在微生物发酵过程中制造一种纳菲安涂层、还原石墨烯 Oxide/Polyaniline 化学电阻传感器, 以实时监测 ph 值

在这里, 我们报告了制造纳菲安涂层, 聚苯胺功能化, 电化学还原氧化石墨烯化学电阻微 ph 传感器的协议。这种基于化学电阻的固态微 ph 传感器可以实时检测乳酸乳球菌发酵过程中的 ph 值变化。

在这里, 我们报告了基于聚苯胺功能化、电化学还原氧化石墨烯 (ergo-pa) 的固态微 ph 传感器的工程。电化学还原的氧化石墨烯起导电层的作用, 聚苯胺作为 ph 敏感层。聚苯胺的 ph 依赖性电导率是在质子化过程中通过掺杂孔和在脱质子过程中对孔的掺杂而产生的。我们发现 ergo-pa 固态电极在发酵过程中不能发挥这样的作用。细菌在发酵过程中产生的电化学活性物种会干扰电极的反应。我们成功地将纳菲翁作为质子导电层应用于 ergo-pa 上。在化学电阻传感器测量中, nafion 涂层电极 (ergo-pa-na) 的灵敏度为1.71 ω/ph 值 (ph 值 4-9)。我们在乳酸乳球菌发酵过程中实时测试了 ergo-pa-na 电极。在乳酸生长过程中,培养基的 ph 值从 ph 值7.2 变为 ph 4.8, ergo-pa-na 固态电极的电阻从294.5ω改为288.6 ω (每 2.4 ph 单位 5.9ω)。ergo-pa-na 电极的 ph 响应与传统玻璃基 ph 电极的响应相比表明, 无参考的固体微传感器阵列在微生物发酵中成功运行。

ph 值在许多化学和生物过程中起着至关重要的作用。即使 ph 值的微小变化也会改变过程, 并对工艺结果产生不利影响。因此, 有必要在实验的每个阶段监测和控制 ph 值。玻璃基 ph 电极已成功地用于监测许多化学和生物过程中的 ph 值, 尽管玻璃电极的使用对 ph 值的测量构成了若干限制。玻璃基 ph 电极是相对较大的, 易碎的, 电解质的小泄漏到样品是可能的。此外, 电极和电子产品相对昂贵, 适用于96孔筛选发酵系统。此外, 电化学传感器具有侵入性, 消耗样品。因此, 它更有利于使用非侵入性、无参考的传感器。

目前, 微型化反应系统在许多化学工程和生物技术应用中受到青睐, 因为这些微系统提供了增强的过程控制, 以及与宏观系统类似物相比的许多其他优势。要监视和控制微型化系统中的参数是一项具有挑战性的任务, 因为测量传感器的尺寸 (例如 ph 值和_o2) 也需要最小化。生物系统微反应器的成功生产需要不同种类的过程监测分析工具。因此, 智能微传感器的发展在微反应器中开展生物过程中发挥着重要作用。

最近, 已经尝试了几次使用化学电阻传感材料, 如碳纳米管和导电聚合物1开发智能^{ph 传感器.}这些化学电阻传感器不需要参考电极, 并且易于与电子电路集成。成功的化学电阻传感器可以生产出经济高效、易于制造、测试量小、无创的智能传感器。

在这里, 我们报告了一种方法, 以开发电极与聚苯胺功能化, 电化学还原氧化石墨烯。在乳酸发酵过程中, 化学电阻率电极作为 ph 传感器工作。乳酸是一种乳酸产生的细菌, 用于食品发酵和食品防腐剂的生产过程。在发酵过程中, 乳酸的产生降低了 ph 值, 细菌停止在低 ph 值^2,3,4生长。

发酵介质是一种复杂的化学环境, 含有多肽、盐和氧化还原分子, 它们往往会干扰传感器表面^{5、6、7、8、9}。研究表明, 在这种复杂的发酵介质中, 基于具有适当表面保护层的化学电阻材料的 ph 传感器可以用来测量 ph 值。在本研究中, 我们成功地使用 nafion 作为聚苯胺涂层的保护层, 电化学还原的氧化石墨烯在l.乳酸发酵过程中实时测量 ph 值。

