肾上腺腹动脉瘤的猪模型

这种新颖的模型使用气球血管成形、乳化酶/胶原酶灌注、局部乳化酶应用和口服化合物β-氨基丙酮给给，在猪体内创建健壮的肾上腺主动脉瘤，从而干扰胶原蛋白的交联。

研究腹部主动脉瘤的大型动物模型是稀疏的。该模型的目的是在猪中创建可重复的、临床上有意义的肾上腺主动脉瘤 （AAA）。为此，我们使用气球血管成形剂、乳化酶和胶原酶以及一种称为β-氨基丙酸酯（BAPN）的赖氨酸氧化酶抑制剂的组合，创造出具有临床意义的肾上腺主动脉瘤，类似于人类疾病。

未铸造的雄性猪在手术前喂BAPN7天，以达到血液的稳定状态。进行中线腹腔切除术，对肾上腺主盘进行圆周解剖。在动脉瘤诱导之前，结合气球血管成形、乳化酶（500单位）/胶原酶（8000单位）灌注和局部乳化酶应用，记录初始测量。猪每天喂食BAPN，直到术后第7天、14天或28日的末期手术，此时测量动脉瘤，并采购组织。BAPN – 手术猪与单独接受手术的猪进行比较。

用BAPN和手术治疗的猪在第7天的平均主动脉扩张率为89.9%~47.4%，第14天为105.4%=58.1%，第28天为113.5%=30.2%。单独接受手术治疗的猪的动脉瘤比BAPN&手术动物在第28天要小得多（p <0.0003）。BAPN+手术组具有末期动脉瘤病的宏观和免疫组织化学证据。

临床上重要的肾上腺AAAA可诱导使用气球血管成形，乳化酶/胶原酶灌注和局部应用，辅以口服BAPN。该模型创建具有人类疾病特征的大型、具有临床意义的 AAA。这对阐明AAA发病机制和测试治疗AAA的新型疗法和设备具有重要的意义。该模型的局限性包括猪摄入的BAPN变异、乳化酶灌注质量和BAPN成本。

根据疾病控制中心（CDC），主动脉瘤（AA）是美国的主要死亡原因，并代表一个重大的疾病^负担1。主动脉瘤被定义为血管流明离散部分的扩张率^{超过50%2。}腹部的AA子集，称为腹部主动脉瘤（AAA）是一个日益关注的问题。AAA保持临床沉默，直到即将破裂或解剖，急性发作，严重的腹痛一般是唯一^{的症状3，4。}AAA的破裂几乎总是致命的，死亡率^为90%5。开血管手术或血管内手术是患者唯一的治疗选择，可以是一个高度病态的程序。重要的是，AAA是少数没有治疗医学治疗的心血管疾病之一。

迄今为止，关于AAA发病机制的大部分研究都集中在啮齿动物模型上，使用乳酸酶（一种在主动脉介质中发现的能降解的酶）来诱导动脉瘤。^然而，由于主动脉结构变化和造声体变化受限，小动物模型对人类动脉瘤病的临床可翻译性受到限制。由于解剖学和大小相似性，猪循环系统与人类生物学的关联性优于啮^{齿动物8。}大型动物模型允许进一步了解疾病过程的细胞机制，可用于开发大型哺乳动物治疗剂量的新型治疗方法，并测试机械修复装置，这在小型动物模型中是不可行的。此外，啮齿动物模型的急性性质不能复制人类动脉瘤病的慢性和病理特征。

乳化酶和一种称为β-氨基丙酮（BAPN）的化合物的结合，通过制造更大且包含慢性动脉瘤疾病后遗症的动脉瘤，包括壁画血栓、解剖和^破裂9，彻底改变了鼠AAA模型。BAPN是溶酶氧化酶的抑制剂，它是胶原蛋白交联所必需的，是主动脉^{壁10、11、12}的关键成分。莱西尔氧化酶活性随衰老而降低，鉴于年龄的关联和复杂AA的慢性性质，BAPN具有实验性^{模仿9、13、14}老化影响的巨大潜力。与AAA的替代大型动物模型不同，使用BAPN及其在亚急性环境中复制慢性病的能力提供了新的优势。与其他已建立的猪AAA模型相比，该模型创造了具有末期疾病特征的最大动脉瘤，结果已经发表在8，11，15。

在赋予某些优势的同时，需要大量资源和投资才能成功地完成这一模式，从而可能吓阻一些调查人员。这些资源包括进入手术室、合格的外科医生和麻醉提供者、动物住房和兽医人员，以协助术后护理。此外，对于某些实验室来说，BAPN 的成本可能非常昂贵。

