用斑点印迹分析 A11-positive β淀粉样寡聚物的制备与评价

本协议描述如何从合成肽体外制备 Aβ寡聚物, 并通过斑点印迹分析来评价 Aβ的相对含量。

β淀粉样蛋白 (Aβ) 是一种疏水性肽, 具有自组装成骨料的内在倾向。在各种团聚体中, Aβ寡聚物作为阿尔茨海默病 (ad) 进展的主要神经毒素被广泛接受, 被认为是 ad 发病的关键事件。因此, Aβ寡聚物抑制剂可以防止变性, 并有潜力发展为疾病修改治疗的 AD。然而, Aβ寡聚物的不同形成方案可能会导致不同特征的寡聚。此外, 有效筛选 Aβ_1-42寡聚物抑制剂的方法也不多。A11 抗体可以与含有反平行β片结构的毒性 Aβ_1-42齐聚物的子集发生反应。在本协议中, 我们描述了如何从 Aβ的合成 Aβ_1-42肽的体外准备一个 A11-positive 的_1-42富齐聚的样本, 并通过斑点印迹来评估样本中 A11-positive Aβ_1-42齐聚物的相对数量使用 A11 和 Aβ_1-42特定6E10 抗体进行分析。使用该协议, A11-positive Aβ_1-42齐聚物的抑制剂也可以从半定量实验结果中筛选出来。

阿尔茨海默病 (AD) 是影响全球老年人的最重要的神经退行性疾病之一¹。普遍认为β淀粉样蛋白 (Aβ) 的异常聚集可能是 AD 的主要病理因子。Aβ骨料是老年斑块的主要成分, 是 AD 患者大脑中的生物学标志物之一。此外, Aβ聚集物, 特别是寡聚物, 产生强大的神经毒性, 这可能是导致神经元死亡的原因。因此, 抑制 Aβ寡聚物的形成可以防止变性, Aβ寡聚物抑制剂可作为 AD 的病害修饰处理。许多研究使用合成 Aβ肽在体外形成寡聚物, 探讨人工 Aβ寡聚的形貌和结构, 并利用体外模型^2,3对 Aβ寡聚物的抑制剂进行研究。^,4. 然而, 不同的体外形成协议的 Aβ寡聚物可能导致不同形态特征的聚类, 这可能导致不同研究组之间的不可比拟的结果。因此, 迫切需要一种标准的 Aβ齐聚物生成协议。

到目前为止, 还没有多少方法可以直接检测 Aβ寡聚物。透射电镜 (TEM)、非变性凝胶电泳、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和斑点印迹分析可用于检测 Aβ寡聚物的数量和/或形态学体外^5,6. 例如, Aβ齐聚物的形态和结构可以在 TEM 中观察到。用非变性凝胶电泳法测定 Aβ聚合的相对含量和分子量。ELISA 可用于测定血清、血浆和脑组织提取物中的 Aβ寡聚体。最后, 斑点印迹分析, 一种用于检测、分析和识别蛋白质的技术, 可用于评价不同样品中 Aβ齐聚物的相对浓度, 并借助于寡聚特异性和 Aβ特异抗体。此外, 斑点印迹检测提供了大量的时间节省, 因为凝胶电泳和印迹程序的凝胶是不需要的。因此, 这种检测通常用于筛查潜在的 Aβ寡聚物抑制剂。本协议的总体目标是描述一种相对简单、可靠且可重现的方法, 用于准备 Aβ_1-42富聚物的样本, 通过斑点印迹分析来分析 Aβ_1-42低聚物的数量, 并筛选 Aβ寡聚使用半定量实验结果的抑制剂。