1. 氧化石墨的制备

注: 石墨氧化物是根据悍马的方法^10,11制备的。

1. 将3克石墨加入到69毫升的浓缩 h2so-4中, 搅拌溶液, 直到石墨完全分散.加入1.5 克亚硝酸钠, 搅拌1小时。然后, 将容器放在冰浴中。
2. 在分散体中加入9克高锰酸钾, 并将容器从冰浴中取出。让溶液加热到室温。
3. 首先, 加入138毫升蒸馏水滴度。然后, 继续添加420毫升的蒸馏水。使用热板将温度保持在 90°c 15分钟。在分散体中加入7.5 毫升的30% 过氧化氢。
4. 以 10, 000 x g 离心20分钟收集产品, 并丢弃上清液。用温热的双蒸馏水清洗颗粒 4x, 用10% 的 hcl (v/v) 溶液清洗2倍。最后, 用乙醇清洗 2倍, 并在烤箱中50°c 干燥。

2. 主权沉积电极的制备

1. 在10毫升的水中分散10毫克的氧化石墨, 然后在超声波浴中将其超声连接6小时。
2. 在 2, 700 x g 的情况下, 通过离心30分钟去除未脱落的氧化石墨片, 离心后丢弃固体颗粒, 并使用上清液进行进一步实验。
   注: 我们使用这种去角质 go 片分散作为股票解决方案。
3. 将 go 股票解决方案稀释两倍。始终准备一个新的 go 工作解决方案从股票解决方案。
4. 在暴露的交错金电极上添加 2μl go 工作溶液 (图 1 a 和图 2)。滴铸后, 在室温下干燥电极12小时。这是 g 沉积的电极。

3. 减少对电化学还原石墨烯的影响

1. 将电极插入聚二甲基硅氧烷 (pdms) 电极支架 (底片)。将电极支架的另一部分 (用作溶液储罐) 放在电极顶部, 如图 1a-1c所示. 通过使用两个回形针将两个部分剪裁在一起, 将支架组合在一起。确保 pdms 支架未覆盖主权沉积的电极部件。
2. 在储层中进行液-300μl 0.2 m 磷酸盐缓冲液 (ph 值 7)。然后, 将参考和反电极放置在溶液中, 使电极放置在靠近 go 薄膜表面的地方, 如图1c 所示。这种设置可作为电化学电池, 用于对 go 和聚苯胺沉积进行电化学还原。
3. 将电极与连接到计算机的电位器连接, 以进行数据采集。使用循环伏安法进行电化学还原: 选择0至-1.2 v 作为电位范围, 选择 50 mv 作为扫描速率。在0至-1.2 v 10倍之间循环电极上的电压 (图 3)。
4. 实验结束后, 从支架上取下电极, 反复用双蒸馏水清洗。然后, 在101°c 的烤箱中将电极干燥12小时。
5. 当电极干燥时, 从烤箱中取出电极, 让其冷却到室温。然后, 用万用表测量电极的电导率。该电极现在被称为电化学还原的氧化石墨烯 (ergo) 电极。

4. ergo 电极的聚苯胺功能化

1. 制备 10 mm 苯胺单体, 用于聚苯胺功能化。在 1 m h2so 4 的 5 ml 中溶解10μl 的 10 mm 苯胺.
2. 对于聚苯胺功能化, 在溶液储层中加入300μl 苯胺单体。按照 go 还原过程中的说明, 将 ergo 沉积的电极放入电极支架中。
3. 使用循环伏安法对苯胺进行电聚合, 将 ergo 功能化到 erga-polyaniline (ergo-pa) 中: 选择0至 0.9 v 作为电位范围, 选择 50 mv/作为扫描速率。将电极上的电压循环到0至 0.9 v 之间, 以 50x (图 4)。
4. 聚苯胺沉积后, 取出电极, 反复用双蒸馏水清洗。然后, 在烤箱中的80°c 下将电极干燥12小时。
5. 从烤箱中取出电极, 使其冷却至室温, 然后再使用万用表测量电极的电导率。
6. 在布列顿-罗宾逊缓冲液中加入 0.2 m naoh, 直至 ph 5 (见步骤 5.1), 准备 ph 值5缓冲液。将电极放在 ph 值为5的缓冲液中24小时。
   1. 制备布列顿-罗宾逊通用缓冲液, 在0.8 升超纯水中混合0.04个磷酸摩尔、0.04 摩尔乙酸和0.04 摩尔硼酸。将 0.2 m 氢氧化钠滴入缓冲液中, 直到达到所需的 ph 值⁴。加入超纯水, 直到最终体积为1升。

5. ergo-pa 电极在不同 ph 值下进行测试 (纳菲翁涂层涂装前的预校准)

