一种直接从一滴血液中快速中性粒细胞趋化分析的片上方法

本文提供了通过在单个微流体芯片上整合来自全血的片上嗜中性粒细胞分离和趋化性测试来进行快速嗜中性粒细胞趋化性测定的详细方法。

嗜中性粒细胞迁移和趋化性对我们身体的免疫系统至关重要。微流控装置越来越多地用于调查嗜中性粒细胞迁移和趋化性，因为它们具有实时可视化，精确控制化学浓度梯度产生以及降低的试剂和样品消耗的优点。最近，微流体研究人员正在越来越多地努力开发直接从全血中开发整合且易于操作的微流体趋化性分析系统。在这个方向上，第一个全芯片方法被开发用于整合嗜中性粒细胞的磁性负性纯化和来自小血容量样品的趋化性测定。这种新方法允许在25分钟内快速进行样品至结果嗜中性粒细胞趋化性测试。在本文中，我们提供了详细的构建，操作和数据分析方法，用于片上趋化性测定，讨论故障排除策略，limi重点和未来发展方向。显示了使用这种全芯片方法测试定义的化学引诱物， N-甲基-Mult-Leu-Phe（fMLP）和来自慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的痰的中性粒细胞趋化性测定的代表性结果。该方法适用于许多细胞迁移相关调查和临床应用。

趋化因子是一种有针对性的细胞迁移到可溶性化学物质浓度梯度的过程，在很多生物学过程中都是非常重要的，包括免疫反应^1,2,3 ，组织发育⁴和癌症转移⁵ 。嗜中性粒细胞是最丰富的白细胞亚群，在使身体的先天宿主防御功能以及介导适应性免疫反应^6,7中发挥关键作用。嗜中性粒细胞配备有高度调节的趋化机制，允许这些运动免疫细胞通过化学疗法8对病原体衍生的化学引诱物（ 例如 fMLP）和宿主衍生的化学引诱物（ 例如白细胞介素-8）作出反应。嗜中性粒细胞迁移和趋化性介导各种生理问题和疾病如炎症和癌症^1,9 。因此，准确评估嗜中性粒细胞趋化性为研究嗜中性粒细胞生物学和相关疾病提供了重要的功能读数。

与广泛使用的常规趋化性测定（ 例如 transwell测定¹⁰ ）相比，由于精确控制的化学梯度产生和小型化^，微流控装置显示出对定量评估细胞迁移和趋化性的巨大前景^11,12,13 。在过去二十年左右，已经开发出各种微流体装置来研究不同生物细胞类型，特别是中性粒细胞¹¹的趋化性。大量的努力是用于描述时空复合物中嗜中性粒细胞迁移的特征配置在微流体装置^14,15中的液晶梯度。还开发了有趣的策略来研究使用微流体装置的嗜中性粒细胞的定向决策16。从生物学方面研究，微流体装置的应用已经扩展到临床样本用于疾病评估^17,18,19 。然而，许多微流体装置的使用仅限于专门的研究实验室，并且需要从大量血液样品中获得长时间的嗜中性粒细胞分离。因此，直接从一滴全血^{20,21,22 ，}ef"> 23,24。

朝着这个方向，开发了一种全面的片上方法，其将磁性中性粒细胞纯化和随后的趋化性测定整合到单个微流体装置^25上 。这种全片式方法具有以下新颖的特征:1）与以前的片上策略相比，通过基于粘附的细胞捕获或基于细胞大小的滤波来分离嗜中性粒细胞^20,22 ，这种新方法允许高纯度，中性粒细胞与小体积全血的片上磁分离，以及化学诱导剂刺激时的趋化性测量; 2）细胞对接结构有助于使嗜中性粒细胞的初始位置靠近化学梯度通道，并允许简单的趋化性分析，而无需单细胞追踪; 3）中和粒细胞分离和chemot的整合在单个微流体装置上的轴测定允许在实验步骤之间没有中断的25分钟内快速的样品 - 结果趋化性分析。

