طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم

توفر هذه المقالة طريقة مفصلة لإجراء فحص الكيميائي العدلة السريع عن طريق دمج العزلة على رقاقة العدلات من الدم الكامل واختبار الكيميائي على رقاقة ميكروفلويديك واحدة.

العدلات الهجرة و الكيميائي حاسمة لجهاز المناعة في الجسم. وتستخدم الأجهزة ميكروفلويديك على نحو متزايد للتحقيق الهجرة العدلات والكيماوية نظرا لمزاياها في التصور في الوقت الحقيقي، ومراقبة دقيقة لتوليد تركيز تركيز الكيميائية، وانخفاض كاشف واستهلاك العينة. في الآونة الأخيرة، وقد بذلت جهود متزايدة من قبل الباحثين ميكروفلويديك نحو تطوير متكاملة وسهلة التشغيل نظم تحليل الكيميائي ميكروفلويديك، مباشرة من الدم كله. في هذا الاتجاه، وقد تم تطوير أول طريقة على كل رقاقة لدمج تنقية سلبية المغناطيسي من العدلات والمقايسة الكيميائي من عينات حجم الدم الصغيرة. هذه الطريقة الجديدة تسمح السريعة عينة إلى نتيجة اختبار العدلات الكيميائي في 25 دقيقة. في هذه الورقة، ونحن نقدم مفصلة البناء والتشغيل وتحليل البيانات طريقة لهذا الفحص الكيميائي الكل على رقاقة مع مناقشة حول استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ييميوالتوجهات والاتجاهات المستقبلية. تظهر النتائج التمثيلية للاختبار الكيميائي العدلات اختبار كاشف كيميائي محدد، N -Formyl-ميت-ليو-ف (فملب)، والبلغم من مرض الانسداد الرئوي المزمن (كوبد)، وذلك باستخدام هذه الطريقة كل على رقاقة. هذا الأسلوب ينطبق على العديد من التحقيقات المتعلقة بالهجرة الخلية والتطبيقات السريرية.

الكيميائي، وهي عملية موجهة للهجرة الخلية للذوبان التدرج الكيميائي التدرج، وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الاستجابة المناعية ^{1 ، 2 ، 3} ، تطوير الأنسجة ⁴ والسرطان الانبثاث ⁵ . العدلات هي مجموعة فرعية من خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتلعب أدوارا حاسمة في تمكين وظائف الدفاع المضيف الفطرية الجسم، وكذلك في الوساطة الاستجابات المناعية التكيفية ^{6 ، 7} . وقد تم تجهيز العدلات بآلات كيميائية عالية التنظيم تسمح لهذه الخلايا المناعية المتحركة بالاستجابة لكل من الممتصات الكيميائية المستمدة من الممرضات (على سبيل المثال فملب) والمشتقات الكيميائية المستمدة من المضيف (على سبيل المثال إنتيرليوكين 8) من خلال إيمشيموتاكسيس ⁸ . العدلات الهجرة والكيميائية توسط مختلف المشاكل الفسيولوجيةوالأمراض مثل الالتهابات والسرطانات ^{1 ، 9} . وبالتالي، فإن التقييم الدقيق للالعدلات الكيميائي يوفر قراءات وظيفية هامة لدراسة البيولوجيا العدلات والأمراض المرتبطة بها.

بالمقارنة مع المقايسات الكيميائي التقليدية المستخدمة على نطاق واسع (على سبيل المثال مقايسة ترانسويل ¹⁰ )، وأجهزة ميكروفلويديك تظهر وعدا كبيرا لتقييم الكمي للهجرة الخلية والكيماوية بسبب جيل التدرج الكيميائي تسيطر على وجه التحديد والتصغير ^{11 ، 12 ، 13} . على مدى العقدين الماضيين أو نحو ذلك، وقد وضعت مختلف الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الكيميائي من أنواع الخلايا البيولوجية المختلفة، وخاصة العدلات ¹¹ . وقد كرس جهد كبير لتوصيف الهجرة العدلات في تشي معقد من الناحية المكانية التدرجات ميكال التي تم تكوينها في الأجهزة ميكروفلويديك ^{14 ، 15} . وقد وضعت استراتيجيات مثيرة للاهتمام أيضا لدراسة اتخاذ القرارات الاتجاهية عن طريق العدلات باستخدام الأجهزة ميكروفلويديك 16.Aside من البحوث الموجهة بيولوجيا، وقد تم تمديد تطبيقات الأجهزة ميكروفلويديك لاختبار العينات السريرية لتقييم المرض ^{17 ، 18 ، 19} . ومع ذلك، فإن استخدام العديد من الأجهزة ميكروفلويديك يقتصر على مختبرات البحوث المتخصصة ويتطلب العزلة العدلات مطولة من حجم كبير من عينات الدم. لذلك، كان هناك اتجاه متزايد لتطوير أجهزة ميكروفلويديك متكاملة للتحليل الكيميائي العدلات السريع مباشرة من قطرة من الدم الكامل ^{20 ، 21 ، 22 ،}إف "> 23 ^{، 24} .

