细针吸入检测血管外胰腺瘤寄生虫

细针吸入是一种技术,通过这种技术,细胞从病变或器官使用薄针获得。吸气材料在显微镜下进行涂片、染色和检查,用于诊断或用于分子生物学、细胞学或体外分析。它便宜,简单,快速,造成最小的创伤。

细针吸入(FNA)是一种常规诊断程序,对医疗和兽医实践都至关重要。它包括细胞和/或微生物从可察觉的质量,器官或液化(液体积累在体腔)使用类似于用于静脉穿刺的常规针的皮面吸入。FNA收集的材料一般是高细胞的,检索到的吸气液然后被涂片、风干、湿固定、染色并在显微镜下观察。在临床环境中,FNA 是一种重要的诊断工具,可作为适当治疗管理的指南。因为它简单、快速、微创,需要在实验室和人力资源方面进行有限的投资,因此兽医工作者广泛使用,主要在国内,但也用于农场动物。在使用动物模型的研究中,FNA的优点是可以在同一动物中重复进行,从而通过在疾病过程中从肿瘤和器官/组织中收集细胞进行纵向研究。除了常规显微镜外,检索到的材料还可用于免疫细胞化学、电子显微镜、生化分析、流式细胞测定、分子生物学或体外检测。FNA已用于识别受感染小鼠的鼠群中的原生动物寄生虫锥虫,为今后在牛身上进行诊断提供了可能性。

细针吸入(FNA)被广泛用于诊断癌症和非肿瘤疾病,包括人类和家畜。这项技术已经标准化多年,并在许多教科书1,2中描述。

它主要由可察觉的质量、器官或输液体在空注射器上安装的薄针的皮面渴望组成,使用负压从^质量1、3中排出细胞或液体。针通常为 22 至 25 G(与针内径对应的量表),使用较大的孔针(例如 21 G)有助于增加细胞性,尽管这会产生过多的血液污染。针的长度取决于质量的深度,但 1 或 11⁄2 英寸通常用于表面质量。注射器通常为 5 到 10 mL,较大的注射器实现更高的真空,进而增加吸气率。非可察觉的深层质量也可以吸气,用更长的针头和图像指导(超声检查)。检索到的吸气物随后可以涂抹、风干、湿固定、染色并在显微镜下观察,以达到诊断 3(图1)。

这是一种简单、廉价、无痛和微创的技术,主要用于术前设置,用于在可察觉的肿地和器官(如淋巴结、甲状腺、前列腺甚至外部男性生殖结构)上实现诊断^1.除了作为诊断工具,该技术还可用于收集细胞用于其他目的,即细胞遗传学,电子显微镜(图1D),流细胞表征4,5 ^,6,7, 建立细胞培养⁸。临床实践中的一个常见例子是体外受精的精子检索9。

渴望可以在同一质量中重复几次,以获得多个涂片。在异质病变的情况下,例如,固体区域和囊肿空间,重要的是细胞从每个区域吸气。FNA收集的材料一般是高细胞的,在大多数情况下,这允许诊断疾病,而无需组织活检。特殊污渍,免疫荧光。免疫细胞化学(图1D)和分子技术也可在通过FNA获得的涂片中进行,例如,在无法仅通过形态学识别时识别传染性^病原体。表1和表2分别概述了FNA所需的一般应用以及所需的设备和用品的简要概述。

关于针穿刺用于诊断目的的第一份报告在阿拉伯医学的早期著作中进行了描述,但早在20世纪初,现代针吸气技术就被应用^了11个。值得注意的是,也许第一份报告,建议使用FNA诊断传染病是在1904年的一项研究,其中格里格和格雷报告从睡眠病患者淋巴结的针头愿望显示移动性锥^体12.作者报告说,在早期和晚期病例中,锥体存在,密度高于血涂片中,这些往往是罕见的^事件12。

目前对牛锥虫病的诊断依赖于对血液、淋巴或免疫诊断技术13、14、15中寄生虫的直接观察。我们之前已经表明,在实验锥虫瘤感染在小鼠,锥虫瘤布鲁比(T.布鲁西)有一个显着的对流肌组织¹⁶和一些外部男性生殖结构,即表皮^米斯17。寄生虫大量积累在这些组织的频闪^中16。