本文提供了一个详细的协议，用于这种全片式趋化性测定的构建，操作和数据分析方法。该文件证明了通过测试已知的重组化学引诱物和来自患者的复杂趋化性样品来进行中性粒细胞趋化性的开发方法的有效使用，随后关于故障排除策略，限制和未来方向的讨论。

所有人类样品采集方案均由温尼伯曼尼托巴大学联合学院研究伦理委员会批准。

微流体装置制造（ 图1A ）

1. 设计和打印透明面具。
   1. 设计设备如前所述²⁵ 。参见图1A 。
      注意:设备包括两层。第一层（4μm高）限定了细胞对接屏障通道，以将细胞捕获在梯度通道旁边。第二层（60μm高）定义了梯度产生通道，电池负载的端口和通道，化学品入口容器和废物出口。对准标记设计用于两层。对于第二层，上游蛇形输入通道的长度和宽度分别为60mm和200μm;下游的长度和宽度蛇形输入通道分别为6 mm和280μm。
   2. 使用高分辨率打印机将第一和第二层功能打印到透明蒙版。
      注意:打印分辨率取决于设计中的最小功能。在目前的设计中，选择了32,000 dpi，最小为10μm。
2. 清洁硅片。
   1. 将硅片放入等离子体清洁机中。施加真空3分钟。
   2. 打开等离子电源并将电平设置为高电平。使用氧等离子体处理硅晶片30分钟。
   3. 关闭等离子体清洁器并取出硅片;硅晶片准备用于制造器件模具。
3. 在洁净室中通过光刻制造第一层。
   注意:精确的制造参数可能因加工设备而异。
   1. 稀释10 mL SU-8 2025，用10 mL SU-8 2000在玻璃破碎机中制备设计的光致抗蚀剂。将混合物放在通风橱中10分钟，直到气泡消失。
   2. 用合适的卡盘小心地将清洁的硅晶片放在旋转器上，并施加真空以固定硅晶片。
   3. 小心地将3mL的光致抗蚀剂混合物倒入硅晶片的中心。以500 rpm旋转5 s。然后以3,000rpm旋转30秒以获得硅晶片上的最终4μm厚度的光致抗蚀剂涂层。
   4. 小心地从旋转器中取出硅晶片，并在95℃下将硅晶片在电热板上烘烤4分钟。
   5. 将硅晶片小心地放置在掩模对准器上，并将UV曝光时间设置为6 s。使用胶带小心地将第一层的透明面具贴在透明玻璃板上。
   6. 将带有附着面罩的透明玻璃板轻轻放置在对准器上，并将面罩与硅晶片对准。暴露silicon晶圆到UV以图案化细胞对接结构。
   7. 小心地取出玻璃板并取出暴露的硅晶片。在95℃将硅片烘烤4分钟。
   8. 将硅晶片转移到通风橱，并将其放入含有SU-8显影剂的玻璃盘中。轻轻摇动30秒。
   9. 使用新鲜SU-8显影剂，然后通风柜内的异丙醇（IPA）清洁硅晶片。通风柜内的氮气干燥硅晶片;第一层准备好了。
4. 在第一层制作第二层。
   1. 使用胶带覆盖第一层上的对准标记。将具有第一层的硅晶片小心地放置在旋转器的真空吸盘上，并施加真空以固定硅晶片。