نحو هذا الاتجاه، تم تطوير طريقة كل على رقاقة أن يدمج تنقية العدلات السلبية المغناطيسية والمقايسة الكيميائي اللاحقة على جهاز ميكروفلويديك واحد ²⁵ . هذه الطريقة على كل رقاقة لديه الميزات الجديدة التالية: 1) على النقيض من الاستراتيجيات السابقة على رقاقة أن عزل العدلات من الدم عن طريق الالتصاق الخلية القائمة على الالتصاق أو الخلية القائمة على حجم الترشيح ^{20 ، 22} ، هذه الطريقة الجديدة تسمح عالية النقاء، على رقاقة الفصل المغناطيسي من العدلات من كميات صغيرة من الدم كله، فضلا عن قياس الكيميائي على التحفيز الكيميائي. 2) هيكل لرسو السفن الخلية يساعد على محاذاة المواقف الأولية للعدلات قريبة من قناة التدرج الكيميائية ويسمح تحليل الكيميائي بسيط دون تتبع خلية واحدة. 3) دمج العزلة العدلات و تشيموتمحور الفحص على جهاز واحد ميكروفلويديك يسمح السريع تحليل عينة إلى نتيجة الكيميائي في 25 دقيقة عندما لا يكون هناك انقطاع بين الخطوات التجريبية.

توفر هذه الورقة بروتوكول مفصل لبناء وتشغيل وطريقة تحليل البيانات من هذا كله على رقاقة الفحص الكيميائي. وتظهر الورقة الاستخدام الفعال للطريقة المتقدمة لأداء الكيميائي العدلات عن طريق اختبار معروفة كيميائي المؤتلف المعروفة وعينات كيميائية معقدة من المرضى، تليها مناقشة حول استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والقيود والاتجاهات المستقبلية.

وتمت الموافقة على جميع بروتوكولات جمع العينات البشرية من قبل مجلس أخلاقيات البحوث المشتركة بين أعضاء هيئة التدريس في جامعة مانيتوبا، وينيبيغ.

1. ميكروفلويديك جهاز تلفيق ( الشكل 1A )

