百里香精油应用于肉类干燥过程中微生物负荷的影响

微生物如大肠杆菌污染肉类产品会引起食源性疾病. 精油在肉类干燥过程中的应用尚未深入研究。在此, 我们提出了一种新的方法, 将百里香精油应用于肉类干燥过程中, 以减少干肉中的微生物负荷。

肉类是一种高蛋白的膳食, 用于配制干, 一种流行的食品零食, 在那里保存和安全是重要的。为了保证食品安全和延长肉类和肉类产品的保质期, 使用合成或天然防腐剂来控制和消除食源性细菌。越来越多的人对天然食品添加剂在肉类中的应用增加了兴趣。微生物, 如大肠杆菌, 污染肉类和肉类产品, 造成食源性疾病. 因此, 有必要改进肉类的保护过程。然而, 在肉类干燥时使用精油还没有深入研究。在这方面, 有机会增加干肉的价值, 并通过在干燥过程中应用精油降低食源性疾病的风险。在本议定书中, 我们提出了一种新的方法来应用百里香精油 (特奥) 在肉类干燥, 特别是在蒸气形式直接在干燥室。为了评估, 我们使用最小的抑制浓度 (MIC) 来检测样本中有害细菌的数量与原样品相比。初步结果表明, 该方法是一种可行的、可替代的合成防腐剂, 大大减少了干肉中的微生物负荷。

干燥作为传统的保存食物的方法已经被使用了从远古时代。如今, 对干燥的兴趣越来越浓厚, 作为一种有效的食品保鲜方法^1,2,3。它是用来制造各种特殊加工的肉类。其中最知名的是干。

干法是肉类保鲜的最古老的方法之一, 其基础是固化和干燥, 以降低水分活动, 从而延长其保质期⁴。如今, 干腌肉仍然很受欢迎, 食品的安全性、风味和质地是必不可少的。干制剂可用于几乎任何类型的肉类, 包括牛肉, 猪肉, 家禽, 或游戏⁵, 它需要切肉在瘦肉条和干燥。通常, 浸泡在固化溶液中的肉或吸烟与干燥一起使用, 以使干它的特色风味⁶。

尽管干燥的巨大兴趣, 以真正保存食物, 食源性暴发的风险由大肠杆菌从干燥肉是关键的, 需要控制。有一些研究报告食源性胃肠炎暴发, 特别是与大肠杆菌O157:H7, 归因于不充分的热处理在家庭干燥。即使在商业准备的生涩的^7、8、9中也发生类似情况。莱文et al。¹⁰建议, 食源性微生物可以在干燥条件 (约60°c) 的情况下生存。大肠杆菌O157:H7 二十世纪九十年代中旬的食源性疾病暴发归因于地面干肉制品^6,11。有趣的是, 在以前的所有病例中, 主要的风险是由被确认为可行但非可培养 (VBNC) 的细菌病原体引起的。在诸如温度变化或饥饿等各种压力下,大肠杆菌单元可以进入一个称为 VBNC 状态¹²¹³的特定状态。VBNC 细胞可以通过暴露在适当的条件下恢复到可培养细胞, 然后由于食源性污染而对人类健康构成威胁 14, 15.这意味着, 如果肉类是在干燥后立即消耗的产品, 它是安全的。但是, 如果储存不足, 如湿度增加, 病原体和微生物生长的复发风险很高。

除了干燥和腌料的方法, 消费者有很高的需求, 使用天然产品作为替代添加剂, 以改善食品质量^16,17。对肉类天然食品添加剂的应用特别感兴趣, 而不是传统的合成防腐剂^18,19,20,21。尽管在干燥肉类时使用精油缺乏足够的实验证据, 但该领域早期的研究已经显示出积极的结果^22,23。