   2. 在硅晶片上倒入3 mL的SU-8 2025光致抗蚀剂。以500rpm将硅晶片旋转5秒。然后以2000rpm旋转30分钟以在硅晶片上获得最终的60μm厚度的光致抗蚀剂涂层。
   3. 小心地将硅晶片从旋转器中取出并将其转移到电热板;在65℃烘烤2分钟。
   4. 轻轻取出胶带以露出第一层上的对准标记。将硅片放在电热板上，在95℃烘烤6分钟。
   5. 小心地将硅晶片放置在掩模对准器上，并将UV曝光时间设置为18秒。
   6. 使用胶带小心地将第二层的透明掩模贴在透明玻璃板上。
   7. 小心地将附有面罩的玻璃板放在校准器上，并使用对准器的检查显微镜，通过交叉对准标记将掩模和硅晶片上的第一层对准。
   8. 将光致抗蚀剂涂覆的硅晶片暴露于UV以对电池负载和梯度通道进行图案化。
   9. 小心取出玻璃板，取出硅胶AFER。将硅晶片在65℃的热板上烘烤2分钟，然后将硅晶片转移到另一个95℃的热板上并烘烤6分钟。
   10. 将硅晶片转移到通风橱，并将其放入含有SU-8显影剂的玻璃盘中。轻轻摇动6分钟。
   11. 使用新鲜的SU-8显影剂，然后在通风橱内通过IPA清洁硅晶片。
   12. 使用通风柜内的氮气干燥硅晶片。将硅晶片置于电热板上，并在150℃下硬模烘30分钟;第二层就绪。
5. 主模表面改性。
   注意:将硅烷化表面改性步骤应用于SU-8模具以便于在软光刻中从模具中脱离聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
   1. 将10μL十三氟-1,1,2,2-四羟基辛基（三氯硅烷）溶液置于微量移液管尖端。将微量移液器吸头放入15 mL塑料管中请松开管子的盖子。
   2. 将管和SU-8图案化的硅晶片放置在干燥器内并施加真空1小时;面罩模具准备好用于制造PDMS设备。
6. 制造PDMS设备。
   1. 通过在塑料烧杯中混合40g PDMS碱和4g固化剂来制备PDMS溶液。将准备好的SU-8母模置于培养皿中，小心地将44g PDMS溶液倒入模具中。
   2. 将培养皿放置在干燥器中，并施加真空以使PDMS溶液脱气20分钟。然后将培养皿放入烤箱中，并在80℃下将PDMS固化2小时。
   3. 烘烤后，取出培养皿，放在干净的工作台上。从SU-8模具小心切割和剥离PDMS板。
   4. 使用3mm直径的冲孔机冲出电池加载端口。使用6毫米直径的冲孔机冲出化学品入口容器和废物出口。
   5. 清除上的灰尘使用胶带的PDMS板的表面。将PDMS板和干净的玻璃片放入等离子机中。应用真空3分钟。
   6. 打开等离子电源并将电平设置为高电平。轻轻调整空气阀和等离子体处理PDMS板和玻璃板3分钟。
   7. 关闭等离子体电源并释放真空。用镊子小心取出PDMS板和玻片。
   8. 立即将PDMS板（通道结构面朝下）放在玻片的顶部;轻轻按下PDMS板将其固定在玻璃上。立即用去离子水填充微流体通道;完成微流体装置的制造和组装。