很少有大型动物模型来研究AAA形成的复杂病理生理学，并转化为人类疾病。AAA的大型动物模型对于帮助评估人类疾病新技术和治疗方法的可行性至关重要。因此，本研究的目的是为猪的晚期肾上腺AAAA创建一个可重复的模型。使用BAPN和乳化酶猪模型的理由是通过在急性或亚急性环境中模仿人类动脉瘤病的慢性性质和后遗症，更好地了解AAA的病理生理学，以及测试AAA的新型疗法和设备治疗。

动物协议由弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准（第3848号）。

注:此模型以前曾由Cullen等人发布，是Hynecek等人描述的修改后的协议。

1. 动物

1. 在实验中使用重量为20-30公斤的非铸造雄猪。
2. 为了最大限度地增加摄入的基于重量的BAPN剂量的比例，为猪提供标准菜和0.15克/千克的BAPN与全脂纯酸奶或湿狗食品混合的分餐。在指数手术前7天开始BAPN管理，在血液中实现稳定状态，并在术后过程中每天进行。
   注:如果大量摄入，BAPN会有许多副作用。每当与喂食 BAPN 的动物互动或处理 BAPN 时，应佩戴人员的隔离预防措施，包括帽子、长袍、手套和鞋套。
3. 在手术前一天晚上，使猪每os （NPO）零。

2. 麻醉

1. 诱导一般麻醉（GA），使用瓷砖胺-佐泽平6毫克/千克，木拉津（2毫克/千克），和阿托品硫酸盐（0.04毫克/千克）在肌肉内施用。
2. 使用标准内切管 （ETT） 和米勒刀片对猪进行插管。
3. 使用耳静脉中的 16 或 18 号 IV 进行外围静脉注射 （IV） 访问，并用胶带固定到位。
4. 将 ETT 连接到麻醉机，并使用吸入的电胶（0.2 mg/kg）维护 GA。
5. 应用心电图 （EKG） 引线和脉搏血氧仪在手术期间监测生命体征。在病例开始时进行口腔温度。在猪的从属部分放置电烧垫。
6. 确保您的一名工作人员持续监控并定期记录生命体征，以确保猪适当稳定、通风和含氧，并识别并适当干预在手术。

3. 外科技术

1. 使用无菌纱布、波维多-碘和70%异丙醇对手术区域进行灭菌。以通常无菌的方式把猪垂下。在切口前采集血液样本。
   注:此时，所有设备（包括仪器、气球、电线等）必须无菌。
2. 使用十一刀片或博维电灼热，进行中线腹腔切除术进入腹腔。
3. 将腹部内脏头头转移到猪的左侧，以暴露腹腔。用湿蓝毛巾盖住肠道，避免干燥。做一个尖锐的切口进入后膜，允许进入劣质的维纳卡瓦（IVC）和肾上腺腹部主塔。
   注:在案件这一部分，双边识别和保护输尿管至关重要。猪的逆向解剖（包括输尿管的过程）严重地反映了人类的逆向解剖，下面详述了细微的变化。
4. 从肾脏血管中解剖主动脉，低于主动脉三毛。注意避免IVC和腰动脉损伤。一旦整个肾上腺主动脉暴露，使用卡钳测量肾上腺主动脉中间部分的主动脉直径。
   注:与人类不同，猪有主动脉三毛，而不是分叉。
5. 识别肾上腺主动脉前部分的胆管动脉，通常位于主动脉三毛化处近几厘米处。这条动脉在人类中不存在。解剖、夹紧和横断这条动脉。此时，静脉注射5000单位未分分硫酸肝素。
6. 用0.018的不锈钢丝导管从微穿针引入器组，将胆管动脉制成。用 5 法语 （Fr） 和 7 Fr 引入器连续在导线上拉长动脉。
7. 将 7 Fr 引入器留在原位，将 0.018 导线替换为导线中的 0.035，然后拆下 7 Fr 引入器，确保在移除引子时用手指在导引位上进行窒息。在导丝中插入 0.035，直到遇到大约 30 厘米的导线保留或电阻。
8. 将一个16毫米的皮下透皮转光血管成形气球插入线内，并将其放置在解剖主塔的中点。在间歇性地用卡钳测量扩张主盘直径时充气气球，直到最大扩张率比基线测量大约 80%。
9. 再灌注10分钟后，交叉夹住主动脉，正好远至肾血管，接近主动脉三毛。识别并夹紧先前解剖的腰椎，以将肾上腺主盘与系统循环隔离。这一点很重要，以避免系统性灌注的乳化酶，这可能导致在急性术后期出现败血反应。
10. 在导线上重新引入 7 Fr 引入器并拆下导线。用盐水冲洗隔离的主动脉段，确保不会泄漏液体。将乳化酶（500个单位）和胶原酶（8000单位）溶液连接到引入器，在持续10分钟的手动压力下将30 mL注入隔离主塔。应将整个 30 mL 的解决方案引入隔离段。
    注: 穿孔主动脉段应绷紧，不得从主动脉壁或罐位泄漏。容器环可以包裹，只是接近罐点，以确保没有电子酶逃逸。在10分钟内，可以观察到乳化酶/胶原酶溶液通过主动脉壁"哭泣"。
11. 10分钟后，用盐水从主动脉流明中灌溉溶液。取出引种器，并清除胆大血管桩。松开所有夹具（首先松开腰部夹，然后是远端夹具，然后是近端夹）。
    注:将钳位时间限制在10分钟内，以防止脊髓缺血。在交叉夹松开后，在胆囊动脉桩出血的情况下，进行修复缝合（5-0 聚丙烯）。
12. 浸泡 2 厘米 x 5 厘米的手术纱布，带 20 mL 未稀释的乳胶酶 （27 单位/mL），并环绕介入主塔 10 分钟。在用卡钳进行所有干预后，测量主塔。
13. 用盐水灌溉腹部，更换肠道，并关闭腹部三层。BAPN抑制伤口愈合，因此为了尽量减少伤口破裂和胎儿脱脂的风险，使用具有长时间吸收时间的缝合，并确保在每一层都明智地小小地咬组织。利用运行合成可吸收单丝 1 环聚二苯酚 （PDS） 缝合为筋膜，运行编织可吸收 2-0 缝合深皮后，和运行下切下可吸收单丝缝合 （4-0） 的皮肤。

