用于多光子显微镜的全正常分散飞秒光纤激光器的低成本定制制造和模式锁定操作

提出了一种用于在多光子显微镜、内窥镜和光医学中的潜在应用，构建一种定制低成本、模式锁定的飞秒光纤激光器的方法。这种激光器采用市售零件和基本拼接技术制造。

提出了一种构建定制低成本但高性能飞秒（fs）光纤激光器的协议。这种全正常分散 （ANDi） yttebium 掺杂光纤激光器完全使用市售部件制造，包括 8，000 美元的光纤和泵激光元件，以及 4，800 美元的标准光学元件和腔外附件。新加入光纤设备制造的研究人员也可能考虑投资基本光纤拼接和激光脉冲表征设备（63，000欧元）。对于最佳激光操作来说，重要的是提出了验证真与明显（部分或类似噪声）模式锁定性能的方法。该系统的脉冲持续时间为70 fs，中心波长约为1，070 nm，脉冲重复率为31 MHz。这种光纤激光器具有易于组装的光纤激光系统获得的最高性能，这使得该设计成为旨在开发紧凑和便携式 fs 激光技术的研究实验室的理想选择，从而实现临床多光子显微镜和fs手术。

固态飞秒（fs）脉冲激光器广泛用于显微镜和生物学研究。一个典型的例子是使用多光子激发 （MPE） 荧光显微镜，其中高峰值功率和低平均功率需要促进 MPE 过程，同时最大限度地减少光损伤机制。许多高性能固态激光器都可用于商用，当与光学参数振荡器 （OPO） 结合使用时，激光波长可以在较宽的范围内调谐¹。例如，商业振荡器-OPO 系统生成 <120 fs 脉冲持续时间（通常具有 80 MHz 脉冲重复率）和 >1 W 平均功率（从 680 到 1，300 nm）。然而，这些商业可调fs激光系统的成本是可观的（>200，000美元），固态系统通常需要水冷却，并且不能用于临床应用。

超短脉冲光纤激光技术在过去几年中已经成熟。商用 fs 脉冲光纤激光器的成本通常明显低于固态激光器，尽管没有上述固态系统提供的宽波长调谐能力。请注意，光纤激光器可在需要时与 OPO 配对（即混合光纤固态系统）。光纤激光系统的表面体积比大，可实现高效的空气^冷却2。因此，光纤激光器比固态系统更便携，因为它们的尺寸相对较小，冷却系统也比较简化。此外，光纤组件的融合拼接降低了系统复杂性和机械漂移，这与构成固态器件的光学元件的自由空间对齐不同。所有这些功能使光纤激光器成为临床应用的理想选择。事实上，全光纤激光器已经开发用于低维护^{操作3、4、5，}全极化维持（PM）光纤激光器对环境因素稳定，包括温度和湿度的变化以及机械振动2、6、7、8。

本文介绍了一种利用市售零件和标准光纤拼接技术构建经济高效的fs脉冲ANDi光纤激光器的方法。提出了脉冲重复率、持续时间和相干性（全模式锁定）的表征方法。由此产生的光纤激光器产生模式锁定脉冲，可压缩至 70 fs，重复率为 31 MHz，波长中心为 1，060 至 1，070 nm。激光腔的最大功率输出约为 1 W。ANDi光纤激光器的脉冲物理优雅地利用光纤固有的非线性极化演化作为可饱和吸收器2、3、9、10、11的关键成分。然而，这意味着ANDi设计不容易实现使用PM光纤（尽管已经报道了ANDi模式锁定的全PM光纤实现，尽管功耗低，ps脉冲持续时间^为12）。因此，环境稳定性需要大量的工程。下一代光纤激光设计，如Mamyshev振荡器，有潜力提供完整的环境稳定性，因为全PM光纤器件能够增加一个数量级的腔内脉冲能量，并提供显著减少的脉冲持续时间，使应用依赖于宽脉冲^{光谱13，14}。定制这些创新的fs光纤激光设计需要技术和光纤拼接经验。

