 节和第 3 节）。图1显示了使用紧凑型DCS仪器进行主体测量的示例。
2. 首先，使用磁带测量测量每个受试者头部的切口到内因之间的距离（图2A）。
3. 以 nasion 作为起点，使用墨迹标记标记到 inion 距离 10% 的位置。这表示 EEG 10/20 蒙太奇的 Fp1 和 Fp2 之间的点（图 2A）。
4. 使用 EEG 10/20 帽（参见材料表），调整盖，使标记点介于 Fp1 和 Fp2 之间。
5. 标记 Fp1 和 F7（左皮层）之间的点和 Fp2 和 F8（右皮层）之间的点。这表示上前额皮层和双面皮层（DLFC）之间的界限，以及左半球和右半球的DLFC和下部前额皮层（IFC）之间的界限（图2A）。
6. 使用 3D 打印探头，将多模光纤 （MMF） 放置在新标记的点（图 2C上的点"S"），并将每个光纤连接到 785 nm 激光光源（图 2B，C）。
7. 将单模光纤 （SMF） 放置在距离 MMF 2.75 厘米的地方。应在 DLFC 上放置两根光纤（位置"DLFC，1"和"DLFC，2"），另一根位于国际金融公司（位置"IFC"）。SMF的位置在皮层的每一侧被复制，总共六个SMF（图2c）。
8. 在皮层两侧的位置_"Ds"处将另一个SMF 1厘米放在叶皮层（用于检测头皮血流）处，并将每个SMF连接到单独的光子计数机（图2C）。

p 类="jove_title">2。FD-fNIRS 设置和校准

1. 关闭所有灯并打开 FD-fNIRS 系统，以便为校准做好准备。
   注意:作为一般预防措施，不要直接查看光源和光纤输出，因为这可能导致眼睛损伤。使用红外传感器卡 （材料表）.
2. 避免探测器不必要地暴露在房间光照水平下，以保持无噪音操作，并避免损坏探测器。
3. 通过打开系统电源，使其运行至少 10 分钟（最好为最小 20 分钟，最大 1 小时，以实现最佳精度和稳定性），打开灯、打开调制和检测器电压，使光源和探测器预热。
4. 运行基于 GUI 的数据采集软件。通过按下"自动偏置"按钮，调整探测器增益，通过连接传感器并将其固定在校准幻像（基于已知光学特性的聚二甲基硅氧烷幻影，参见材料表）上实现最佳信号。如果超电压警告闪烁，则降低增益。
5. 调整探测器增益以获得最大信号后，断开探测器中的一个源光纤，并验证相应源光纤的直流电流 （DC） 是否小于每个测量周期的 20 个计数。如果大于此值，则探测器⁴⁵中可能会泄漏过多的房间光线。如果是这种情况，系统应关闭电源，则应阻止/移除房间内的任何多余的光线，并重复步骤 2.4_2.5。
6. 验证来自每个源和探测器的正确信号电平。系统将其定义为每个测量周期的 100 计数和低于 1，500 计数。
7. 通过按下 GUI 中的"校准"按钮来执行校准。系统将测量并应用校准系数，以正确测量已知幻像的光学特性。这些校准系数被保存并自动应用于体内测量。
8. 记录校准数据，这些数据将在标准幻像上提供系统性能记录。

3. DCS 设置

注意:作为一般预防措施，不要直接查看光源和光纤输出，以避免潜在的眼睛损伤。使用红外传感器卡（参见材料表）。

1. 避免不必要的探测器暴露（即房间灯），以获得自相关曲线的准确原始数据，并防止对探测器造成损坏。
2. 通过将 DCS 激光光源和 SPCM（参见材料表）切换到"开"位置，并允许它们至少运行 10 分钟（最好为最小 20 分钟和 1 小时，以实现最佳精度和稳定性），从而预热 DCS 激光光源和 SPCM（参见材料表）。
3. 运行基于 GUI 的 DCS 数据采集软件，该软件显示每个探测器的光子计数和半定量实时血流值。调整光纤位置、角度（光纤面应垂直于皮肤表面）和数据采集时间，以获得至少 5，000 计数/s的信号（对于足够的信噪比）和低于 1，000，000 计数/s（以避免损坏探测器）（图 3A）。
4. 通过检查监视器上显示的光子计数级别和近实时自相关曲线，从每个探测器验证足够的光子计数级别（从步骤 3.3 起）。
5. 通过检查监视器上显示的自相关曲线的 y 截取，验证足够的光纤接触，而不会产生任何环境光泄漏。最佳值为 ±1.5，不使用偏振器（图 3B）。
6. 通过拧紧弹性带，使其足够紧，足以抵抗运动，但足够宽松，以防止物体有任何不适，验证探头和测量值是否容易产生运动伪影。用户还应同时检查监视器上的自相关曲线，以便自相关曲线衰减为 1，延长相关时间（> 10 ms）（图 3C）。