1. تصميم وشفافية قناع الطباعة.
   1. تصميم الجهاز كما هو مفصل سابقا ²⁵ . انظر الشكل 1 أ .
      ملاحظة: يتضمن الجهاز طبقتين. الطبقة الأولى (4 ميكرون عالية) يحدد الخلية قناة لرسو السفن لاقتراض الخلايا بجانب قناة التدرج. الطبقة الثانية (60 ميكرون عالية) يحدد قناة توليد التدرج، والميناء وقناة لتحميل الخلايا، وخزانات مدخل الكيميائية ومخرج النفايات. تم تصميم علامات المحاذاة للطبقتين. للطبقة الثانية، وطول وعرض قناة الإدخال اعوج المنبع هو 60 مم و 200 ميكرون، على التوالي. طول وعرض المصبقناة اعوج الإدخال هو 6 ملم و 280 ميكرون، على التوالي.
   2. اطبع ملامح الطبقة الأولى والثانية إلى قناع الشفافية باستخدام طابعة عالية الدقة.
      ملاحظة: تعتمد دقة الطباعة على الحد الأدنى من الميزات في التصميم. في التصميم الحالي، تم اختيار 32،000 نقطة في البوصة لمدة 10 ميكرون الحد الأدنى من الميزات.
2. تنظيف رقاقة السيليكون.
   1. وضع 3 في رقاقة السيليكون في منظف البلازما. تطبيق فراغ لمدة 3 دقائق.
   2. تشغيل الطاقة البلازما وتعيين مستوى إلى عالية. استخدام البلازما الأكسجين لعلاج رقاقة السيليكون لمدة 30 دقيقة.
   3. إيقاف نظافة البلازما وإخراج رقاقة السيليكون. رقاقة السيليكون مستعدة لتصنيع قالب الجهاز.
3. تصنع الطبقة الأولى بواسطة ضوئيات في منشأة غرف الأبحاث.
   ملاحظة: قد تختلف المعلمات تلفيق الدقيق اعتمادا على منشأة تصنيع.
   1. تمييع 10 مل سو-8 2025 مع 10 مل SU-8 2000 في كسارة الزجاج لإعداد مقاومة للضوء مصممة. ترك الخليط في غطاء الدخان لمدة 10 دقيقة حتى تختفي الفقاعات.
   2. وضع بعناية رقاقة السيليكون تنظيفها على الدوار مع تشاك مناسبة وتطبيق الفراغ لشل رقاقة السيليكون.
   3. صب بعناية 3 مل من خليط مقاومة للضوء على مركز رقاقة السيليكون. تدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان. ثم تدور في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على النهائي 4 ميكرون سمك طلاء مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون.
   4. إزالة بعناية رقاقة السيليكون من الدوار ويخبز رقاقة السيليكون على موقد لمدة 4 دقائق في 95 درجة مئوية.
   5. وضع بعناية رقاقة السيليكون على قناع اليجنر وتعيين وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى 6 ثوان. نعلق بعناية قناع الشفافية من الطبقة الأولى على لوحة زجاجية شفافة باستخدام شريط لاصق.
   6. ضع بلطف لوحة الزجاج الشفاف مع قناع المرفقة إلى ألينر ومحاذاة قناع مع رقاقة السيليكون. فضح سيليكون رقاقة إلى الأشعة فوق البنفسجية لنمط هيكل لرسو السفن الخلية.
   7. إزالة بعناية لوحة من الزجاج وإخراج رقاقة السيليكون المكشوفة. خبز رقاقة السيليكون على موقد لمدة 4 دقائق في 95 درجة مئوية.
   8. نقل رقاقة السيليكون إلى غطاء الدخان ووضعه في وعاء زجاجي يحتوي على سو-8 المطور. هز بلطف هذا لمدة 30 ثانية.
   9. تنظيف رقاقة السيليكون باستخدام الطازجة سو-8 المطور تليها الأيزوبروبيل (إيبا) داخل غطاء الدخان. تجفيف رقاقة السيليكون بواسطة غاز النيتروجين داخل غطاء الدخان. الطبقة الأولى جاهزة.
4. قم بتفريق الطبقة الثانية على الطبقة الأولى.
   1. استخدام شريط لاصق لتغطية علامات المحاذاة على الطبقة الأولى. وضع بعناية رقاقة السيليكون مع الطبقة الأولى على تشاك فراغ الدوار وتطبيق فراغ لشل رقاقة السيليكون.
   2. صب 3 مل من سو-8 2025 مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون. تدور رقاقة السيليكون في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان. ثم تدور في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30ثانية للحصول على النهائي 60 ميكرون سمك طلاء مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون.