1. 拼接单模光纤 （SMF）

注: 第 1 节包含拼接 SMF 的一般步骤。这是使用廉价纤维练习纤维接头的非必要但推荐的步骤。在使用更有价值的光纤材料之前，此步骤可确保拼接设备的正确性能。

1. 将第一根光纤分十。
   1. 使用光纤剥离工具剥离大约 30 mm 的光纤。对于易碎纤维（例如双层纤维），剃须刀刀片可用于小心剥离缓冲液。
   2. 使用不含绒的组织与乙醇或异丙醇清洁剥离的纤维。擦拭光纤时发出嗡嗡声，表示光纤足够清洁。
   3. 将纤维支架放在光纤夹上。确保刀片、切刀的纤维夹和纤维支架都清洁。含酒精的棉签可用于清洁拭子的这些部分。
   4. 小心地将光纤装入光纤支架中。将大约 25 mm 的剥离、清洁的纤维放在自由端，让夹板夹紧。
   5. 轻轻合上夹子上的纤维夹。为避免对光纤施加额外的张力，请重新打开并关闭夹子，以便释放张力。
   6. 按下"切割"按钮，切割器将自动切割光纤。
      注:为确保光纤保持清洁，在倾斜后，不应触摸光纤尖端。
   7. 将光纤支架转移到融合钳。使用钳子将切断的片件从纤维移到锐化器处理容器。
      注意:硬钳子和锋利的钳子尖可以破坏纤维。处理光纤的适当钳子应具有塑料的圆形尖端。
2. 将第二根光纤分十下。
   1. 在第二根光纤上用另一个光纤支架重复步骤 1.1。要拼接的两种纤维应与纤维钳内纤维支架相互对立的切块切开。
   2. 关闭钳子的盖子。
3. 融合拼接纤维。
   1. 设置融合钳上的参数，包括磁芯直径、模场直径 （MFD） 和包层直径。将对齐方法设置为夹紧。
   2. 按下启动按钮，拼接器将自动对齐。
      注: 可能会收到有关锥形不佳或大下角的错误消息。这通常是由于纤维在下一个下拉后被污染造成的。如果发生这种情况，请重复光纤分块过程。
   3. 按每个停止处的启动按钮以确认接头的质量。拼接将自动完成。
   4. 通过拼接器执行的质量控制检查以及使用拼接区域的摄像机视图检查接头的质量。良好的接头具有均匀的包覆边界和沿光纤的均匀亮度，因此看不到拼接的交汇点。
      注: 光纤拼接器通常包括光学元件，用于检查接头，并使用垂直于光纤的源来查看、成像和分析拼接接头，根据测量的几何形状、形状和光线折射来估计功率损耗。当然，这只是一个估计，但在大多数情况下，这就足够了。对于相同的光纤，拼接器将估计此损耗为 ±0 dB（即无可检测到损耗）。从下面描述的不同光纤接头的先前结果中，钳子对功率损耗的估计范围从 0.07 dB（拼接点 B 和 C，图 1）到 0.3 dB（拼接点 D）。这些估计很可能高估了由于不匹配的几何形状和不同光纤的折射而导致的损失，这些光纤错误地显示为缺陷对象。
   5. 打开钳外盖，然后打开其中一个光纤支架。在从拼接的光纤从拼接器中取出之前，不应打开另一个光纤支架。
   6. 作为一种选择，可以添加纤维套筒来保护接头。钳子上的加热器可用于将套筒模到纤维上。或者，也可以使用热风枪。
      注:如果两根纤维很长或附着在其他部件上，则应在裂断前将套筒放在其中一根纤维上，然后将其移动到拼接点。光纤套管的作用类似于电子电路中的热收缩管。它可用于保护拼接点免受弯曲或拉力的推动。纤维再涂层机可用于重新涂覆拼接点，以最大限度地保护接头点，使其受到机械损坏，尽管需要支付大量额外费用，因为如果设备不可用，则必须购买该设备。