4. 数据收集

1. 指示受试者在 8 分钟测量期间尽量减少任何运动。
2. 关灯，确保受试者坐在一个舒适的位置，闭上眼睛。
3. 使用将 FD-fNIRS 系统光学探头放置在 DCS 探头旁边的前额上，执行基准 FD-fNIRS 测量。然后，按 FD-fNIRS 获取 GUI 中的"获取"按钮。这些数据将提供静态光学特性、吸收参数和散射参数（μ_a ，μ's），_s用于动态光学参数CBFi^17、20,20的定量。
4. 完成 FD-fNIRS 测量后，通过按下 DCS 数据采集 GUI 中的"运行"按钮，开始对光学 DCS 测量数据采集数据。收集数据共 8 分钟，最大集成时间为 2 秒（根据每个主体的信号噪声比，首选较少）。
5. 如有必要，在初始实验的 1 小时内重复实验，或在一天的类似时间重复实验，以减少外部变化，如疲劳、兴奋剂或温度。

5. 数据分析

1. 对于FD-fNIRS数据，提取由斜率^,方法^,,,46、47、48、49、50、51、52、53处理的光吸收和散射特性^{,525146,47494850}（μa，μ's）。_a μ'_s^,53
2. 对于 DCS，由于需要后处理，因此将八个通道中的每个通道的自动关联原始数据导入数据分析软件。
3. CBF相关参数量化在最近的评论^{66，27，5427,54}中详细。简单地说，从规范化强度自相关函数（g₂ [r，]）中提取正态漫射电场时态自相关函数（g₁ [r，]），使用 Siegert 关系:g₂ （r，*） = 1 = |g ₁ （r，*）². .
   注: * 是一个常量，^{与检测到的空间}模式数成正比^{6、17、,27、,55、56，}范围从 0 到 1， 并通过拟合（规范化） 电场自相关函数 g₁获得。
4. 要从拟合器中获取与血流相关的参数 （#D_B），请使用 g₁^{6、27、5427,54}的分析解决方案，并将数据与模型或衰减率进行拟合:⁶
   方程一
   注:在上面的方程中，k_o是介质中的光波数，α 是一个与组织血量分数成正比的因子，D_B是有效的布朗系数。*D_B可定义为血流指数（BFI）6、54或CBFi^{6,54 17。}在这里，使用CBFi。
5. 使用从 FD-fNIRS 获得的光学参数适合模型。适合的主要参数是 CBFi 和 α。
   注:图 3A显示了足以进行分析的代表性数据。如果 （1） 自相关函数明显低于 1.5 （μ lt; 0.5） （即，在图 3B中，函数为 ±1.2，*< 0.2，由于房间光线泄漏），或者 （2） 自相关曲线在较长的相关时间（> 10 ms） 内不会衰减为 1（例如，在图 3C中，其中运动伪影（如头部或探针移动）导致数据不可用）。
6. 使用二阶多项式拟合来消除量化结果的趋势，以去除慢漂移（图 4A）。
7. 使用通带为 0.009-0.080 Hz 的零相二阶巴特沃斯滤波器来消除任何不需要的大脑频率，如迈尔波（图4A）。
8. 使用线性回归根据短距离测量从每个通道获取残差，以去除皮层两侧的表面头皮信号（图4B）。
9. 计算 Pearson 每对通道之间的相关系数，以确定大脑区域之间的静止状态功能连接（图 5）。
10. 使用 Fisher Z 变换将相关值转换为 z 值，并执行t-test以获取 p 值（图 5）。使用假发现率 （FDR） 进行多个比较校正。