1. 在 ph 值为5缓冲液调理电极后, 测量电极在不同 ph 值 (ph 值4至 ph 值 9; 见图 5) 的溶液中的电阻。
   1. 在此测量中, 将电极直接浸入缓冲液中, 并将电极的另一部分连接到计算机控制的电位器上进行数据采集。用 0.2 m naoh 滴定改变 ph 值。
   2. 从技术列表中选择时间测量或安培曲线, 并在电极上应用 100 mv 电位差。
      注: 电位器测量电流对时间。控制电位器的软件提供了电流相对于时间的图形表示。
   3. 使用 ohm 定律 (电阻等于电压除以电流) 从测量的电流和施加的电压计算电阻值。
2. 测量完成后, 在室温下干燥电极12小时。

6. 纳菲安涂层 ergo-pa 电极的制备

1. 在 ergo-pa 电极上加入5μl 的 5 wt% nafion, 并在室温下干燥电极12小时。
2. 在 nafion 涂层后, 在 ph 值测量之前, 将电极保持在 ph 值5的缓冲液中24小时。
3. 在 ph 值5进行调理后, 取出 nafion 涂层 ergo-pa 电极 (ergo-pa-na), 测量电极从 ph 值4到 ph 值9的电阻, 如第5.1 节所述 (图 6)。

7.乳酸培养基的制备

1. 将9.3 克的 mL 粉末加入250毫升的超纯水中。慢慢搅拌溶液, 直到粉末完全溶解。在121°c 下对溶液进行高压灭菌15分钟。
2. 取一个250毫升的灭菌烧瓶和磁性搅拌器杆, 并添加50毫升的灭菌 m17 介质到烧瓶。然后加入8毫升蒸压 1 m 葡萄糖溶液。用 10μl的乳酸培养物接种溶液, 以前生长在同一培养基中。
   注: 细菌菌株是从格罗宁根大学分子遗传学的扬角获得的。
3. 将与接种培养基一起放置18小时的烧瓶, 放在30°c 的孵化器中, 搅拌并监测 ph 值。

8. l. 乳酸发酵实验中 ergo-pa-na ph 响应的测试

1. 将 ergo-pa-na 电极放入l. lactis培养中, 并用棉塞将其关闭。然后, 将设置放置在30°c 的恒温器中, 以生长l. lactis。
2. 将 100 mv 应用于电极上, 并根据时间测量电流。
3. 以不同时间点的 0.5 ml 样品 (例如, 参见图 7) 为例, 用传统的玻璃电极测量600纳米的离线光学密度和 ph 值。继续测量, 直到培养物的光学密度变为恒定, 这表明细菌不再生长。

在-1.0 v (图 3) 周围出现了一个强的减少峰值, 说明了 go 到 ergo^{12、13、14、22}的减少。峰值的强度取决于电极上 go 层的数量。一层厚厚的黑色薄膜完全覆盖了电极上的金丝。这时, 两个绝缘金电极是导电的, 因为 go 连接了两个金电极电线。苯胺的电聚在 ergo^{15、16、17、18、19、20、21、 22岁}这种绿色是 ergo 上导电聚苯胺层形成的标志。聚苯胺功能化后, ergo 电极的电导率 (电阻降低) 增加。

当我们将 ergo-pa 电极放入 ph 值在4到9之间的溶液中时, 由于 ergo-pa (图 2) 22 中的质子阳离子/分解过程中的孔掺杂和掺杂, 电流值增加 (图 5)^.用 0.2 m naoh 滴定布列顿-罗宾逊缓冲液, 得到了测量 ergo-pa 电极电流值所需的 ph 值。因此, 每增加 0.2 m naoh, 电极的电流值就会增加 (图 5和图 6)。当 0.2 m naoh 的加入在特定 ph 值停止时, 电极的反应立即稳定。

溶剂在室温下蒸发后形成的一种导电质子纳菲翁薄膜。电极的电导率影响不大, 但电阻值的差异出现了几个欧姆, 改变了 ergo-pa 电极的基电流值。与 ergo-pa 电极类似, 当缓冲液的 ph 值从4变为9时, ergo-pa-na 电极的电阻也发生了变化, 如图 6^{18 所}示。

在l. lactis 培养中放置 ergo-pa-na 电极后, 电流最初有所下降, 然后需要一些时间才能达到稳定的值。一旦l. lactis开始生长, ergo-pa-na 的电流逐渐下降。电流的下降在l. lactis的指数生长阶段加速, 并在生长结束时达到稳定值 (图 7)¹⁸。电流 (或电阻) 的最终值与在缓冲液 (ph 值 4-7) 中测试的 ergo-pa-na 电极的电流值相当, 如图 7的内集所示。