自中世纪以来, 人们已经认识到必需的油脂化合物 (EOCs) 的抗菌剂, 杀虫, 和寄生虫特征^24,25,26。今天, EOCs 是最重要的一组生物活性天然化合物的一部分。在不同的 EOCs 中, 麝香是其中一个最知名的。它由85% 以上的特奥²³组成。这种苯酚能防止微生物和化学物质在食物中变质。此外, 它的抗菌性能可能会改善与其他天然防腐剂^{2,27,28,29,30}。现在, 百里香 (胸腺), 一种属于唇形家族的药草, 已被公认为调味剂, 也是一种非常有效的肉类防腐剂 31.由加西亚-Díez et进行的一项研究。³⁰在肉类产品上发现, 与其他精油相比, 特奥对食源性致病菌的抑制作用更大。因此, 在干燥过程中施用精油, 有机会增加干肉的价值, 减少食源性疾病的风险。

在本协议中, 我们提出了一种新的方法来应用特奥在肉类干燥, 特别是使用它在蒸气形式直接在干燥室。为了评估, 我们使用麦克风来确定治疗样本中的致病菌与原生细菌的缺失。初步结果表明, 该方法是一种高效的合成防腐剂替代品, 大大减少了干肉中的微生物负荷。

1. 肉类制剂

1. 从当地的屠杀中获得一小块牛肉 (从股二头肌中的新鲜牛肉), 转移到实验室。
   注: 建议在常温下 (20-25 °c) 运输牛肉的腰部, 在密封袋内不超过20分钟。
2. 为了对牛肉肌肉的外层进行消毒, 在层流安全柜中, 用500毫升的挤压瓶喷洒 70% (v/v) 乙醇, 以洗涤肌肉。应用0.025 克乙醇每1厘米的肌肉表面² 。
3. 用小刀除去肉灌装的外表面, 以避免在肌肉内部残留乙醇。去掉大约3毫米的肌肉内部, 以保持肌肉的表面均匀。
4. 将肌肉包装在塑料密封袋中, 并将其转移到冰箱。
5. 储存的肌肉在-18 °c 1 天。然后, 解冻4摄氏度的冰冻肌肉6小时。
   注: 对于解冻, 建议将肌肉从冰箱移动到冰箱。
6. 在层流安全柜中, 用切肉机将每块肌肉切成0.5 厘米厚的切片。然后, 用小刀把它切成小 5 x 2.5 厘米²矩形样品。
7. 将长方形的肉类样品包装在塑料袋中, 并将其存放在-18 摄氏度的冷藏库中供以后使用。

2. 在层流安全柜中编制标准化的接种和接种程序

1. 准备标准化的接种 (1.5 x 10⁸ CFU/毫升) 的大肠杆菌ATCC 25922, 以接种肉类样品。
   1. 为准备库存接种, 首先将冻干细菌培养 (由供应商交付) 转化为15毫升灭菌管, 预填充10毫升消毒的米勒韩丁汤 (BMHB)。在37摄氏度培养24小时的悬浮液。
      1. 准备细菌库存解决方案如下: 采取大约 0.1-0.2 毫升的细菌悬浮和稀释成一个20毫升瓶封闭与橡胶塞子与铝帽预填充与15毫升的灭菌 BMHB。在37摄氏度培养24小时的悬浮液。
      2. 存放在冰箱内的4°c 为标准化接种的准备。
   2. 从库存解决方案 (见步骤 2.1.1) 的大肠杆菌采取大约 0.1-0.2 毫升的细菌悬浮和稀释在15毫升塑料灭菌管预填充10毫升消毒的韩丁汤 (BMHB)。在37摄氏度的24小时内孵化试管。
   3. 为编制标准化的接种 (1.5 x 10⁸ CFU/毫升), 添加少量此悬浮在15毫升灭菌管预填充与10毫升的灭菌 BMHB。
   4. 彻底涡旋混合物, 并测量光学密度 (OD) 在600毫微米由密度计³²。
   5. 重复步骤 2.1.3 2.1.4, 直到表示为麦克法兰值的 OD 比清洁 BMHB 的值增加0.5。
2. 为接种做法, 安置长方形肉样品在二个不同的铝箔 (20 cm x 30 cm), 一个为控制样品和第二为被接种的肉样品。
   1. 在第二个铝箔, 接种原始的长方形肉样品与800µL 细菌悬浮的选定的菌株 (这对应于 1.2 x 10⁸ CFU 每肉样品) 通过均匀地分布接种在表面。
      1. 吸管400µL 在样品的一边和轻轻地传播使用无菌的细胞摊铺机在表面上。让他们干10分钟. 在样品的另一侧对其余的悬浮液重复相同的过程。