下文所述的议定书描述了活体小鼠FNA的详细分步技术程序,旨在达到存在于外部雄性生殖结构(睾度、表皮和表皮脂肪)中的锥体,然后常规细胞学和免疫染色特定寄生虫蛋白(VSG)16,17。在感染后6天进行吸入,应用的安全程序是通常为常规处理实验动物而建立的。对于免疫缺陷的动物(穿着蒸汽消毒袍、面罩、发帽、无菌手套,并确保随时采用无菌技术),需要采取其他措施,以减轻偶然性病原体的意外接触。

该协议中的所有动物实验均按照欧盟法规进行,并经分子研究所动物伦理委员会(iMM)批准(AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM)。iMM 的动物设施符合葡萄牙使用实验室动物的法律(第 113/2013 号法令),并遵循欧洲指令 2010/63/EU 和 FELASA(欧洲实验室动物科学协会联合会)准则和有关实验室动物福利的建议。

1. 小鼠外部雄性生殖器官的寄生虫渴望

注:精细针吸入(FNA)是在野生型雄性C57BL/6J小鼠,6至10周大,感染T.布鲁西通过腹内注射200μL的盐水与2000寄生虫如^前16所述。

1. 对于外部雄性生殖器官的FNA,将小鼠置于层流罩中,用75mg/kg氯胺酮+1毫克/千克麦地胺在盐水中注射200μL的腹内注射剂,麻醉动物。
   1. 用脚趾捏法确认麻醉。当腿部缩回的反射不存在时,将鼠标置于背回状态(图2A)。
   2. 仔细轻触睾片,评估大小和距离从上覆的皮肤。抑制食指和中指之间或食指和拇指之间的器官。将上覆的皮肤紧紧地拉伸到质量上,以进一步固定目标。用酒精湿巾清洁表面 (图 2A)。
   3. 握住组装的 22 G 针头和 5 mL 注射器,将针头插入目标,始终与柱塞处于静止状态(图 2B-C)。
   4. 将注射器柱塞缩回 4 mL 至 5 mL 标记 2-3 次,以施加吸力。以直线或沿几个不同的切线重定向器官内的针头,以增加有代表性的样本和瞄准小结构(如表皮)的概率。确保此过程温和,以尽量减少组织损伤 (图 2C-D)。
   5. 释放吸盘,然后拔下针头。请勿用缩回的柱塞重新拔合针头,因为这将导致吸气器吸入注射器的桶,并阻碍其恢复(图2E)。取针后,通过在穿刺部位用消毒纱布海绵施加压力来控制任何出血。
   6. 将注射器与针头断开,用空气填充,重新连接针头,然后轻轻地将针头内容物弹出到滑道上。将针尖放在非常靠近的地方,甚至放在幻灯片上,以避免溅出(图2F-I)。
   7. 每个器官/动物至少执行一次额外的吸入,以确保复制取样。
   8. 在盐水中注射200 μL的1mg/kg Atipamezole,恢复麻醉,并将动物送回其家笼进行恢复并观察,直到完全恢复。

2. 从进气材料中涂抹

注:在整个过程中使用手套,确保针头和注射器的安全处置。

1. 两步拉法
   1. 用非主导手拾起吸气滴的幻灯片,捏住拇指和食指之间的磨砂端(图3A)。
   2. 拿起第二张干净的幻灯片,即扩张器幻灯片,用占优势的手,用吸气滴将其穿过第一张幻灯片。将滑轨的光滑清洁边缘放在试样滑块上,角度约为 30°(图 3B)。
   3. 以一个轻、连续和稳定的运动向前滑动,以获得薄膜(图3C)。
   4. 休息幻灯片,使材料能够完整、快速的空气干燥(图3D)。不要热固定。用铅笔标记幻灯片的磨砂边缘。
      注:该协议可以在此步骤中暂停,并且污迹可以无限期地存储,直到准备好染色。