4. 术后护理

1. 利用0.2毫克/千克皮下丁丙诺啡-SR治疗术后性麻醉。在前三个术后的日子里，每天评估每头猪三次，是否有疼痛和不适的迹象，如果发现，则服用额外的麻醉。
2. 在POD 1-3上施用术后抗生素（1克头孢菌素肌内）。
3. POD 3 之后的社会家庭动物。

5. 主动脉组织采购

1. 在 POD 7、14 或 28 上执行组织采购。
2. 如上文步骤 2.1-2.5 所述，诱导 GA。
   注:终端主动脉组织采购不需要无菌。
3. 5.3. 重新打开上一个中线腹腔切除术，认识到前腹壁粘着肠。反射肠道以暴露与上述步骤 3.3 类似的反坐膜和主塔。
4. 解剖主动脉，直到动脉瘤暴露，用卡钳测量动脉瘤段的外部直径。计算主动脉扩张 （%）使用以下方程: [（收获的肾上腺直径 - 初始手术的肾上腺直径） x 100%]。一旦达到测量，通过注射到IVC中施用致命剂量的五巴比妥-苯妥因（如欧特哈索尔）。
5. 将主动脉从三叉端解剖到上部主动脉，用未经治疗的主动脉的控制段切除动脉瘤部分。将样品放入液氮或形式中，用于进行管学评估。

所有统计分析均使用费舍尔精确测试或奇方格测试进行。数据值报告为均主动脉扩张 （%） = 标准偏差 （%）。统计显著性设置为 P < 0.05。BAPN 和提供乳化酶治疗的手术（手术/乳化酶）在第 28 天在猪中创造了更坚固和可重复的 AAA，而仅通过手术和乳原酶治疗（平均主动脉扩张 （%）= 标准偏差 （%）:113.5% 30.2% （n = 8） ，而 59.7% = 29.2% （n = 12）;P < .01），如图1所示。AAA 随着时间的推变而逐渐增大（平均主动脉扩张 （%） = 标准偏差 （%）86.9% = 47.4% （n = 4），105.4% = 58.1% （n = 5），113.5% = 30.2% （n = 8），分别在 7、14 和 28 天收获时间点，图 1。慢性动脉瘤疾病的证据在用BAPN和手术/电子酶治疗的动物中是明显的，包括宫内血栓和动脉粥样硬化（图2）。组织学评估显示，在BAPN治疗的猪AAA中，与单独手术/乳化酶相比，乳原碎片和胶原蛋白改变明显增加（图3和图4分别增加）。