1. 解决方案准备

注: 有关试剂来源, 请参阅材料表。

1. 在100毫升的双蒸馏水中加入5克 bsa, 制备5% 牛血清白蛋白 (bsa) 溶液。涡流他们完全混合。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。
2. 在 5% BSA 溶液的10毫升中加入10µL 抗体储存液, 制备抗低聚物抗体 A11 溶液 (1:1, 000)。涡流他们完全混合。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。
3. 在10毫升 5% BSA 溶液中加入10µL 抗体库溶液, 制备抗 Aβ抗体6E10 溶液 (1:1, 000)。完全混合涡流。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。
4. 制备抗纤维寡聚物抗体 OC 溶液 (1:1, 000), 添加10µL 抗体库溶液到10毫升 5% BSA 溶液。完全混合涡流。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。
5. 在1000毫升的双蒸馏水中加入24克的三基和88克氯化钠, 制备三缓冲盐水 (TBS) 溶液。将 pH 值调整为7.4。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 长达3月。
6. 通过增加1毫升的 Tween-20 到100毫升的 Tween-20 溶液和900毫升的双蒸馏水, 准备一个三缓冲盐水和 TBST 溶液。
7. 通过添加10µL 辣根过氧化物酶 (HRP) 山羊抗兔 IgG (H + L) 到10毫升的 TBST 溶液, 制备二级抗体溶液。涡流他们完全混合。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。
8. 在1毫升二甲基亚砜 (亚砜) 中溶解3.68 克姜黄素, 形成10毫米姜黄素溶液。
9. 溶解5毫克合成 Aβ_1-42在2毫升 11, 13, 33-氟, 2-丙醇 (HFIP), 形成一个2.5 毫克/毫升 Aβ单体溶液。把它放在室温下 (25 °c) 20 分钟, 使100µL 整除数, 并存储在-20 摄氏度, 长达6月。
   注意: 此过程应尽可能快地运行。应切断吸管的提示, 以确保准确的吹打。
10. 将 ecl 流体 a 和 B 混合, 制备出电化学发光 (ecl) 流体, 体积比为1:1。此解决方案应在使用前准备就绪。

2. 样品准备

注: 在斑点印迹分析前2天进行样品准备。

1. 将900µL 的双蒸馏水添加到 Aβ_1-42单体溶液的管中;Aβ_1-42的浓度将为0.25 毫克/毫升。将混合物室温放置20分钟。
2. 用高纯度的氮气蒸发溶液, 直到其体积约为850µL。Aβ_1-42解决方案的浓度将约为0.29 毫克/毫升。
   注意: 该解决方案应不时动摇, 以确保 HFIP 完全蒸发。通常, 在蒸发30分钟后, 剩余溶液的体积约为850µL。
3. 用双蒸馏水稀释姜黄素溶液, 以姜黄素工作溶液 (0.2 和2µM)。将 Aβ_1-42解决方案和姜黄素工作解决方案混合在一起, 体积比为1:1。姜黄素的最终浓度将是0.1 和1µM。
   注: 如果需要, 潜在的低聚物抑制剂可与 Aβ_1-42解决方案混合使用。
4. 在磁力搅拌器中连续摇动溶液 (请参阅材料表)。
   1. 将塑料分隔盒固定在磁力搅拌器上。在盒子的2个角落放置2个磁力搅拌棒, 将样品管放在盒子的中心。
   2. 在室温下摇动盒子 (25 °c), 48 小时。
      注: 磁力搅拌器的速度大约是 60 rpm。
5. 离心管15分钟在4°c 和 1.8万 x g. 收集上清。

3. 斑点印迹分析

注: 所有孵化均在卧式振动筛上执行。

1. 将硝化棉膜切成1厘米宽的长条。
   注: 硝化棉膜的宽度可根据实验需要进行调整。
2. 2-µL 样品均匀地在2条 (条1和 2) 与每个点间隔在 0.5 cm。
3. 将小条放在室温下5分钟, 直到带上的水滴干燥。
4. 用 5% BSA 溶液在室温下孵化出30分钟的小条。
5. 在室温下用 TBST 溶液冲洗带5分钟。
6. 吸入 TBST 溶液。在室温下1小时, 孵育1的抗寡聚物抗体 A11 溶液和带2的抗 Aβ抗体6E10 溶液。
7. 用 TBST 溶液冲洗带三次, 每次室温5分钟。
8. 吸入 TBST 溶液。在室温下用二次抗体溶液孵化带40分钟。
9. 用 TBST 溶液冲洗带三次, 每次室温5分钟。
10. 将混合的 ECL 流体均匀地应用于带钢表面。在自动化学发光成像系统中暴露条纹 (请参阅材料表)。
    注: 正常情况下, 300 µL 的 ECL 流体足以用于一膜。膜在暴露时必须保持湿润。曝光时间由成像系统自动计算。
11. 使用 ImageJ (国立卫生研究院) 或其他图像处理软件进行灰度分析, 以获得半定量结果。

为研究 Aβ_1-42单体在制备后是否能形成 Aβ_1-42齐聚物, 采用 TEM 分析。在 HFIP 溶解 Aβ_1-42单体样本中未观察到可见骨料 (图 1A)。此外, 在48小时的震动后, 在 Aβ_1-42样本中观察到了直径约 10-80 nm 的球状骨料, 这表明 Aβ_1-42在准备后形成寡聚 (图 1B)。

图 1.Aβ_1-42单体和 Aβ_1-42富齐聚样品的 TEM 分析.HFIP-溶解 Aβ_1-42单体样品 (10 µM) 和 Aβ_1-42富齐聚样品 (10 µM), 根据本协议编写的研究了 TEM。刻度条 = 200 毫微米。请单击此处查看此图的较大版本.