3. 干燥和特奥应用

1. 将含有矩形肉类样品的铝箔从层流安全柜转移到烘干机: 用铝箔盖住, 然后将样品放在烘干机内。
2. 在标准的实验室烘干机中进行干燥。
   注: 首先, 预热烤箱到摄氏55摄氏度。此过程可以持续20分钟。
   1. 干燥控制样品6小时在55°c, 与干燥空气相对湿度值从 30-45% 不等。
      注: 干燥空气相对湿度值根据液体从肉类中蒸发的速率而变化。
3. 计算所应用的特奥体积, 并将必要的油浓度表示为每烘干机容积 (mL/升空气) 的特奥量。例如, 1.5 毫升的特奥在53升 (干燥机容积) 的剂量导致浓度为0.028 毫升/升空气。要确定特奥的 MIC 为大肠杆菌, 使用剂量1.5 毫升 (0.028 毫升/升空气), 1 毫升 (0.019 毫升/升空气) 和0.75 毫升 (0.014 毫升/升空气)。
4. 在烘干之前, 为应用特奥蒸气 (以麝香作为主要化合物 79%), 浸泡一张滤纸 (12 cm x 20 cm) 与1.5 毫升药量的特奥并且安置入烘干机在风扇前面。
5. 使用与对照样品相同的程序 (步骤3.1 和 3.2) 将特奥特处理的肉类样品烘干。
   注: 干燥过程结束后, 样品被除去, 在烤箱上打开3小时, 在80摄氏度, 并设置空气阀指示100% 排气口, 以清洁的基本油残渣从烤箱。

4. 微生物分析

1. 在肉接种与细菌之前, 检查肉样品为任何掺假。粘液的出现和发现任何强烈和刺鼻的气味都表明了肉类的腐烂。如果纹理感觉黏糊糊的, 细菌可能已经开始在肉的表面繁殖。
2. 为了评估接种效率, 对原接种的样品进行试验, 检测是否存在大肠杆菌ATCC 25922, 并将其与未接种的对照样品进行比较。为此目的:
   1. 清洗每个肉类样本 (2 个控制样本和2种接种样本)。用缓冲的蛋白胨水 (8.5 克氯化钠) 将每个肉类样品挂在消毒瓶中. 1 克的蛋白胨, 5 片磷酸盐缓冲盐水, 1 克的吐温80在1升水) 的比率为 1:10 (瓦特/v), pH 值范围从 7-7.3。在室温下用 140 rpm 的摇床摇动10分钟。
      注: 在接种程序后立即冲洗。
   2. 用经调整的 6 x 6 滴板程序, 对钢板计数琼脂 (PCA) 和麦康凯琼脂 (MCA) 中的陈、Nace 和欧文³³进行总结, 评估细菌数量。
      注: 6 x 6 滴法采用发酵液微稀释法, 用多通道吸管制备研究样品的10倍系列稀释, 比常规方法³³更节省劳动密集型和更经济性³⁴。
   3. 用 6 x 6 稀释法培养10倍的系列样品, 用于评价大肠杆菌。
      注: 特别为 6 x 6 下落方法, 为耕种使用六5µL 下落, 从六选择的稀释被调查的样品与多通道吸管。在适当干燥的培养皿上, 滴入琼脂迅速吸收, 这种方法的种植非常方便和易于管理的³⁴。
   4. 孵育培养皿在37°c 为24小时。在培养期后, 根据第5节所述, 评估培养皿 (CFU g^-1 ) 中的大肠杆菌的菌落数量。
3. 干燥后, 取两个接种后的干样品, 并将其与两个干燥的非接种对照样品分别进行比较, 以进行可行的大肠杆菌。要确定此四samples 的存在或不存在大肠杆菌, 请按照以下步骤对每个肉类样品进行预浓缩过程:
   1. 将每个肉类样品挂在带有缓冲的蛋白胨水的消毒瓶中 (请参阅步骤 4.2.1), 并在室温下使用 140 rpm 10 分钟的振动筛进行摇动. 然后在6小时内孵化每瓶37摄氏度以进行预富集。
   2. 对于细菌的评价和培养, 按照步骤 4.2.2 4.2.4 中所述的相同步骤进行。