   3. إزالة بعناية رقاقة السيليكون من الدوار ونقله إلى موقد؛ خبز في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
   4. إزالة الشريط اللاصق بلطف لفضح علامات المحاذاة على الطبقة الأولى. وضع رقاقة السيليكون على موقد والخبز في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
   5. وضع بعناية رقاقة السيليكون على قناع اليجنر وتعيين وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية لتكون 18 ثانية.
   6. نعلق بعناية قناع الشفافية للطبقة الثانية على لوحة زجاجية شفافة باستخدام شريط لاصق.
   7. ضع بعناية لوحة من الزجاج مع قناع المرفقة إلى أليغنر، ومحاذاة القناع والطبقة الأولى على رقاقة السيليكون بواسطة علامات محاذاة العبور باستخدام المجهر التفتيش من أليغنر.
   8. فضح رقاقة السيليكون المغلفة مقاومة للضوء إلى الأشعة فوق البنفسجية لنمط تحميل الخلية وقنوات التدرج.
   9. إزالة بعناية لوحة من الزجاج وإخراج السيليكون ثعفر. خبز رقاقة السيليكون على موقد في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ومن ثم نقل رقاقة السيليكون إلى 95 درجة مئوية لوحة ساخنة أخرى والخبز لمدة 6 دقائق.
   10. نقل رقاقة السيليكون إلى غطاء الدخان ووضعه في وعاء زجاجي يحتوي على سو-8 المطور. هز بلطف هذا لمدة 6 دقائق.
   11. تنظيف رقاقة السيليكون باستخدام الطازجة سو-8 المطور تليها إيبا داخل غطاء الدخان.
   12. تجفيف رقاقة السيليكون باستخدام غاز النيتروجين داخل غطاء الدخان. وضع رقاقة السيليكون على موقد ويصعب خبز القالب في 150 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة الثانية جاهزة.
5. ماستر العفن تعديل السطح.
   ملاحظة: يتم تطبيق خطوة تعديل سطح سيلانيزاتيون إلى سو-8 العفن لتسهيل بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) الافراج عن القالب في لينة الطباعة الحجرية.
   1. خذ 10 ميكرولتر من تريديكافلورو-1،1،2،2-تيترايدروكتيل (ثلاثي كلوروزيلان) الحل في طرف ميكروبيبيت. وضع طرف ميكروبيبيت في أنبوب بلاستيكي 15 مل أند قم بتخفيف الغطاء من الأنبوب.
   2. وضع أنبوب و سو-8 منقوشة رقاقة السيليكون داخل المجفف وتطبيق الفراغ لمدة 1 ساعة. القناع العفن جاهز لافتعال بدمس الجهاز.
6. تفريق الجهاز بدمس.
   1. إعداد الحل بدمس عن طريق خلط 40 غرام بدمس قاعدة و 4 ز وكيل علاج في كوب من البلاستيك. وضع استعداد سو-8 العفن الرئيسي في طبق بتري وتصب بعناية 44 غرام حل بدمس على القالب.
   2. وضع طبق بتري في مجفف وتطبيق فراغ إلى ديغاس حل بدمس لمدة 20 دقيقة. ثم ضع طبق بتري في الفرن وعلاج بدمس في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   3. بعد الخبز، واخراج طبق بتري ووضعه على مقاعد البدلاء نظيفة. قطع بعناية وقشر قبالة بدمس بلاطة من سو-8 العفن.
   4. لكمة خارج ميناء التحميل الخلية باستخدام 3 مم الناخس القطر. لكمة من الخزانات مدخل الكيميائية ومخرج النفايات باستخدام الناخس قطرها 6 ملم.
   5. إزالة الغبار علىسطح بدمس بلاطة باستخدام شريط لاصق. وضع بلاطة بدمس وشريحة زجاجية نظيفة في آلة البلازما. تطبيق الفراغ لمدة 3 دقائق.
   6. تشغيل الطاقة البلازما وتعيين مستوى إلى عالية. ضبط بلطف صمام الهواء و بلازماتريت بدمس بلاطة والشريحة الزجاجية لمدة 3 دقائق.
   7. إيقاف الطاقة البلازما والافراج عن فراغ. تأخذ بعناية من بدمس بلاطة والشريحة الزجاجية باستخدام ملاقط.
   8. وضع على الفور بدمس بلاطة (مع هياكل قناة وجه لأسفل) على رأس الشريحة الزجاجية. اضغط بلطف بدمس بلاطة لسندات إلى الزجاج. ملء قناة ميكروفلويديك مع الماء منزوع الأيونات على الفور. اكتمال تصنيع الجهاز ميكروفلويديك والتجمع.