3. 污迹污渍

注:在整个过程中使用手套,并确保步骤 3.1.4 和 3.2.9 在烟罩内执行。

1. 吉姆萨染色协议
   1. 将幻灯片浸入含有 100% 甲醇的 Coplin 罐中 5 分钟(图 3E),修复风干污迹。
   2. 将幻灯片转移到含有 20% 吉姆萨溶液(在蒸馏水中稀释至 1/5)的 Coplin 罐中 30 分钟,或 10% 吉姆萨 10 分钟(图 3F)。
   3. 用自来水冲洗干净,用纸巾彻底干燥。
   4. 水平握住滑块,将一滴非水安装介质涂抹在涂片上。将盖玻璃边缘放在滑轨上,将其放下并轻轻按压以清除任何气泡。
2. FNA涂片中的免疫细胞化学
   1. 在室温下将100%甲醇中的风干涂片固定10分钟。
   2. 在带有 1 倍磷酸盐缓冲液 (PBS) 的 Coplin 罐中清洗幻灯片 5 分钟,每次使用新鲜的 1x PBS 重复此步骤 3 次。
   3. 从 Coplin jar 中取出幻灯片,擦拭多余的缓冲液,而不接触涂片,并用防水笔(材料表) 在涂片周围画一个圆圈。
   4. 水平握住幻灯片,将150 μL稀释原抗体溶液涂到每个涂片中,并在室温下孵育1小时。
      注:这里使用的主要抗体是非纯化兔血清抗T.布鲁比VSG13抗原(与许多T.布鲁布鲁斯VSGs交叉反应,在内部产生),在1xPBS中稀释在1:50,000。将适当的原抗体替换为免疫前血清(材料表),以评估二次抗体的非特异性结合,从而执行阴性对照。
   5. 用 1x PBS 在科普林罐子中清洗幻灯片 5 分钟,每次使用新鲜的 1x PBS 重复此步骤 3 次。
   6. 水平握住幻灯片,并将 150 μL 的市售马萝卜过氧化物酶/DAB 可视化系统应用于每个涂片。在室温下孵育30分钟(材料表)。
   7. 在 1x PBS 中洗涤 3 次 5 分钟。
   8. 将滑梯浸入含有哈里斯血氧素的科普林罐中。"用自来水冲洗干净,用纸擦干。
   9. 水平握住滑块,将一滴非水安装介质涂抹在涂片上。将盖玻璃边缘放在滑轨上,将其放下并轻轻按压以清除任何气泡。

FNA在感染T.Brucei的小鼠的外部男性生殖器官中,使用22G针头与5mL注射器和玻璃幻灯片进行涂片处理(图1A-C)。该方法简单但最佳的结果依赖于关键步骤:通过全身麻醉实现小鼠完全固定,并在整个过程中稳定器官(图2A-B)。吸吸被应用2-3次,针头重定向1-2次,以便对较小的器官和组织进行有代表性的取样:表皮和表皮脂肪。在将针头外化之前释放负压。针的流明和轮毂(约20μL)中所含的吸气用于产生2次涂片(图3A-C)。在针头在未释放吸力的情况下拔出时,材料被吸入注射器,无法回收。该过程成功重复两次,每个配对器官一次。干燥后,涂片进行湿固定,对锥体表面蛋白进行免疫细胞化学处理。

高质量的涂片(图4A-C)的特点是细胞密度良好的单层细胞,其中宿主细胞表现出保留的形态特征,从而能够识别其来源和相对组织彼此之间的比例。寄生虫是有效的免疫染色,可识别和可计数 (图4B)。图3D-F和图4C显示一例在受感染小鼠中出现围肠积液的FNA,该病例被吉姆萨染色,用于直接观察和诊断。

FNA 结果不佳或负 FNA 结果可能由于不同原因:(1) FNA 材料在幻灯片上表示得太少,且在样本中代表性不足;(2) FNA材料过多地表示在单个幻灯片上,造成过厚的污迹,影响细胞学评价;(3) 涂片时施加过大的力,细胞被破坏,导致大量裸核和DNA条纹(粉碎伪影);或(4)在涂片和细胞不分解时施加足够的力,导致分层层妨碍细胞形态特征的评估(图5)。

当我们比较FNA细胞病理学与组织病理学,即细胞与组织分析,拳头的优点是细胞形态得到更好的保存和细胞的相对比例和计数可以更好地评估(图6)。此外,免疫细胞化学比免疫组织化学更简单、更快、更容易优化,免疫组织化学通常在形式固定和石蜡嵌入组织中进行。