微流控细胞迁移测定法

1. 微流体装置制备。
   1. 通过将50μL的股票纤连蛋白溶液（1mg / mL）稀释至950来制备50μg/ mL纤连蛋白溶液81; L Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）在生物安全柜内。
   2. 通过将9mL Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI-1640）和1mL含4％牛血清白蛋白（BSA）的RPMI-1640混合来制备迁移培养基。
   3. 从设备中取出去离子水。
   4. 从出口向设备中加入100μL纤连蛋白溶液。等待3分钟，以确保所有通道都充满纤连蛋白溶液。将微流体装置放置在覆盖的培养皿中，室温下1小时。
   5. 从设备中取出纤连蛋白溶液。从出口添加100μL迁移介质。等待3分钟以确保所有通道都填充有迁移介质。
   6. 在室温下再孵育1小时;然后该装置准备进行趋化实验。
2. 化学吸附剂溶液制备趋化实验。
   1. 在t中制备100nM fMLP溶液口服1mL迁移培养基。将5μL含有FITC-葡聚糖（10kDa，1mM）的溶液与1.5mL管中的fMLP溶液混合。
      注意:FITC-Dextran用于梯度测量。或者，使用罗丹明作为梯度指示剂。然后将fMLP化学引诱剂溶液准备用于趋化实验。
3. 痰样品制备。
   注意:通过COPD患者的痰样品梯度诱导的嗜中性粒细胞趋化性作为这种全片式方法的临床诊断应用进行了测试。
   1. 获得人类道德规范来收集COPD患者的痰样品。
      注意:我们获得批准在温尼伯的七橡综合医院收集样品（由马尼托巴大学批准）。
   2. 从所有科目获取知情的书面同意书。
   3. 收集COPD患者的自发性痰样品。将500μL痰样品放入1.5 mL管中。
   4. 加入500μL0.1％di硫代苏糖醇在1.5 mL管中轻轻混匀。将管置于37℃的水浴中15分钟。
   5. 将样品以753 xg离心10分钟，然后收集上清液。以865xg离心上清5分钟，然后收集最终上清液。将收集的上清液储存在-80°C冷冻箱中，然后再使用。
   6. 准备进行趋化性实验时，解冻痰液;将900μL迁移培养基转移到1.5 mL管中，并与生物安全柜内的100μL痰液混合;然后痰液可用于趋化实验。
4. 血样收集。
   1. 获得人类道德规范，从健康捐赠者收集血液样本。从所有献血者处获得知情的书面同意书。
      注意:这些样品是在温尼伯维多利亚综合医院获得的（由马尼特大学联合研究伦理委员会批准OBA）。
   2. 通过静脉穿刺收集血液样品，并将样品放入EDTA涂层的管中。在实验之前将管保持在生物安全柜中。

3.片上趋势测定操作

1. 片上细胞分离（ 图1B ）。
   1. 将10μL全血置于生物安全柜内的1.5 mL管内。
      注意:血液采集的细节在2.4节。
   2. 从嗜中性粒细胞分离试剂盒（参见材料表）中加入2μL抗体混合物（Ab）和2μL磁性颗粒（MP），放入1.5 mL管中，轻轻混匀;这将标记血液中的细胞，除了嗜中性粒细胞。
   3. 在室温下孵育血液中的Ab-MP混合物5分钟。
      注意:这将磁性标记血液中标记抗体的细胞。
   4. 将两个小磁盘连接到电池单元的两侧ort的设备。从设备的所有端口吸出介质。
   5. 慢慢地从细胞装载端口将2μL血液 - Ab-MP混合物移液到微流体装置中。
      注意:磁性标记的细胞被捕获到细胞加载端口的侧壁，而嗜中性粒细胞将流入该装置并被捕获在细胞对接结构上。
   6. 等待几分钟，直到足够的嗜中性粒细胞被困在细胞对接区域。
2. 趋化性测定（ 图1C ）。
   1. 将微流控装置置于37℃的温度控制显微镜下。
   2. 使用两个移液器将100μL化学引诱物溶液（fMLP或痰液）和100μL迁移培养基添加到其指定的入口储存器中;这将通过由加压辅助的连续层流化学混合在梯度通道中产生化学引诱剂梯度e平衡结构。
      注意:COPD患者的痰液收集细节在2.3节。
      1. 对于中等对照实验，仅向两个入口储层添加迁移介质。
   3. 获得梯度通道中FITC-葡聚糖的荧光图像。
   4. 使用命令"File | Open"将图像导入ImageJ软件。
   5. 使用命令"Analyze | Plot Profile"测量梯度通道上的荧光强度曲线。
   6. 将测量数据导出到电子表格以进一步绘制。
   7. 在温度控制的显微镜阶段或常规细胞培养箱中孵育该装置15分钟。
   8. 使用10X目标对梯度通道进行成像，以记录单元格的最终位置进行数据分析。
   9. 如果需要，通过延时显微镜记录设备中的细胞迁移。