2. ميكروفلويديك خلية الهجرة إعداد الفحص

1. إعداد جهاز ميكروفلويديك.
   1. إعداد 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين عن طريق تمييع 50 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين الأسهم (1 ملغ / مل) إلى 95081؛ L دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
   2. إعداد وسيلة الهجرة عن طريق خلط 9 مل معهد روزويل بارك التذكاري المتوسطة (رمي-1640) و 1 مل من رمي-1640 مع 4٪ ألبومين المصل البقري (بسا).
   3. إزالة الماء منزوع الأيونات من الجهاز.
   4. إضافة 100 ميكرولتر حل فبرونيكتين للجهاز من منفذ. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن جميع القنوات مليئة حل فبرونيكتين. وضع جهاز ميكروفلويديك في طبق بتري مغطاة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   5. إزالة حل فبرونيكتين من الجهاز. إضافة 100 المتوسطة الهجرة ميكرولتر من منفذ. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن جميع القنوات مليئة المتوسطة الهجرة.
   6. احتضان الجهاز لمدة 1 ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. الجهاز هو ثم جاهزة لتجربة الكيميائي.
2. إعداد حل تشيمواتراكتانت لتجربة الكيميائي.
   1. إعداد 100 نم حل فملب في رأوتال 1 مل المتوسطة الهجرة. مزيج 5 ميكرولتر من الأسهم فيتس-ديكستران (10 كيلو دالتون، 1 ملم) مع حل فملب في أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: يستخدم فيتس-ديكستران لقياس التدرج. بدلا من ذلك، استخدم رودامين كمؤشر التدرج. الحل فيملب تشيمواتراكتانت هو ثم جاهزة للتجربة الكيميائي.
3. إعداد عينة البلغم.
   ملاحظة: تم اختبار الكيميائي العدلات الناجم عن التدرج من عينة البلغم من مرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن باعتبارها تطبيق التشخيص السريري لهذه الطريقة كل على رقاقة.
   1. الحصول على بروتوكول الأخلاق البشرية لجمع عينات البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن.
      ملاحظة: حصلنا على موافقات لجمع العينات في مستشفى سيفين أوكس العام في وينيبيغ (التي وافقت عليها جامعة مانيتوبا).
   2. الحصول على استمارات موافقة خطية مستنيرة من جميع المواد الدراسية.
   3. جمع عينات مرض البلغم عفوية المرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن. مكان 500 ميكرولتر عينة البلغم في أنبوب 1.5 مل.
   4. إضافة 500 ميكرولتر 0.1٪ ديثيوثريتول في أنبوب 1.5 مل وخلط بلطف. وضع أنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   5. الطرد المركزي العينة في 753 x ج لمدة 10 دقيقة ثم جمع طاف. الطرد المركزي طاف في 865 x ج لمدة 5 دقائق ثم جمع طاف النهائي. تخزين طاف التي تم جمعها داخل الفريزر -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
   6. عندما تكون جاهزة لتجربة الكيميائي، ذوبان الجليد الحل البلغم. نقل 900 ميكرولتر المتوسطة الهجرة إلى أنبوب 1.5 مل وتخلط مع 100 ميكرولتر حل البلغم داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. الحل البلغم هو ثم جاهزة للتجربة الكيميائي.
4. جمع عينات الدم.
   1. الحصول على بروتوكول أخلاقيات الإنسان لجمع عينات الدم من المانحين الأصحاء. الحصول على استمارات موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم.
      ملاحظة: تم الحصول على عينات هنا في مستشفى فيكتوريا العام في وينيبيغ (التي وافق عليها مجلس أخلاقيات البحوث المشتركة بين أعضاء هيئة التدريس في جامعة مانيتأوبا).
   2. جمع عينة الدم عن طريق الوريد ووضع العينة في أنبوب المغلفة إدتا. الحفاظ على أنبوب في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية قبل التجربة.

3. آل-أون-تشيب كيميائي فحص عملية

1. على رقاقة العزلة الخلية ( الشكل 1B ).
   1. مكان 10 ميكرولتر الدم كله في أنبوب 1.5 مل داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
      ملاحظة: تفاصيل جمع عينات الدم في القسم 2.4.
   2. إضافة 2 ميكرولتر الأجسام المضادة كوكتيل (أب) و 2 ميكرولتر الجسيمات المغناطيسية (مب) من العدلة عدة العزلة (انظر الجدول من المواد) في أنبوب 1.5 مل و مزيج بلطف. وهذا سوف تسمية الخلايا في الدم ما عدا العدلات.
   3. احتضان خليط الدم أب-مب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: هذا سوف علامة مغناطيسيا الأجسام المضادة المسمى الخلايا في الدم.
   4. إرفاق اثنين من الأقراص المغناطيسية الصغيرة إلى جانبي تحميل خلية صأورت من الجهاز. نضح المتوسطة من جميع موانئ الجهاز.
   5. ببطء ماصة 2 ميكرولتر الدم أب-مب خليط في الجهاز ميكروفلويديك من ميناء تحميل الخلية.
      ملاحظة: المحاصرين المسمى الخلايا مغناطيسيا إلى الجدران الجانبية من ميناء تحميل الخلية في حين أن العدلات سوف تتدفق في الجهاز وتصبح محاصرين في هيكل لرسو السفن الخلية.
   6. انتظر بضع دقائق حتى المحاصرين ما يكفي من العدلات في منطقة لرسو السفن الخلية.
2. الكيميائي مقايسة ( الشكل 1C ).
   1. وضع جهاز ميكروفلويديك على درجة الحرارة المرحلة المجهر التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية.
   2. إضافة 100 ميكرولتر حل تشيمواتراكتانت (فملب أو حل البلغم) و 100 ميكرولتر الهجرة المتوسطة لخزانات مدخل المعينة باستخدام اثنين بيبيتورس. وهذا سيولد التدرج الكيميائي في قناة التدرج عن طريق المستمر الصفحي تدفق القائم على خلط الكيميائية بمساعدة بريسورe موازنة هيكل.
      ملاحظة: تفاصيل جمع البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن في القسم 2.3.
      1. بالنسبة إلى تجربة التحكم المتوسط، لا تضيف سوى وسيط الترحيل إلى كل من خزانات الإدخال.
   3. الحصول على صورة مضان من فيتس-ديكستران في قناة التدرج.
   4. استيراد الصورة إلى برنامج إيماجيج باستخدام الأمر "ملف | فتح".
   5. قياس التشكيل الجانبي مضان عبر قناة التدرج باستخدام الأمر "تحليل | مؤامرة الملف الشخصي".
   6. تصدير بيانات القياس إلى جدول بيانات لمزيد من التآمر.
   7. احتضان الجهاز على درجة الحرارة مرحلة المجهر التي تسيطر عليها أو في التقليدية حاضنة ثقافة الخلية لمدة 15 دقيقة.
   8. صورة قناة التدرج باستخدام هدف 10X لتسجيل المواقف النهائية الخلايا لتحليل البيانات.
   9. إذا لزم الأمر، تسجيل الهجرة الخلية في الجهاز عن طريق الفاصل الزمني الفاصل الزمني.