图1:β-氨基丙酮（BAPN）治疗增加猪腹部主动脉瘤（AAA）大小。（A） BAPN = 手术/乳化酶猪在28天（113.5% = 30.2% 对59.7% = 29.2%）时，平均主动脉扩张显著高于非BAPN治疗（仅手术/仅酶）猪;P < .01）。（B） BAPN处理的猪在7、14和28天收获时间点分别显示平均主动脉扩张86.9%~47.4%、105.4%~58.1%和113.5%~30.2%。这个数字由Cullen^等人15号公布，经许可在这里转载。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:猪腹部主动脉瘤（AAA）的样本照片。（A）控制腹部主数（不使用BAPN或乳酶治疗）。（B）在手术后一天（POD）28号，经手术/乳酸酶治疗后形成，在POD28上，在POD28上形成AAA的BPN（C）内膜血栓，在POD28的手术/乳酸酶和BAPN治疗的动物中，在肾上AAA的肾上动脉粥样硬化。 请点击此处查看此图的较大版本。

图3:在β-氨基丙酮（BAPN）处理的猪腹部主动脉瘤（AAA）中增加艾氏蛋白分块。范吉森在肾上腺大头塔和上大头塔染色7天（A），14天（B）和28天（C）。极右，Elastin（黑色）碎片，由独立审查员在7天、14天和28天对肾上腺大数的测量。刻度条表示 500 μm;4 倍透镜物镜。*P < 0.05.这个数字由Cullen^等人15号公布，经许可在这里转载。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:胶原蛋白在β-氨基丙酮（BAPN）处理的猪腹部主动脉瘤（AAA）中发生改变。马森三色和范吉森染色在肾上腺大方和上拉面大方在7天（A），14天（B）和28天（C）。最右边，在7、14和28天由密度计单位测量的红外线壁内蛋白原蛋白（蓝色）含量与上重主主主肠的含量。刻度条表示 250 mm;4 倍透镜物镜。这一数字由Cullen^等人15号公布，经许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。

利用气球血管成形、灌注和局部乳液酶以及作为 BAPN 的饮食组合，在猪中创建了一种新的猪肾上腺 AAA 模型。利用该模型，具有慢性人类动脉瘤病毛质和病质特征的道道扩张达到>100%。该模型为进一步理解AAA的复杂病理生理学并将潜在的疗法转化为人类疾病提供了一个门户。

以前在猪中使用AAA的模型取得了适度的成功。Marinov等人单独使用乳酸酶灌注，并看到一些组织学的变化，包括乳酸破坏，但未能达到表型，定义动脉瘤（>50%扩张）¹⁶。鉴于猪主动脉的耐久性，需要不止一次的干预才能达到临床上显著的动脉瘤，最初由Hynecek等人使用乳化酶和胶原酶灌注和气球血管成^{形术的组合}来描述。他们看到平均主动脉直径为73%，以及动脉瘤疾病的成体变化，包括内皮损失、嗜中性粒细胞渗透和乳氨酸破坏。

然而，以前的模型并没有解决所有AAA模型的一个基本问题:如何在急性或亚急性环境中复制慢性疾病过程。大多数小鼠AAA的乳化酶模型在大约2周时显示扩张峰值，随后回归，而人类疾病则随着岁月的慢性变化而长期发展。这个问题的关键可能在于使用BAPN，一种防止胶原蛋白交联的莱糖氧化酶抑制剂。BAPN具有"老化"作用，并结合乳酶治疗，已被证明模拟慢性动脉瘤生长。在Lu等人的鼠模型中，在术后100天观察小鼠，并证明了终期AAA与血栓形成和自发^破裂9的证据。我们的猪AAA模型的新颖性和意义是在BAPN的使用，它复制这种慢性疾病的过程在亚急性设置和更可翻译的动物物种。与单独接受手术和弹性酶治疗的人相比，喂食的BAPN与气球血管成形术、弹性酶灌注和局部弹性酶应用相结合的猪表现出更健壮的动脉瘤，包括壁画血栓、动脉粥样硬化和破裂。仅通过手术和弹性酶治疗（图1）。该模型通过创建具有慢性疾病^后遗症的较大动脉瘤，在Hynecek等人以前的模型的基础上进行扩充和改进。