另外, 用点印迹分析法对样品中的 Aβ_1-42齐聚物的相对数量进行了评估。A11 抗体可与含有抗平行β片结构的有毒 Aβ齐聚物的子集发生反应。OC 抗体与纤维聚合反应, 平行在注册β片结构。通过使用这些抗体, 我们证明了 A11-positive Aβ_1-42低聚体, 但非 OC 阳性 Aβ_1-42纤维聚合, 主要出现在 Aβ_1-42有富集的样品中, 这些样本是根据该协议编写的 (图 2)。通过使用抗 Aβ抗体 6E10, 我们观察到, Aβ_1-42肽的数量在 HFIP 溶解 Aβ_1-42单体样品和 Aβ_1-42富聚物样品 (图 2) 中相似。

图 2.Aβ_1-42单体和 Aβ_1-42富齐聚样品的斑点印迹分析.(A) HFIP-溶解的 Aβ_1-42单体样本 (10 µM) 和 Aβ_1-42低聚物样本 (10 µM) 是根据本协议制备的, 采用抗寡聚物抗体 A11、抗纤维的斑点印迹分析方法进行了研究。寡聚物抗体 OC, 抗 Aβ抗体6E10。(B - D) ImageJ 对灰度进行了半定量分析。以控制的百分比表示的数据是3独立实验的平均扫描电镜;^***p < 0.001 vs Aβ_1-42单体组 (方差分析和t测试)。请单击此处查看此图的较大版本.

为了进一步研究此协议是否可用于筛选 Aβ_1-42低聚物的抑制剂, 使用了已知的 Aβ寡聚剂姜黄素。我们发现, 与姜黄素 (0.1-1 µM) 的共同孵化显著减少了 A11-positive Aβ_1-42低聚物的相对数量, 这证明了在姜黄素共孵化 Aβ_1-42寡聚物样品中 A11 的染色减少了正常孵化 Aβ_1-42富齐聚的示例 (图 3)。在相同的条件下, 姜黄素 (0.1-1 µM) 没有改变 Aβ_1-42肽的数量, 因为6E10 的染色甚至在所有样本中 (图 3)。

图 3.姜黄素共孵化 Aβ的斑点印迹分析_1-42富齐聚的样品.(A) HFIP-溶解的 Aβ_1-42单体 (10 µM) 是根据本协议编写的, 并以或没有姜黄素 (0、0.1、1µM) 为 48 h 的震动而孵化。用 A11 和6E10 对样品进行斑点印迹分析。(B) ImageJ 进行了半定量灰度分析。以控制的百分比表示的数据是3独立实验的平均扫描电镜;^***p < 0.001 vs Aβ_1-42单独组 (方差分析和 Tukey 测试)。请单击此处查看此图的较大版本.

为了验证齐聚物的形成, 我们也使用了非变性凝胶。我们发现, 低聚物 (> 4 KD) 存在于 Aβ_1-42富齐聚物样品中, 而大多数单体 (4 KD) 在 Aβ_1-42单体样品 (图 S1) 中找到。

我们调查了 Aβ_1-42样品的上清和颗粒中的 Aβ骨料。在48小时的孵化后, Aβ_1-42低聚体, 但不 Aβ_1-42纤维聚合在样品的上清中发现, 由 A11, OC 和6E10 抗体 (图 S2) 确定。在同一条件下, 在示例 (图 S2) 的颗粒中发现了 Aβ_1-42纤维聚合但不 Aβ_1-42寡聚物。

我们还使用 TEM 研究了姜黄素处理的 Aβ_1-42样品的形态学。姜黄素处理的样品包含一些球形斑点, 表明姜黄素可以减少 Aβ_1-42低聚物 (图 S3) 的数量。

图 S1.Aβ1-42 单体和 Aβ1-42 富齐聚物样品的非变性凝胶电泳分析根据本协议制备的 HFIP 溶解 Aβ1-42 单体样品 (10 µM) 和 Aβ1-42 富聚物样品 (5 µM、低、10µM、高), 采用抗 Aβ抗体6E10 对非变性凝胶电泳进行了检测。请单击此处查看此图的较大版本.