4. خلية الهجرة دتحليل آتا ( الشكل 1C )

1. تحليل مقايسة الكيميائي عن طريق حساب مسافة الهجرة الخلية من هيكل لرسو السفن كما هو موضح أدناه. انظر الشكل 1 ج .
2. استيراد الصورة إلى نيه إيماجيج البرمجيات (الإصدار 1.45).
3. حدد مركز كل خلية انتقلت إلى قناة التدرج.
4. قياس إحداثيات الخلايا المحددة لمواقعها النهائية. قياس إحداثيات نقطة على حافة هيكل لرسو السفن كموقف مرجعي الأولي.
5. تصدير بيانات الإحداثيات المقاسة إلى برنامج جداول بيانات ( مثل إكسيل). احسب مسافة الترحيل للخلايا كالفرق بين الموضع النهائي للخلية والموقع المرجعي الأولي على طول اتجاه التدرج.
6. معايرة المسافة إلى ميكرومتر. حساب متوسط ​​وانحراف مسافة الهجرة من جميع الخلايا كمقياس الكيميائي.
7. قارن بين ميغمسافة التموين في وجود التدرج الكيميائي إلى تجربة التحكم المتوسط ​​باستخدام t -test الطالب.
8. إذا تم تسجيل الصور الفاصل الزمني للهجرة الخلية، يمكن إجراء المزيد من التحليل للهجرة الخلية و الكيميائي عن طريق تحليل تتبع الخلية ¹⁵ .
   ملاحظة: المواد المطلوبة لبناء وأداء فحص الكيميائي على رقاقة على النحو المفصل في جدول المواد.

يتم اختيار العدلات سلبا من قطرة من الدم كله مباشرة في الجهاز ميكروفلويديك. تم التحقق من نقاء العدلات معزولة من قبل على رقاقة جيمزا تلطيخ وأظهرت النتائج نموذجية على شكل حلقة ونوى الفص على شكل العدلات ( الشكل 2A ) ²⁵ . وهذا يدل على فعالية العزلة على رقاقة العدلة في نقاء عالية من حجم صغير من الدم الكامل. وعلاوة على ذلك، يمكن للهيكل لرسو السفن محاذاة بشكل فعال الخلايا بجانب قناة التدرج قبل تطبيق التدرج الكيميائي ( الشكل 2B ) ²⁵ .

ويستند جيل التدرج على المستمر خلط الصفحي الكيميائية خلط، وتدفق التدفقات من قبل فرق الضغط من مستويات مختلفة من حلول مدخل ومخرج. لا توجد مضخات خارجية مطلوبة. المادة الكيميائية غرادينيتم إنشاء t في غضون بضع دقائق في الجهاز ميكروفلويديك، والذي يتميز الملف الشخصي كثافة مضان من فيتس-ديكستران عبر قناة التدرج. التدرج مستقر لمدة 1 ساعة على الأقل، وهو ما يكفي من الوقت للالخلايا العدلة التجربة الكيميائي الحالي ( الشكل 1C ).

ولتوضيح استخدام طريقة الكل على رقاقة لأبحاث الهجرة الخلية، تمت مقارنة الكيميائي العدلات في المتوسطة وحدها أو في التدرج فملب. وأظهرت نتائج الاختبار أن عدد قليل من الخلايا التي تم الزحف إليها من خلال قناة الحاجز في تجربة التحكم المتوسط. على النقيض من ذلك، العديد من العدلات انتقلت بسرعة من خلال قناة الحاجز وهاجر نحو 100 نم فملب التدرج ( الشكل 2B ) ²⁵ . يتم قياس اختبار ترحيل الخلية كميا عن طريق مسافة الهجرة، وهو أعلى بكثير من التدرج فملب من السيطرة المتوسطة ( الشكل 2C) ²⁵ .

وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت طريقة على كل رقاقة للتطبيقات السريرية المحتملة عن طريق مقارنة الهجرة العدلات في المتوسطة وحدها إلى التدرج من عينة البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن. وأظهرت النتائج هجرة الخلايا القوية إلى التدرج البلغم البلغم، والذي أشار كميا من قبل مسافة الهجرة أعلى بكثير مقارنة مع السيطرة المتوسطة ( الشكل 2B - C ) ²⁵ .

الشكل 1: توضيح من كل على رقاقة طريقة تحليل العدلة الكيميائي. ( A ) التوضيح لجهاز ميكروفلويديك. يتضمن الجهاز طبقتين. الطبقة الأولى (4 ميكرون عالية) يعرف سيلل قناة لرسو السفن الحاجز لفخ الخلايا بجانب قناة التدرج. الطبقة الثانية (60 ميكرون عالية) يحدد قناة توليد التدرج، والميناء وقناة لتحميل الخلية، وخزانات مدخل الكيميائية ومخرج النفايات. تم تصميم علامات المحاذاة للطبقتين. للطبقة الثانية، وطول وعرض قناة الإدخال اعوج المنبع هو 60 مم و 200 ميكرون، على التوالي. طول وعرض قناة الإدخال اعوج المصب هو 6 ملم و 280 ميكرون، على التوالي. ( B ) التوضيح من جميع على رقاقة طريقة العزلة الخلية. ( C ) رسم توضيحي للاختبار الكيميائي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نتائج ممثلتحليل العدلة الكيميائي العدلات على كل رقاقة ²⁵ . ( A ) جيمزا تلطيخ صورة (باستخدام هدف 60X) من جميع على رقاقة الخلايا المعزولة في قناة ميكروفلويديك. ( ب ) مقارنة توزيع الخلايا في السيطرة المتوسطة، 100 نم فملب التدرج والتدرج البلغم كوبد. ( C ) متوسط ​​مسافة هجرة الخلية في قناة التدرج في التحكم المتوسط، والتدرج فملب والتدرج البلغم كوبد. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط ​​(سيم). * يشير إلى p <0.05 من t -test الطالب. تم تكييف الأرقام من المرجع ²⁵ مع إذن من النشر العلمي العالمي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه الورقة، تم وصف بروتوكول مفصل لعزل مباشرة العدلات من الدم الكامل تليها اختبار الكيميائي، وكلها على رقاقة ميكروفلويديك واحدة. هذا الأسلوب يوفر ميزات مفيدة في عملية سهلة، واختيار السلبية من العدلات عالية النقاء، سريع عينة إلى نتيجة اختبار الكيميائي، الكواشف المخفضة واستهلاك العينة، وتحليل البيانات الهجرة الهجرة دقيقة. كما تقدير تقريبي، على الأقل 25٪ من العدلات من مدخلات عينة الدم كاملة دخلت بشكل فعال في هيكل لرسو السفن في الجهاز، وجدنا النقاء العدلات عالية من قبل على رقاقة جيمزا تلطيخ.

هذا وضعت كل على رقاقة تحليل الكيميائي طريقة لديها إمكانات كبيرة في مختلف البحوث الهجرة الخلية والتطبيقات السريرية. وقد تم تطبيق تطبيق بحثي لهذه الطريقة عن طريق مقارنة الكيميائي العدلة في المتوسطة وحدها إلى التدرج فملب. وبالمثل، يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار الكيميائي العدلات في سبد كوبدتوم كمثال على تطوير علامة حيوية وظيفية الخلية للتشخيص السريري. مع هذا الأسلوب، يمكن للباحث بسهولة اختبار الكيميائي العدلات لمختلف تشيمواتراكتانتس بشكل فردي أو في توليفات. يمكن للباحثين أيضا اختبار الكيميائي العدلات لعوامل كيميائية معقدة من المرضى أو اختبار العدلات من المرضى المرضى لاستجابة كيميائية تغيرت يحتمل أن تستخدم هذه الطريقة. هذا متكامل على كل رقاقة على طريقة مفيدة بشكل خاص لإجراء الاختبار في البحوث أو المختبرات السريرية التي لا تملك ثقافة الخلايا المتخصصة ومرافق التصوير الخلية الحية. الاختبار يمكن تشغيلها بسهولة من قبل الباحثين أو الأطباء بعد هذا البروتوكول. لمزيد من التطبيقات البحثية المتقدمة، وهذا الأسلوب يسمح الوقت الفاصل بين المجهري لتتبع حركة الخلية الفردية.