虽然BAPN是复制AAA的慢性所必需的，手术干预提供最初侮辱主动脉诱导动脉瘤形成。BAPN没有手术或乳化酶的使用已经检查，但没有表现出任何显著的主动脉^扩张11。对于未经手术训练的调查人员来说，通过腹腔切除术在猪中诱导AAA可能令人望而生畏。每一步都充满了潜在的并发症，从肠和输尿管损伤到动脉或静脉出血，需要修复到术后伤口感染。调查员必须做好应对突发事件的准备，才能将猪活到目标终点。需要真正的团队努力，包括经验丰富的外科医生精通腹部解剖学，提供特殊的麻醉，包括注意生命体征和液体状态，以及细心的术后护理。我们的团队已经经历了上述所有并发症，并采取相应行动，无论是修复肠切除术或腔部损伤或抗生素感染。然而，一个不可预见的并发症涉及BAPN对猪的切口伤口愈合的损伤程度。手术后约3周，一些猪的切口出现破裂，偶尔需要带回手术室进行修正和脱毛。建议在术后仔细监测切口以及多层闭合，以防止出现这种并发症。

手术的关键部分包括通过牛动脉对主动脉进行切除，鉴于其体积小，这可能令人沮丧。微针丝的使用帮助我们进行这种测量。此步骤至关重要，因为罐线允许进入气球和灌注管的主塔。在我们的经验中，灌注前的气球血管成形症至关重要，因为气球扩张假想地造成内皮中断，使乳酸酶灌注更容易进入主动脉介质。充分灌注被定义为主动脉的紧绷段，没有导管周围或主动脉壁周围液体的泄漏或逸出。实现充分灌注乳化酶，同时将总主动脉交叉夹紧时间限制在不超过 10 分钟，对于良好的动脉瘤形成至关重要，同时避免缺血并发症。在整个过程中，将总主动脉交叉夹紧时间限制在 20 分钟以下，并允许在气球扩张和乳液灌注之间留出足够的时间进行再灌注，从而避免了可怕的脊柱缺血并发症。如果未获得足够的灌注，则很可能从主塔的渗透段某处泄漏，通常是从解剖或逆行泄漏从灌肠部位的意外主肠。修复灌注段中的任何缺陷以允许充分灌注乳液酶至关重要。容器回路可以包裹，只是接近主动脉罐位，以防止乳化酶的逆行流动。任何腰动脉也应在灌注过程中暂时夹紧，以避免乳化酶进入系统循环，这可能导致猪的败血反应。

该模型的逻辑下一步包括测试AAA医疗的新疗法。如前所述，没有已知的医疗疗法来衰减或退退主动脉瘤生长，目前的明确护理涉及开放式手术或血管内科方法。先前的研究已经定义了前激细胞因子的作用，白细胞介素-1+（IL-1+）和白细胞介素-6（IL-6）在下降胸动脉瘤和AAA的发病机制中的作用，抑制这些受体可能为治疗这些疾病提供潜在的治疗途径^17、18、19。这些研究只在鼠模型中完成，因此下一步应该涉及大型动物模型。此外，大型动物下胸主动脉瘤是未来研究的另一个途径。由于胚胎来源不同，胸腔和腹动脉的壁组成存在内在差异，导致这两段^动脉瘤的病理生理学不同。

此模型有一些限制。首先，由于使用了多种干预措施，因此很难确定哪种干预措施对动脉瘤的形成贡献最大。实现充分乳化酶渗透主动脉段所需的压力量难以测量，并且可能会有所不同。这可能会影响进入主动脉介质的乳化酶量以及随后从一头猪到下头猪的动脉瘤形成量。我们目前正在探讨解决这一问题的战略。BAPN与猪的食物混合，猪在围手术期间的摄入量可能会有所不同，改变每头猪摄入的BAPN量。最后，这种模式需要大量的资源和投资才能成功。这包括手术室、外科医生和麻醉提供者、动物住房、术后护理和购买BAPN，这可能非常昂贵。在尝试此模型之前，每个实验室应仔细评估其资源和资金。

总体而言，尽管有一定的局限性，但猪AAA与慢性疾病的后遗症可以重复使用BAPN，气球血管成形，乳液灌注和局部乳液应用的组合。这对适用于人类疾病的转化研究具有重要影响。

没有

我们感谢安东尼·赫林和辛迪·多德森的知识和技术专长。

资金来源:
这项研究的资金由国家卫生研究院国家心肺血液研究所根据第1号奖提供。T32HL007849 和授予号R01HL081629-07 （G.R.U.） 和 R01HL124131-01 （G.R.U.）。