图 S2.Aβ1-42 溶液中清液主要含有寡聚物, 但不含纤维骨料.一个 Aβ1-42 的解决方案 (50 µL), 48 小时的震动后, 离心 1.8万 x g 10 分钟。在850µL 的双蒸馏水中, 收集上清液并重新溶解颗粒。用 OC、A11 和6E10 抗体对上清和颗粒进行了斑点印迹检测。请单击此处查看此图的较大版本.

图 S3.姜黄素共孵化 Aβ1-42 富齐聚物样品的 TEM 分析根据本协议制备了 HFIP 溶解 Aβ1-42 单体 (10 µM), 并在48小时的震动下孵化出1µM 姜黄素。样品经 TEM 检查。刻度条 = 100 毫微米。请单击此处查看此图的较大版本.

在本协议中, 我们报告了一种方法, 用于准备包含 Aβ_1-42低聚物的样本, 并通过斑点印迹分析来分析 A11-positive Aβ_1-42寡聚的数量。虽然我们的制备 Aβ_1-42富聚物样品的方法非常简单、可靠、重现性好, 但仍有一些值得注意的点。首先, HFIP 用于溶解合成 Aβ_1-42肽。聚合 Aβ_1-42肽可以在 HFIP 溶液中分解成单体。但是, HFIP 容易挥发, HFIP 的粘度很低。因此, Aβ_1-42肽应分解为 HFIP, HFIP 解决方案应尽可能快速 aliquoted, 以减少操作过程中 HFIP 的潜在损失。此外, 应切断吸管的提示, 以确保准确吹打在这个过程中。其次, 用高纯度的氮气从溶液中蒸发 HFIP。在此过程中, Aβ_1-42解决方案应不时动摇, 以确保 HFIP 可以完全蒸发。在本程序结束时, 不应在解决方案中检测到 HPIF 的气味。通常, 30 分钟的蒸发将 HFIP 的浓度降低到小于0.1%。在这种浓度下, 报告 HFIP 不改变 Aβ_1-42⁷的构象转换。第三, 在制备含有 Aβ_1-42齐聚物的样品时, 液体的最小体积应大于50µL. 否则, 样品可能会分散到小水滴, 附着在管子的壁上。另外, Aβ_1-42单体不能在没有彻底混合的情况下形成齐聚物。

此处描述的用于准备 Aβ_1-42富齐聚的示例的协议与其他组中使用的某些协议稍有不同。例如, 在一些研究中, 在将双蒸馏水添加到解决方案^8、9中之前, HFIP 被蒸发掉了。然而, 在这种情况下, Aβ_1-42肽可能形成小片, 很难溶入溶液中。因此, 我们选择先添加双蒸馏水, 然后用氮气蒸发 HFIP。最重要的是, 该协议制备的寡聚形状由 TEM 确定。此外, 该协议形成的 Aβ_1-42寡聚物可诱发 SH-SY5Y 细胞和原发海马神经元的神经毒性, 降低注射入小鼠海马区后的认知性能, 提示 Aβ_1-42制备的齐聚物是相当有毒的^5,10。这些结果与以前的研究¹¹一致。

通过点印迹分析来评估 A11-positive Aβ_1-42低聚物的此协议仍然存在一些缺点。首先, 使用人工取样, 不容易保持水滴均匀的大小。其次, 斑点印迹分析是一种半定量但不是定量的方法来测量 A11-positive Aβ_1-42寡聚物的数量, 建议如果精确地评估 Aβ1-42 的数量, 则需要其他方法 (如 ELISA).寡聚是必需的。第三, 某些药物可能对抗体产生反应, 导致假阳性结果。

一般而言, 我们提供了一个可靠的协议, 以准备包含 A11-positive Aβ_1-42低聚物的样品, 并通过斑点印迹法分析 Aβ_1-42齐聚 A11-positive 的数量。通过使用此协议, 潜在的 Aβ_1-42低聚物抑制剂具有处理 AD 的潜力, 可以有效筛选。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了中国国家自然科学基金 (U1503223, 81673407, 21475131) 的资助, 浙江省非营利技术应用研究项目 (2016C37110), 宁波国际科技合作项目 (2014D10019)、宁波市生命科学与健康创新团队 (2015C110026)、宁波市科技 & 科技项目共同财富 (2017C50042)、李家和业杨厝港钦利海洋生物制药发展基金,宁波大学的肯塔基州金麦格纳基金。