图 1: pdms 电极支架底部 (左) 和顶部 (右) 部分的图像.(a) 具有 (b) 参考和 (c) 反电极的组装电池。(d) 以厘米为单位的刻度条的交错金电极。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: ergo-pa 沉积的插值金电极示意图, 并以图形表示 ergo 和 pa 的形成.图像还显示了在质子化过程中 ergo-pa 上的孔掺杂。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 以 50 mv 的扫描速率对不同 go 浓度的 go 还原进行循环伏安测量.请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 以 50 mv 的扫描速率对聚苯胺沉积进行循环伏安测定.显示总共50次的前10次扫描。垂直箭头标记扫描期间电流增加的趋势, 水平箭头标记电压扫描的方向。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: ergo-pa 电极对 ph 值4至9的电阻值.请点击这里查看此图的较大版本.

图 6: ergo-pa-na 电极对 ph 值4至9的电阻值.请点击这里查看此图的较大版本.

图 7:乳酸发酵过程中 ergo-pa-na 的实时连续 ph 变化.该内含物显示了在布列顿-罗宾逊缓冲液中测量的 ph 值4-7 的 ergo-pa-na 的预期电阻值。请点击这里查看此图的较大版本.

go 层在 go 沉积后完全覆盖金电极线是非常重要的。如果黄金电极不被 go 覆盖, 聚苯胺不仅会沉积在 ergo 上, 还会直接沉积在可见的金电极电线上。聚苯胺在金电极线上的沉积可能会对电极的性能产生影响。在 go 还原到 ergo 后, 电极在100°c 下干燥, 以加强 ergo 层与金电极线之间的粘合。每个电极的电阻根据沉积在金电极上的 go 层的数量而变化。因此, 每个电极的 go 浓度相同是很重要的, 并且很难在与测量电路兼容的预定指定范围内制造具有电阻的电极。这限制了电极的容易批量生产。

电化学法制备还原石墨烯氧化物/聚苯胺, 与其他报道的制备方法相比具有一定的优越性。这里介绍的电化学方法不需要强还原剂和氧化剂 (例如, 联氨和过硫酸铵)^23,26。此外, 材料直接沉积在电极上, 无需进一步处理, 使制造过程更快、更容易。由于 go 在原位电化学还原, 在金和石墨烯之间实现了良好的连接, 使 ph 电极更加坚固。

在应用 nafion 之前, 在 ph 值在3到9之间的缓冲液中平衡 ergo-pa 电极, 提高了电极的灵敏度 (未显示数据)。如果忽略这一步骤, 就需要在使用前将 ergo-pa-na 电极浸泡在缓冲 ph 值5中超过24小时。

此外, ergo-pa 电极必须干燥, 然后再应用纳菲翁。湿 ergo-pa 电极在 ergo-pa 和 nafion 之间形成水层, 并增加了 ph 传感器的响应时间。不同 ph 值的溶液中 ergo-pa-na 的电阻或测量电流在电极之间各不相同。每个电极的电阻或电流的这种变化很可能是由沉积在金电极线上的 go 层数的差异造成的。与其他 ph 电极一样, 必须对 ergo-pa-na 电极进行正确校准, 以获得可靠的 ph 值。

将电极放置在乳酸培养体内后, 需要一个初始稳定时间才能获得恒流。在乳酸发酵过程中, 初始 ph 值为7.2。在乳酸菌的生长过程中, 葡萄糖被转化为生物量, 并转化为乳酸, 使发酵液酸化。当发酵培养基的 ph 值变得太低, 无法支持适当的生长时, 或者当没有葡萄糖离开时, 生长就停止了。成长前后 ergo-pa-na 的电流 (或阻力) 值等于 ergo-pa-na 先前在不同缓冲溶液中校准的电流 (或阻力) 值。采用传统的玻璃 ph 电极确定了乳酸发酵培养基的初始 ph 值和结束 ph 值。

ph 传感器可以很容易地使用廉价化学品在内部制造。低制造成本使研究人员能够在应用中使用这种电极, 因为需要大量的 ph 电极 (例如, 在细菌发酵筛选平台中)。在不需要将 kcl 从传统玻璃 ph 电极扩散到测量解决方案的情况下, 可以设想 ph 电极的另一个应用。该协议的 ph 电极没有可以扩散到样品中的内部液体。

化学电阻传感器与当前可用的无线电子电路^1、27的兼容性使其能够轻松地开发使用无线 ph 传感器的应用。

作者没有什么可透露的。

提交人感谢格罗宁根大学的财政支持。