2. 组装纤维部件

1. 用泵输入 <2> 将泵输出光纤拼接到泵信号组合器（参见光纤激光图，图 1）。
   1. 按照第 1 节将纤维切合并拼接。使用程序 BASIC I SP 的默认设置，但需要手动输入的光纤参数（2-A 和 2-B）除外。需要输入的拼接参数可在表 1中找到。
2. 将组合器输出 <3> 拼接到 Yb 掺杂有源光纤。
   1. 按照步骤 1.1 将组合器输出光纤进行分块 <3>。
   2. 将有源光纤的下交 <4>。
      注:由于有源纤维 <4> 具有八角形包层，因此不适合光纤开形器的 V 槽。因此，步骤 1.1 中描述的简单分块将产生相对较大的下角。因此，以下步骤概述了使用相同设备实现平断角的特殊协议。
      1. 按照第 1 节将活性纤维 <4> 和 6/125 SMF 拼接。此 SMF 稍后被移除，并且不会合并到激光中。因此，如果此下角的质量较差，则是可以接受的。对于此步骤，获取平面断角并不重要。
      2. 使用线切割机将 SMF 从拼接点切割约 2 厘米。
      3. 剥去 SMF 的整个长度，并将有源光纤剥离 0.5 厘米。现在，活性纤维用2厘米无缓冲SMF盖住。
      4. 如步骤 1.1.3-1.1.5 中的步骤那样，将活性光纤装入分管中。确保只有具有圆形包层的 SMF 被纤维夹夹夹住。
      5. 按照步骤 1.1.6 和 1.1.7 将活动光纤进行分块。因此，可进行操作。由于只有 SMF 位于 V 槽中，因此此下角将产生最小的下角。
   3. 按照步骤 1.3 拼接光纤。
3. 粗略测量来自有源光纤远端的总功率输出 <4>。
   1. 在距接头点 +lt;B> 的 ±3 m 处切割有源光纤 <4>较长的有源光纤可用于更高的输出功率，但由于腔长的增加，重复率会降低。
   2. 如步骤 1.1 所述，将末端的末端 <4C >
      注: 由于估计了下一步的功率测量，因此无需使用步骤 2.2.2 中提到的方法。
   3. 将光纤指向功率计，将光纤和功率计放在一起，无需物理接触。
      警告: 将光纤尖端太靠近功率计可能会损坏功率计传感器，因为光功率集中在传感器上的一个小点。为了避免这种情况，请使用最低可靠的泵功率。
   4. 读取功率计的功率输出。大（>80%）效率吞吐量表示在点 和
      注: 由于有源光纤的吸收以及步骤 2.3.2 到 2.3.3 中所述的耦合方法对功率计的效率低，因此发生一些功率损耗是正常的。
4. 将有源光纤 <4> 拼接到准直器的输入 <5>;。
   1. 按照步骤 2.2.2 将活动光纤 <4> 在末端 拼接到准直器上。
   2. 将准直器的输入 <5> 切至约 40 厘米。
      注:无源光纤（<5>）的长度不应太长（>40 cm），因为由于自相调制（SPM）和组速度分散（GVD）的增加，放大的脉冲在时间和光谱域内会大幅扩大跟随增益光纤（脉冲放大）。这些影响将增加脉冲压缩的难度。
   3. 按照步骤 1.1 和 1.3 将准直器输入 <5> 切合，并拼接有源和准直器光纤。
      注:双包光纤与 SMF 的接头可能比之前的接头质量更低。但是，实际性能仅取决于内核对齐，因为脉冲在内核内传播。
5. 第二个准直器的拼接光纤 <6> 与组合器的信号输入光纤 <7>
   1. 按照第 1 节将纤维切合并拼接。