表1:目标、一般应用、优点和细针吸气的限制。

表2:细针吸入所需的设备和用品。

图 1:精细针吸入的工具和结果。(A) FNA针的理想直径为22至25 G. (B) 理想的注射器体积,以获得良好的吸气率为5至10 mL。(C) 清洁、干燥、无油脂玻璃滑动,带结霜标记区域,用于用铅笔书写和预涂(如果用于免疫组织化学)。(D) 使用吉姆萨染色(黑色箭头)、VSG 表面蛋白(白色箭头)免疫染色和传输电子显微镜下(块箭头)观察到的锥体体示例。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:显示小鼠外部雄性生殖器官(睾体、表皮和表皮脂肪)的细针吸入(FNA)的原理图。(A) 一旦动物被固定,先前组装的吸入器就会拾起。(B-C)将针尖插入目标器官。(D) 将注射器柱塞缩回 1 mL 至 2 mL 标记,重复 3-4 次,将吸力吸回。针尖也可以在靶中来回移动,同时施加吸力,以收集足够的材料。(E) 释放吸盘,然后拔下针头。(F) 从注射器中取出针头, (G) 将柱塞拉回.(H) 重新连接针头.(I) 通过快速通过注射器推动柱塞,将材料推到玻璃滑块上。为了避免溅片,请确保针尖非常靠近,甚至在滑道上。吸气滴放置在距离结霜标记区域边缘约 1 厘米的地方。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:涂抹制剂和染色。(A) 在拇指和食指之间握住幻灯片的一端(结霜区域)。(B) 将第二个滑轨(扩散器)的光滑清洁边缘放在试样滑轨上,正好放在材料滴的前面。(C) 以中等速度向前滑动一次,以获得薄膜。(D) 让幻灯片晾干,用铅笔标记幻灯片的磨砂边缘。(E) 用甲醇完成干燥修复 5 分钟(F ) 染色后,使用 20% 的吉姆萨溶液 30 分钟(或 10% 吉姆萨 10 分钟)。用水轻轻冲洗,完全干燥,浸入二甲苯中,并安装有水不溶性安装剂。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:从FNA获得的受感染小鼠外部雄性生殖结构涂片的微照片布鲁斯·布鲁西(A) 质量良好的直接涂片毛外观:材料被表示到离磨砂边缘约 1 厘米(黑点)的幻灯片上,在滑轨边缘(平行线)前涂抹并停止 0.5 厘米。(B) 感染第6天,对从外部男性生殖器官的FNA获得的涂片,对寄生虫表面蛋白(VSG)进行免疫细胞化学。许多寄生虫(箭头)被检测与小鼠生殖细胞(箭头)混合。DAB 与哈里斯血氧林反染。原始放大倍数:40 倍(刻度条 = 50 μm)。(C) 在感染的第21天,FNA的围肠液化后获得的涂片的Giemsa染色显示,许多寄生虫(箭头)与宿主(小鼠)细胞混合,在这种情况下,炎症细胞、巨噬细胞(箭)和淋巴细胞。原始放大倍数:40 倍(刻度条 = 50 μm)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:劣质FNA涂片。(A) 细胞涂片不良,代表质量或器官不足。(B) 非常厚的涂片.(C) 破碎的伪像,具有被破坏的细胞、裸核和DNA条纹。(D) 细胞的聚合层和分层层。DAB 与哈里斯血氧林反染。原始放大倍数:20 倍(刻度条 = 100 μm)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 6:感染小鼠表皮细胞学与动物的表皮细胞学与动物学的比较布鲁斯·布鲁西(A) 对应于FNA涂片和(B)4μm石蜡部分的微照片,在相同的放大倍数(20倍原始放大倍率,刻度条=100μm),两者都为寄生虫的表面蛋白(VSG)进行免疫染色。涂片显示大量寄生虫(箭头),具有保存完好的细胞形态,与适量的生殖细胞和很少的精子(箭头)混合。组织学部分显示了保存完好的组织结构 , 由表皮管与宫内 ( 箭头 ) , 以及大量寄生虫扩大表皮频地 ( 箭头 ) 的存在。DAB 与哈里斯血氧林反染。原始放大倍数:20 倍(刻度条 = 100 μm)。请点击此处查看此图的较大版本。

细针吸入(FNA)是一种广泛用于诊断人类和家畜疾病的方法。这项技术已经标准化多年1,2,它利用小孔针吸出细胞或液体从明显的质量或器官1,3。吸气通常涂抹在玻璃幻灯片上,并染色进行显微观察,以求得到诊断,但该技术也可用于检索细胞用于其他目的^4、5、6^、7,8,9.

该过程快速(对于有经验的研究人员而言,每只小鼠只需 5 分钟),并发症的风险最小,类似于接受简单的静脉穿刺时发生的风险。因此,对于可察觉的FNA,麻醉只适用于敏感的解剖位置,或者当动物的良好固定和器官或质量的稳定被吸入对最佳结果至关重要时。对于小型实验室动物来说,这种情况经常发生,因为一方面用安全和有效的限制小啮齿动物,另一方面确保最佳进入该地区进行吸入,如果没有麻醉,就很难实现。短期麻醉在大多数情况下是足够的,尽管如此,在鼠标良好的FNA是必要的。良好的固定性可最大化获得代表病变细胞成分的吸气的机会,并在施加负压时将针头外化的机会降至最低。