5. 审查结果

1. 孵化完成后, 从孵化器中取出培养皿, 并按如下方式检查结果:
   1. 为了评估菌落总数, 在 MCA 上检查温有氧细菌在 PCA (白点) 和典型的大肠杆菌菌落 (红到深粉色) 上存在的板块。如果病原体缺失, 两 agars 均无生长。
   2. 计算菌落数并确定大肠杆菌(CFU/g^-1干肉) 的数量。
      注意: 在连续的两个稀释 (图 1) 中, 计算30个或更少的菌落数 (N)。CFU/g^-1的干肉的编号N确定如下³⁵
      
      在其中, C是计数的所有水滴的菌落总数, v是每滴使用的样本稀释量 (这里, 0.05 毫升), n₁ 是第一稀释时使用的水滴数, n₂ 是滴数用于第二次稀释, d表示从其中捕获第一个计数的稀释。
2. 要分析微生物数据, 请将菌落数转换为日志 CFU g^-1 , 并将其与治疗的主要效果³⁶的方差分析 (方差计算) 进行比较。
   1. 对多个平均比较³⁶执行 Tukey 诚实显著差异测试 (Tukey HSD), 并确定治疗之间的显著差异。

我们首先开发了这种方法, 通过使用牛至精油 (OEO), 以提高食品安全和提高干肉的价值。一般而言, 上述实验表明, 在干燥过程中,大肠杆菌进入 VBNC 状态作为一种生存策略。这是由事实证明, 在干燥完成后没有可培养细菌 22.因此, 6 小时的预浓缩过程是必要的, 以允许计数的应变。在较短的时期内, 生长细胞的数量仍然非常低。结果是在预富集过程后, 不包括原接种样本, 表明接种效率的控制 (见表 1)。总的来说, 没有必要测试的特奥剂量3毫升 (0.057 毫升/升空气), 因为在我们以前的研究²²在 OEO 治疗后没有发现大肠杆菌, 它被评价为味道太强烈的消费者。因此, 对低浓度的特奥进行了测试, 以确定麦克风对大肠杆菌。

表 1显示了在55°c 为6小时的牛肉样品中的大肠杆菌的行为, 并接受了 PCA 和 MCA 的预富集过程. PCA 显示了温好氧细菌的生长, 如铜绿假单胞菌和大肠杆菌。MCA 标识大肠杆菌的存在。接种后的原始样品 (接种效率的控制) 平均达到5.31 日志 CFU g^-1细菌的人口, 为 PCA 和 MCA, 这意味着在过程开始的肉样品没有污染。干燥后, 分别观察未处理样品 (NoEO) 和0.75 毫升、1毫升和1.5 毫升 agars 的样品之间的显著差异(p <0.05)。这一结果显示了特奥治疗的成功表现, 减少了大肠杆菌计数, 同时增加了精油剂量。同时, 两个 agars 中的计数都非常相似, 这表明在预富集后, 样品呈现出大肠杆菌和其他细菌的不污染。显著地, 在1.5 毫升剂量的特奥治疗下消除了大肠杆菌。结果, 0.028 毫升/升空气中的特奥浓度被揭示为适当的麦克风对大肠杆菌由于在6小时的干燥在55°c 以后的 VBNC大肠杆菌(p < 0.05) 的相当减少。在对特奥的剂量和 PCA 和 MCA 的样本类型进行多重平均比较时, 观察到统计学差异 (参见表 1;Tukey HSD, p < 0.05)。