细胞迁移Data分析（ 图1C ）

1. 通过计算从对接结构的细胞迁移距离来分析趋化性测定，如下所述。参见图1C 。
2. 将图像导入NIH ImageJ软件（版本1.45）。
3. 选择移动到渐变通道的每个单元格的中心。
4. 测量所选单元格的最终位置的坐标。测量对接结构边缘处的点的坐标作为初始参考位置。
5. 将测量的坐标数据导出到电子表格软件（ 例如 Excel）。计算细胞的迁移距离，作为细胞的最终位置与沿着梯度方向的初始参考位置之间的差异。
6. 校准到千分尺的距离。计算所有细胞的迁移距离的平均值和偏差作为趋化性的量度。
7. 比较迁移在使用Student's t检验的介质对照实验中存在化学引诱剂梯度时的配给距离。
8. 如果记录细胞迁移的延时图像，可以通过细胞跟踪分析¹⁵进一步分析细胞迁移和趋化性。
   注意:构建和执行片上趋化性测定所需的材料详见材料表。

嗜中性粒细胞直接在微流体装置中从一滴全血中选择。通过片上吉姆萨染色验证了分离的嗜中性粒细胞的纯度，结果显示中性粒细胞典型的环状和叶状核（ 图2A ） ²⁵ 。这表明从小体积的全血中可以获得高纯度的片上嗜中性粒细胞分离。此外，对接结构可以在施加化学梯度（ 图2B ） ²⁵之前有效地将细胞与梯度通道相邻。

梯度发生基于连续层流化学混合，流动由来自不同级别的入口和出口溶液的压差驱动。不需要外部泵。化学梯度t在微流体装置中在几分钟内建立，其特征在于FITC-葡聚糖穿过梯度通道的荧光强度分布。梯度稳定至少1小时，这是目前嗜中性粒细胞趋化性实验的足够时间（ 图1C ）。

为了证明使用片上方法进行细胞迁移研究，比较了单独培养基或fMLP梯度中的嗜中性粒细胞趋化性。试验结果表明，在中等对照实验中，少数细胞通过屏障通道爬行。相比之下，许多嗜中性粒细胞迅速移动穿过屏障通道并向100nM fMLP梯度迁移（ 图2B ） ²⁵ 。细胞迁移试验通过迁移距离定量测量，其显着高于中等对照组（fMLP梯度） 图2C） ²⁵ 。

此外，通过将单独培养基中的嗜中性粒细胞迁移与COPD患者的痰样品梯度进行比较，证明了片上方法的潜在临床应用。结果显示强烈的细胞迁移到COPD痰液梯度，其与中等对照相比显着更高的迁移距离（ 图2B - C ） ²⁵定量表示。

图1:用于嗜中性粒细胞趋化性分析的全片式方法的图示。 （ A ）微流体装置的图示。该设备包括两层。第一层（4微米高）限定纤维l对接屏障通道将细胞捕获在梯度通道旁边。第二层（60μm高）限定了梯度产生通道，电池负载的端口和通道，化学品入口容器和废物出口。对准标记是为两层设计的。对于第二层，上游蛇形输入通道的长度和宽度分别为60mm和200μm;下游蛇形输入通道的长度和宽度分别为6 mm和280μm; （ B ）片上细胞分离方法的图示; （ C ）趋化性试验的图示。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2:代表性的结果片上嗜中性粒细胞趋化性分析²⁵ 。 （ A ）Giemsa染色图像（使用60X物镜）在微流体通道中的片上分离的细胞; （ B ）培养基对照细胞分布，100nM fMLP梯度和COPD痰梯度的比较; （ C ）介质对照梯度通道中的平均细胞迁移距离，fMLP梯度和COPD痰梯度。误差条表示平均值（SEM）的标准误差。 *表示从学生的t检验p <0.05。数字从参考²⁵改编自世界科学出版社许可。 请点击此处查看此图的较大版本。

在本文中，描述了在单个微流体芯片上直接从全血中分离嗜中性粒细胞并进行趋化性试验的详细方案。该方法易于操作，阴性选择高纯度中性粒细胞，快速样品至结果趋化性测试，减少试剂和样品消耗，以及精确的细胞迁移数据分析，提供了有用的功能。粗略估计，来自输入全血样本的嗜中性粒细胞的至少25％有效地进入装置中的对接结构，并且通过片上吉姆萨染色发现嗜中性粒细胞纯度高。