使用DCS测量功能连接的可行性被成功消除^39。测量了九个受试者前额皮质的休息状态功能连接。结果显示，左侧区域区域（0.64 ± 0.25）和右侧 （0.62 = 0.23） 皮质的相关性较高， 与左侧区域间区域（0.32 = 0.32）、（0.34 ± 0.27）和右侧（0.34 ± 0.29）、（0.34 ± 0.26）皮质相比。（图5）。还进行了功率为0.8和显著性水平为0.05的功率分析，结果功率为0.82，样本大小为8（低于本研究分析的受试者数量）。

为了测试区域间 RSFC 和区域内部 RSFC 之间是否有显著差异，使用 Fisher Z 变换将相关值转换为 z 值，然后执行 t 检验以比较两个皮质的区域间和区域内 RSFC。这导致 p 值为 ±0.0002，表示在以前的 fNIRS 研究^8、,25（图5）中证明的显著差异。为了确定对称大脑区域（左和右皮质）之间是否有任何差异，进行了 t 测试。这导致p值为>0.8，表示皮层两侧的相似大脑区域之间没有显著差异。

图1:实验设置。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:探针原理图和放置。（A）如 EEG 80-20 系统图所示的探头位置。（B）带有被摄制件所佩戴的光纤的 3D 打印探头的示例。（C）多侧前额皮质（DLFC）和下部前额皮质（IFC）中探测器（D）和源（S）位置的CAD模型。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:在同一源探测器分离时，使用同一区域中的探测器进行代表性数据样本。显示的是相对于滞后时间 （*） 的自相关曲线 （g2）。（A） 当探头具有足够的接触时的数据，显示高计数且非常适合分析模型。（B） 数据（夸大），环境光泄漏到探头中，通过较低的 y 截距 （beta） 观察到。这通常是由于接触不良和背景光强的组合，需要进行调整。（C） 数据（夸大）与运动伪影，而 g2 曲线是平均。请点击此处查看此图形的较大版本。

图4:分析从一个主题获得的代表性数据。（A）每次处理步骤后功率频谱的图。（B）一个例子，显示短距离通道（黄道信号）回归前后某一通道上正常血流信号的时间序列。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 5:在所有受试者的前额前皮质中静静状态功能连接。左皮层（0.32 × 0.32）、（0.34 × 0.27）和右皮层（0.34 × 0.29）、（0.34 × 0.26）的区域间区域（DLFC₁-IFC 和 DLFC₂-IFC）的组平均值。左皮层（0.64± 0.25）和右皮层（0.62~ 0.23）区域内区域的组平均数。错误栏指示所有主题的 SD。t-测试显示，p = 0.0002 时，两个皮质的区域内和区域间 RSFC 之间的差异显著，而左右皮层之间没有显著差异（t-test = p > 0.8）。错误发现率 （FDR） 用于多个比较校正。请点击此处查看此图形的较大版本。

为了确定由DCS测量的CBF是否准确检测到RSFC，检查了大脑中具有已知RSFC特性的两个区域。DLFC 区域之间以及 DLFC 和 IFC 之间的功能连接假定存在^{57、58,58、59}。^,选择左和右两个站点之间的连接，因为区域内连接通常较高。此外，IFC和DLFC之间的连接被选择，因为区域间连接已知较弱。

DCS 技术显示 DLFC 区域内的连接性较高，但 IFC 和 DLFC 区域之间的连接性较低，这与 fMRI 等其他方法进行的类似研究一致。这些结果证明了DCS作为评估人类RSFC的非侵入性手段的潜力。当与其他成像模式（如fNIRS）相结合时，对自闭症等神经元疾病进行准确描述就变得可行。虽然同时测量fNIRS和DCS仍然是一个挑战，但已探讨几种方法来解决这个问题，^包括19、20、21、23、27、28、60、61、62、63、64、65。^{,20,21,23,27,28,60,61,62,63,64,65}在一项试验性研究中，选择了分离的、更轻的DCS探头，以更好地接触。将来，可以改进探头设计，将 fNIRS 光纤插入 DCS 光纤旁边，并且光源可以按顺序照明，如前所述。总之，DCS将作为其他技术的补充，并成为对年轻和残疾患者大脑功能进行非侵入性评估的有用工具。

作者声明没有相互竞争的财务利益。

作者感谢俄亥俄州第三前沿对俄亥俄成像研究和创新网络（OIRAIN，667750）和中国国家自然科学基金（第81771876号）的财政支持。