图 1: 在两个连续的稀释上计算菌落数 (N) 的演示, 其中每降30个或更少的殖民地.本例结果在37°c 的 PCA 培养皿的孵化后24小时。利用 6 x 6 滴法进行栽培, 六5µL 滴, 从六选择稀释的调查样本与多通道吸管。在适当干的培养皿, 在这种情况下, PCA, 生长的殖民地 (白点) 从两个连续的稀释 (10^-4和 10^-5) 枚举, 其中包含30或较少殖民地每下落。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: E 的行为的手段 (标准偏差) . 大肠杆菌ATCC 25922 (日志 CFU g^-1) 在一个传统的烘干机中, 在55°c 为 6 h 在被预富集 (PE) 为 6 h 和控制接种效率 (原始) 的两个板材干燥的牛肉样品计数琼脂 (PCA) 和麦康凯琼脂 (MCA)。同一列中的不同字母 ("a"、"b"、"c"、"d") 表示类别方法的统计分组, 表示显著差异 (p < 0.05)。剂量的特奥, 剂量的百里香精油;NoEO, 无精油;未检测到。报告的p值是从特奥的剂量和 PCA 和 MCA (Tukey HSD、 p < 0.05 表示统计意义) 的样本类型之间的多重平均值比较得出的。

先前的研究表明, 导致食源性疾病的微生物在干燥过程中生存了¹⁰。因此, 必须在干燥前应用防腐剂, 以保证食品安全。在这项研究中, 我们专注于使用特奥。其原因有两个方面: 第一, 消费者对使用天然产品作为替代添加剂以提高食品质量的需求很高¹⁶;其次, 前一项研究表明, 在肉类干燥过程中使用 OEO 的结果为²²。因此, 在肉类干燥过程中应用 OEO 的方法, 扩大到使用其他精油来控制微生物负荷。

在以前的研究中, 我们已经测试了 OEO, 以改善食品安全和提高干肉的价值。我们早先的研究结果表明, 使用 OEO 在肉类干燥中成功地抑制了大肠杆菌, 因为在55摄氏度干燥6小时后,大肠杆菌活计数显著降低, OEO²²1.5 毫升 (0.028 毫升/升空气)。在本研究中, 我们采用了特奥法。结果表明, 通过使用该方法, 可以检测、枚举和减少干肉样品中的 VBNC大肠杆菌。然而, 特奥的使用有限制, 由于感官属性, 因为它影响的味道, 气味, 和质地的干肉产品。由于这个原因, 必须建立必要的麦克风来防止大肠杆菌的生长, 特别是导致食源性感染的致病细菌。

在这两种情况下, 1.5 毫升剂量的 OEO 和特奥治疗均减少了大肠杆菌。由于这两项研究, 0.028 毫升/升空气的浓度分别为 OEO 和特奥, 被表明为麦克风对大肠杆菌, 由于 VBNC大肠杆菌(p < 0.05) 的计数显著下降后6小时的干燥在55摄氏度。表 1中的结果显示, 在用1.5 毫升的特奥处理的样本中,大肠杆菌被删除。在这方面, 没有必要测试特奥的3毫升 (0.057 毫升/升空气) 剂量。此外, 先前的一项研究表明, 在精油治疗后, 未检测到3毫升 OEO 剂量的细菌 (²²)。因此, 在本议定书中使用了更低剂量的特奥特。这种消除的大肠杆菌与事实相关联, 即特奥含有麝香, 这是一个非常有效的必要的油化合物, 以防止微生物活动。特别地, 它是一个主要的和主要被认可的化合物抗菌株的大肠杆菌^37,38。

该协议主要是标准化的屏幕 VBNC大肠杆菌使用预富集的干肉样品6小时, 以允许计数的菌株 (这是必要的, 因为没有可培养细菌后, 完成干燥)。该协议有可能被用来检测其他食源性病原体, 例如, 干肉制品中的沙门氏菌肠炎和李斯特氏李斯特菌, 但需要在这一领域进行更多的研究。

有关食源性病原体的调查是非常动态的, 涉及一个多步骤的过程, 可能会因具体情况和当地环境条件而异。这些调查是重要的, 因为他们促进使用天然添加剂在不同的食品保存技术。据我们所知, 这些研究是第一个揭示了一种新的方法, 在肉类干燥过程中应用精油, 特别是在蒸气形式直接在干燥室。结果表明, 该方法是合成添加剂的有效选择, 大大减少了干肉中微生物的生长。为将来的研究, 建议与其他精油和/或其他保存方法结合使用的剂量优化, 以评估这些协同作用的抗菌作用。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了热带 AgriSciences 学院内部赠款机构的支持 (项目编号: 20175013) 和 CIGA 20182023 两项赠款, 来自捷克生命科学大学。