这种开发的片上趋化性分析方法在各种细胞迁移研究和临床应用中具有巨大的潜力。通过比较介质中的嗜中性粒细胞趋化性与fMLP梯度，证明了该方法的研究应用。类似地，该方法可用于测定COPD spu中的嗜中性粒细胞趋化性作为开发临床诊断的细胞功能生物标志物的例子。使用这种方法，研究人员可以单独或组合地容易地将嗜中性粒细胞趋化性测试到不同的化学引诱物。研究人员还可以使用该方法测试患者的复合趋化因子和患病患者的嗜中性粒细胞趋化性反应的嗜中性粒细胞趋化性。这种集成的片上全面方法对于在没有专门的细胞培养和活细胞成像设施的研究或临床实验室中进行测试特别有用。测试可以由研究人员或临床医生按照本协议操作。对于更先进的研究应用，该方法允许延时显微镜跟踪单个细胞运动。

一般来说，这种全片式方法易于操作，结果稳​​健。一些技术提醒将进一步确保一个成功的实验。首先，在等离子体接合期间，应将PDMS复制品轻轻按压到类基板上，以避免损坏非常薄的屏障通道。第二，细胞加载口中介质的蒸发可能会扰乱化学梯度。推荐在趋化性试验期间用密封片覆盖细胞装载口。第三，血液样本应轻轻地装载到设备上，以避免在趋化实验之前将细胞推到屏障通道上的高压。第四，在目前的环境中，我们建议在趋化学测定期间将磁铁连接到细胞装载端口，以防止不必要的细胞进入通道。或者，具有通孔的PDMS和附接的磁盘的单独的PDMS可以与设备的电池加载端口对准。在这种情况下，在细胞分离后，可以从器件中去除具有磁盘和捕获的细胞的顶部PDMS部分。

这个全能的ip方法可以进一步开发，以克服目前的局限性，并改进和扩展其功能。首先，当前的设备一次只允许单个测定，从而限制吞吐量。具有多个并联测试单元的设备的进一步开发将提高实验吞吐量要求。其次，目前基于流量的化学梯度发生器限制了1D中的梯度产生。二维或三维无流动梯度发生器的进一步发展将更好地模拟生理梯度条件。第三，除了嗜中性粒细胞之外，这种全片式方法原则上可以用于使用类似的磁性细胞分离试剂盒来测试其他白细胞类型，例如T细胞，B细胞和NK细胞。研究这种方法是否可以有效地用于测试较低频率的血细胞群体和那些在趋化性试验之前需要片内活化和培养的细胞是非常重要的。然后再进行片上细胞分离法对于其他一些应用程序进一步扩展。测试不同屏障通道厚度，结果表明3-4μm最适合中性粒细胞迁移实验;也就是说，它充分捕获未刺激的细胞，并允许细胞在刺激时爬过屏障通道。屏障通道尺寸应针对不同的电池类型进行优化。最后，这种综合和快速的趋化性测试将使研究人员能够探索相关的临床应用。为了在临床上进行实际测试，开发了集成了微流体装置，温度和载物台控制以及基于智能手机的光学成像和数据分析模块的便携式系统。除本文所示的COPD相关研究外，其他相关疾病如慢性肾脏疾病的细胞迁移正在使用这种全片式方法进行测试。

没有利益冲突的披露。

这项工作部分得到加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）的资助。感谢温尼伯维多利亚维多利亚综合医院和温尼伯七橡综合医院临床应用研究与教育研究所，负责管理人类临床样本。我们感谢Hagit Peretz-Soroka博士有关测定操作策略的有益讨论。 我们非常感谢滑铁卢大学的卡罗琳教授和陈晓明博士在拍摄过程中的慷慨支持。