3. 将光纤部件安装到光学表

完成光纤激光制造程序后，验证模式锁定操作至关重要。最佳fs脉冲生成和激光稳定性的特征如下:首先，输出脉冲可能充分具有步骤6中概述的仪器特征。激光振荡器的脉冲频谱输出应居中于 1，070 nm 附近，具有典型的猫耳或蝙蝠侠形状，指示 ANDi 脉冲物理¹⁵的数值模拟所预测的模式锁定（图 2A）。尽管特性谱是脉冲相干的优秀指标，但还需要进行额外的测试，以确保完全模式锁定、稳定性和预期的激光性能。作为模式锁定的进一步诊断，分别使用自动腐蚀器和射频频谱分析仪测量脉冲持续时间和脉冲重复功率谱。在模式锁定操作期间，两个测量均需使用单个不带底座的峰值。在自相关测量期间，可以调整光栅对以实现脉冲压缩。测量的脉冲持续时间为 70 fs（全宽半最大）（图2B）。这种斩波脉冲持续时间接近当前激光设计的估计变换有限压缩:转换极限是使用测量的脉冲频谱计算的。其次，通过持续监测平均输出功率和脉冲频谱，可以测试脉冲稳定性。当激光设置安装在具有振动阻尼的浮动光学表上时，功率漂移小于±3.5%，超过 24 小时（图 2C），无需主动冷却。这种稳定性水平足以进行许多成像实验。然后，系统保持稳定，并在断电后自启动一周以上。自由空间组件经历机械漂移，模式锁在几周后丢失，但模式锁定通常可以通过对步骤 6 中概述的波板进行细微调整来重新获得。

一旦验证了模式锁定，在实际的MPE和非线性显微镜实验中，使用简单的测试靶点和生物样本测试成像性能也很重要。例如，定制光纤激光输出可定向到商用激光扫描显微镜中，用于双光子激发（2PE）荧光成像（图3A）。请注意，腔外隔离器虽然有损，但对于防止显微镜光学元件的反射进入激光振荡器是必要的。这些后反射通常会在成像过程中中断模式锁定和荧光信号的生成。在这里，使用商业共聚焦激光扫描显微镜和带针孔设置为最大尺寸设置的除扫描探测器进行测试，以增加收集的荧光信号。显微镜的一个简单测试样本是荧光染料溶液的测量。建议的第一个显微镜实验是使用一组中性密度滤波器在脉冲功率调整期间测量荧光染料信号。这有助于验证荧光信号是否四度取决于传送到样品平面的激光功率（图3B），这是2PE的预期响应。接下来，可以使用非线性 2PE 组织自荧光（参见图 3C，未染色的固定盐水虾样本）以及胶原纤维和 2PE 外荧光染色剂的二次谐波生成 （SHG）（参见图3D，一个沾有罗丹胺 B 的新鲜切除的鸡组织标本）。作为对2PE的补充验证，收集了多色荧光微球测试目标的2PE高光谱图像与用商用二极管激光器线性激发拍摄的高光谱图像进行了比较（图4）。对单光子激发和2PE荧光光谱进行了分析，比较了商用连续波514nm和594nm激光器分别激发的两种荧光染料对应的两种微球颜色。定制激光激发的荧光光谱与商用连续波激光器（单光子激发）的光谱相同。总之，这些结果表明，定制fs光纤激光器产生的脉冲具有足够的峰值功率和均匀性，以产生2PE荧光和SHG。

图1:定制光纤激光和脉冲表征设置的原理图。编号的黑色行 1 和 2 表示泵激光输出。编号的黑色线 3+7 表示腔内纤维，每个纤维的长度在接头点之间以米为单位表示。未编号的黑色线条表示腔外纤维。十字 （x） 标记表示拼接点。红线是自由空间的光路。OSC 和光电二极管 （PD） 之间的粗黑线表示 BNC 电缆。使用时与 OSC 位置相同的 RF 频谱分析仪未显示在图中，因为 RF 频谱分析仪可能使用 BNC 连接器交换到 OSC 的设置中。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:激光表征的结果。（A） 与数值模拟相比，模式锁定操作输出脉冲的频谱。（B） 与变换极限的数值模拟相比，发声脉冲的强度自相关信号。（C） 在两次24小时稳定性测试中激光的输出功率。（改编自达武扎德^等人17）请点击此处查看此图的较大版本。