虽然程序本身非常简单,但协调应用和释放真空是最关键的步骤。插入针头后,注射器的柱塞被缩回,以达到受控的真空(吸力),并且针头只有在释放负压后才能通过释放柱塞从质量中取出(图2);否则吸气被吸入注射器的桶中,然后很难恢复。另一个非常重要的步骤是准备高质量的涂片。涂片的方法有多种,但无论采用何种方法,在将材料放在玻璃上后应立即准备涂片。生物材料应轻轻展开,以避免细胞粉碎伪影。使用盖玻片作为扩展器有助于防止这些伪影。然而,在进行涂片时用力过大会破坏盖玻片。高质量的涂片通常将大多数细胞群作为单层分布,以便它们能够轻松传输光。细胞材料不应过度滞留在血块中。

FNA的目标是从质量、组织或器官中收集细胞。使用较大的孔针有助于增加细胞性,但可能与过度的血液污染有关,而使用较小的针头取样会产生更高的质量,尽管材料不太丰富。在我们的例子中,在实验性感染T.Brucei的小鼠中,外部雄性生殖结构的皮皮渴望,用22口径的针头与5mL注射器耦合进行。小鼠被麻醉,睾号稳定与一只手和穿刺和吸入引导和进行另一只手。我们检索到许多与生殖细胞、精子动物、上皮细胞和基质细胞混合的锥体体,这些细胞被涂片和免疫染色,用于寄生虫的表面蛋白(VSG)(图4)。

吸气中总是有潜在的采样误差,从而产生阴性结果,因为尽管给定病变的多个区域可以多次采样,但这是我们不形象化针头和目标器官或质量的盲目愿望。这在临床环境中是极其相关的,在临床环境中,对可疑病变的阴性 FNA 并不排除进一步调查,但它在动物疾病模型中不是那么相关。因此,一般限制主要包括假阴性结果,以及较少见的假阳性结果(例如,血液污染),但在动物实验设置方面最重要的限制是缺乏组织信息^架构17,就像我们与组织病理学,例如寄生虫的分布模式,免疫细胞,和细胞-细胞相互作用特征。然而,好处是FNA是一个非终端程序,允许在同一动物的多次采样,并始终允许更好的保存细胞形态(图5)。FNA的替代品用于从小鼠身上采集宿主细胞、免疫细胞或微生物,总是依靠对小鼠实施安乐死来收集感兴趣的质量或器官。

据我们所知,关于FNA在小型实验室动物中使用的报告只有几个,一个从1949年对应于骨髓的愿望与22G针研究造体^细胞18,所有其他结合流细胞测定量化肿瘤相关炎症细胞或内皮细胞7,19,20。研究表明,该技术可以推广到传染病模型的诊断和研究,并能将细胞学与免疫细胞化学或电子显微镜技术相结合。实验动物方法的两个主要优点是:(1)本程序不终端,即可在活小鼠中进行;和 (2) 由于其轻度严重性,它允许在同一动物的序列渴望。因此,每次研究需要的小鼠较少,临床疾病的进展与疾病和/或微生物的细胞和分子特征的进化之间的相关性很容易进行,从而进行纵向研究。

也许关于使用FNA诊断传染病的第一份报告是格里格和格雷在1904年的一项研究,该研究报告昏睡病患者对淋巴结的针头渴望,其中揭示了莫平锥^体12。如果我们在实验鼠身上的发现被翻译成牛,也就是说,如果FNA可以很容易地从外部雄性生殖结构中取样,人们可以预期,这项技术对兽医诊断动物将非常有用农场内锥虫病,牲畜。

作者没有什么可透露的。

该项目由"国家电信基金会"/"国家基金会"(Tinnologia)/国家基金会(Tnologia e Ensino 高级基金会)通过"埃斯塔多基金会"(参考:ID/BIM/50005/2019)资助。LMF是国际实验室(IF/01050/2014)的调查员,实验室由ERC资助(FatTryp,参考文献771714)。这项工作的出版还资助了UID/BIM/50005/2019项目,该项目由"技术基金会"/"技术基金会"(FCT)/国家电信基金会(MCTES)通过"奥萨门托·德埃斯塔多基金会"资助。我们感谢iMM组织学和比较病理学实验室的安德烈娅·平托为专家提供电子显微镜帮助,感谢桑德拉·特林达德、蒂亚戈·雷贝罗和恩里克·马查多(iMM)分享受感染小鼠的组织。