بشكل عام، هذا هو كل شيء على رقاقة طريقة سهلة التشغيل والنتيجة هي قوية. سوف العديد من التذكير الفني مواصلة ضمان تجربة ناجحة. أولا، ثه بدمس نسخة طبق الأصل يجب الضغط بلطف على الطبقة الركيزة خلال الترابط البلازما لتجنب إتلاف قناة الحاجز رقيقة جدا. ثانيا، تبخر الوسط في ميناء تحميل الخلية يمكن أن يزعج التدرج الكيميائي. فمن المستحسن لتغطية ميناء تحميل الخلية مع علامة التبويب ختم خلال اختبار الكيميائي. ثالثا، يجب أن يتم تحميل عينة الدم بلطف على الجهاز لتجنب ارتفاع الضغط الذي يمكن دفع الخلايا عبر قناة الحاجز قبل التجربة الكيميائي. رابعا، في الوضع الحالي، ونحن نوصي إبقاء المغناطيس تعلق على ميناء تحميل الخلية خلال فحص الكيميائي لمنع الخلايا غير المرغوب فيها من دخول القناة. بدلا من ذلك، يمكن محاذاة قطعة منفصلة من بدمس مع من خلال حفرة والأقراص المغناطيسية المرفقة إلى ميناء تحميل الخلية للجهاز. في هذه الحالة، الجزء العلوي بدمس مع الأقراص المغناطيسية والخلايا المحاصرين يمكن إزالتها من الجهاز بعد عزل الخلية.

هذا الكل على اساس تشيمكن تطوير طريقة الملكية الفكرية للتغلب على القيود الحالية وتحسين وتوسيع وظائفها. أولا، الجهاز الحالي يسمح فقط فحص واحد في وقت مما يحد من الإنتاجية. سوف مزيد من تطوير الجهاز مع وحدات اختبار موازية متعددة تحسين متطلبات الإنتاجية التجريبية. ثانيا، مولد التدفق الكيميائي القائم على التدفق الحالي يحد من جيل التدرج في 1D. مزيد من التطوير من 2D أو 3D تدفق خالية من التدرج مولدات سوف تقليد أفضل الظروف التدرج الفسيولوجية. ثالثا، بالإضافة إلى العدلات، ويمكن استخدام هذه الطريقة على رقاقة من حيث المبدأ لاختبار أنواع أخرى من خلايا الدم البيضاء مثل الخلايا التائية والخلايا البائية والخلايا نك باستخدام مجموعات مماثلة من الخلايا المغناطيسية العزلة. سيكون من المهم لدراسة ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل فعال لاختبار السكان خلية الدم في التردد المنخفض وهذه الخلايا التي تتطلب تنشيط على رقاقة والثقافة قبل اختبار الكيميائي. ثم كل على رقاقة الخلية العزلة طريقة كاليفورنياn تمديدها لبعض التطبيقات الأخرى. تم اختبار سمك قناة حاجز مختلفة وأظهرت النتائج أن 3-4 ميكرون هو الأكثر ملاءمة لتجربة الهجرة العدلات. وهذا هو، محاصرين بما فيه الكفاية الخلايا الامم المتحدة محفزة والسماح للخلايا للزحف من خلال قناة الحاجز على التحفيز. يجب تحسين بعد قناة الحاجز لأنواع الخلايا المختلفة. وأخيرا، فإن هذا الاختبار الكيميائي المتكامل والسريع يسمح للباحثين لاستكشاف التطبيقات السريرية ذات الصلة. ولتمكين الاختبارات العملية في العيادات، تم تطوير نظام محمول يدمج جهاز ميكروفلويديك، ودرجة الحرارة والتحكم في المرحلة، فضلا عن وحدات التصوير البصري وتحليل البيانات القائمة على الهاتف الذكي. بالإضافة إلى دراسة ذات الصلة بمرض الانسداد الرئوي المزمن كما هو موضح في هذه الورقة، يتم اختبار الهجرة الخلية للأمراض الأخرى ذات الصلة مثل مرض الكلى المزمن باستخدام هذه الطريقة على رقاقة.

لا يوجد تضارب في المصالح للكشف.

ويدعم هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا (نزيرك) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (سيهر). نشكر المعهد السريري للبحوث التطبيقية والتعليم في مستشفى فيكتوريا العام في وينيبيغ ومستشفى سيفين أوكس العام في وينيبيغ لإدارة العينات السريرية من البشر. نشكر الدكتور هاجيت بيريتز-سوروكا لمناقشة مفيدة حول استراتيجيات عملية الفحص. نشكر البروفيسور كارولين رن والدكتور شياو مينغ (كودي) تشن من جامعة واترلو لدعمهم السخي في عملية التصوير.