图3:MPE显微镜性能测试结果。（A） 定制光纤激光器的原理图，其输出将定向到商业共聚焦显微镜中。（B） 使用荧光染料溶液测量的对数图，显示MPE荧光信号作为激光输出功率的函数的二次依赖性。（C） 使用定制 fs 光纤激光的未染色固定盐水虾样品的 2PE 自荧光图像。（D） 使用定制fs纤维激光从刚切除的鸡组织中分离的红蛋白B染色细胞的SHG（青色）和罗丹胺B染色细胞的2PE荧光（洋红色）。刻度条 = 50 μm.（改编自 Davoudzadeh 等人^17），请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:使用定制fs光纤激光器与商用二极管激光器的单光子激发（1PE）比较2PE荧光。（A） 使用多个不同二极管激光器的光谱截然不同的微珠的多通道 1PE 图像（左;1PE 波长列在 nm 中。由 514 nm 二极管激光器（中）和自定义 fs 光纤激光（右）激发的相同珠子的荧光强度曲线。刻度条 = 50 μm. （B） 二极管激光器与定制 fs 光纤激光器激发的绿色（左）和红色（右）珠的标准化光谱。（改编自达武扎德^等人17）请点击此处查看此图的较大版本。

表1:泵激光光纤拼接点（A）以及三个腔内光纤拼接点（B-D）的参数摘要。在这里，光传播的方向是从左边的光纤到右边的光纤。L = 接头中的左纤维;R = 接头中的右纤维;MFD = 平均字段直径。

这里概述的协议综合了激光物理实验室几十年来常见的专业知识和专业知识，但许多生物医学研究人员往往不熟悉这些知识。这项工作试图使这种超高速光纤激光技术更容易为更广泛的社区所利用。ANDi光纤激光设计是成熟的，首先由怀斯和同事^{的开创性作品3}开发。然而，其他群体实施这项技术有时导致激光器不能正常工作的报告，这表明有必要进一步教育生物医学研究人员脉冲表征和模式锁定操作等非重要的方面。

请注意，定制激光制造和操作通常不适合不熟悉激光操作和安全的实验室。在尝试建造 4 级激光之前，激光安全培训和危险考虑至关重要。由于激光系统是开放的，因此有两个主要反射光束（来自压缩机格栅和腔内 PBS）和需要阻塞的其他光学器件的一些小反射。应将自由空间组件固定在稳定的光学表上，以保持对齐。相比之下，商业激光器始终为安全而封闭，并且通常使用自动对准机制，使其操作更轻松、更安全。

如前所述，此处介绍的定制 fs 光纤激光器可能是易于构建的系统的最佳性能，可最大限度降低材料成本。接头的设计和质量是激光效率、易于制造以及燃烧点损伤的鲁棒性的关键因素。低质量接头不仅降低了泵的输出效率，而且在操作过程中会产生热量，从而损坏腔体。要实现高质量的拼接，需要确保纤维切块和钳子清洁。如上所述，浸有酒精的棉签应用于定期清洁所有工作表面。此外，当出现大切角（>0.3°）时，强烈建议复用以提高拼接质量。

一旦模式锁定，系统将相当稳定，并在超过一周的时间内保持自启动状态。如果系统意外扰动或空间组件随时间的机械漂移，系统将失去模式锁定，但模式锁定激光通常可以通过稍微调整波板轻松恢复。为了保持稳定的输出，对有源光纤进行温度控制是关键。因此，该系统最好在空调房中使用，其附近空气流量最小。该系统相对不受小振动的影响。事实上，如果将系统放在无源阻尼光学表上，则机械振动的影响在时间和光谱领域都无法观察到。触摸振荡器的光纤组件会干扰模式锁定，但只需将光纤返回到其近似原始位置即可恢复模式锁定。

最后，fs光纤激光器的紧凑外形对移动临床系统的开发极具吸引力。（例如，基于移动购物车的系统）。虽然与固态激光相比尺寸较小，但此处介绍的定制光纤激光设计包含多个需要对齐的可用空间组件。这极大地限制了系统的移动性。可以用光纤组件模拟替换所有这些自由空间组件。未来的工作将包括开发新的全光纤激光设计，使用PM光纤来开发能够适应环境变化的系统。

作者声明没有相互竞争的利益。

我们感谢克罗宁-富尔曼博士和M.魏茨曼博士（奥林巴斯公司，美洲科学解决方案集团）在获取图像方面给予协助。这项工作得到了国家卫生研究院授予K22CA181611（到B.Q.S.）和理查德和苏珊史密斯家庭基金会（牛顿，M.A.）的支持。史密斯家族生物医学研究卓越奖（至B.Q.S.）。