An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

的标准集氨基酸导致了一个非常广泛的蛋白质的功能。然而，该组的残基仍对潜在的蛋白的应用的限制。非规范的氨基酸的结合可以扩大这个范围。有用于非规范氨基酸结合两种互补的方法。为位点特异性掺入，除了内源性的规范平移机械，正交氨酰基-tRNA合成酶氨酰tRNA对必须提供不与规范那些交互。因此，未分配到典型的氨基酸，通常是一个终止密码子的密码子，也是必需的。此遗传密码膨胀使非经典氨基酸的掺入在蛋白质内一个单一的，给定的位点。在这里提出的工作描述了特定残基掺入，其中遗传密码是内源性的翻译系统内重新分配。翻译机器一ccepts的非规范氨基酸作为替代在标准地规定的地点， 即掺入它，在该蛋白质的典型氨基酸出现的所有被非规范取代。的非规范氨基酸掺入可以改变蛋白质的结构，从而引起相当改性的物理和化学性质。非规范氨基酸类似物常常充当细胞生长抑制剂表达宿主，因为它们修改内源性蛋白， 在体内蛋白质生产限制性的。 在体内的毒性非规范氨基酸掺入蛋白质仍然特别具有挑战性。这里，对于由非经典氨基酸L-刀豆氨酸的完全替代L-精氨酸的无细胞的方法，提出。它绕过体内表达的固有的困难。此外，包括准备靶蛋白进行质谱分析的协议。它表明，L-赖氨酸可以通过将L-羟基赖氨酸取代，尽管具有较低的效率。原则上，任何非规范氨基酸类似物可以使用所提出的方法，只要内源性体外翻译系统识别它被并入。

遗传密码是通用的生物圈。它的代码的一组20种经典氨基酸，有时由硒代¹或吡咯²延长。这是转换的帮助的tRNA的成折叠成蛋白质的氨基酸链的遗传密码的核糖体。规范氨基酸的官能团，与翻译后修饰组合，向一个非常广泛的蛋白质功能^3,4。原则上，由于该组有限的经典氨基酸功能限制可以通过进一步结合来克服，非规范氨基酸（NCAA锦标赛），使新的化学和新的功能^3,4-。

还有的NCAA锦标赛的结合两种互补的方法:在定点或特定渣掺入。前一种方法需要大量的技术难题，因为规范的一套氨酰-tRNA合成器的etases（的aaRS）和tRNA的必须由正交的aaRS酰tRNA对，必须不与内源性翻译机制相互作用进行扩展。基于仔细的工程，这种方法采用了NCAA锦标赛截至所需的蛋白质站点的单点突变。 NCAA锦标赛的位点特异性掺入基因由未分配给典型氨基酸（CAA），通常是一个终止密码子^5-9的密码子编码。这种方法需要在给定的网站在功能上的变化，而 ​​不是整个蛋白^10-13。

相反，具体的残基掺入依赖于规范翻译机器错误识别的非规范氨基酸。掺入的发生是由于缺乏的aaRS的底物特异性。 NCAA锦标赛的特定残基掺入，建立在科恩和同事¹⁴的工作，导致了重要的应用^3,10，其中蛋白质的生物正交标记^15-17或X射线晶体¹⁸蛋白质的结构解析。

由于天然的aaRS一般都喜欢在一个同构NCAA其同源的氨基酸，体内特定渣掺入效率通常需要营养缺陷型表达宿主不能合成NCAA的规范模拟。的宿主细胞培养在生长培养基中，可提供仅类似CAA的低浓度。它与补充的连续与NCAA组合枯竭迫使表达宿主纳入了NCAA到模型中的蛋白质在多个，规范地规定站点。与此相反的位点特异性的方式，这通常对整个蛋白结构的深的影响，从而导致相当修饰的蛋白质^19,20的物理和化学性质。然而，大多数的NCAA锦标赛的是表达宿主³生长抑制剂，因为它们被结合到许多其他PROT除了重组基因表达过程中的利益EINS。这清楚地限制了体内的方法。的氨基酸，是有毒或对蛋白质结构强的影响的体内掺入仍然特别具有挑战性。然而，这些分子的工程师具有非凡的功能的蛋白质中最有前途的。

一个例子是有毒的，非规范，天然存在的L-刀豆氨酸（CAN），L-精氨酸（Arg）的类似物。它影响和块ARG有关的调节和催化反应途径，以及其在活细胞的存在可以导致立即死亡^3,21-23。其纳入蛋白质精氨酸在位置可以减少蛋白质的稳定性^21-23。由于所得的毒性，含有在大肠杆菌 （ 大肠杆菌 ）和其它普通的表达宿主的蛋白质刀豆氨酸的表达仍然是一个挑战。由于这些原因，完整的体内我灿ncorporation在所有的精氨酸位置已经恰当地被证实只有一次^24，使用单阐述蛋白质的生产体系。然而，也已经被提出作为一种抗癌剂^25-27，并作为用于人²⁸自身免疫性疾病的刺激。此外，它受到在其抗代谢，抗细菌，抗真菌的各种研究和抗病毒特性²⁵的。这些特性提高了需求高效，​​易于执行的方法来表达可含有蛋白质为药用，医学和功能研究。

虽然连接到体内生产的许多问题可以使用无细胞表达系统来回避， 在体外特异性残基的办法只被很差探讨。已报道的L-色氨酸类似物²⁹和多个NCAA锦标赛³⁰的无细胞特异性残基结合。这些方法是基于高度efficient T7 RNA聚合酶。 T7 RNA聚合酶嗣继承噬菌体样转录，从而减少在比较源性转录遗传功能。

罐的完整特定残基掺入模型蛋白在所有精氨酸位置最近报道^31，使用无细胞表达系统^32。同一系统的一个稍微的改变通过停止启用不同的吡咯类似物的位点特异性并入模型蛋白抑制密码子^33。所采用的无细胞系统^{31 - 33}是基于一个所有大肠杆菌大肠杆菌转录-翻译系统。然而，它使蛋白表达尽可能有效电流噬菌体系统（0.5 -为1mg / ml重组蛋白^）32，同时保留大部分的原始转录-翻译模块化。

在这项工作中，一个详细的协议被提供关于如何渣油NCAA锦标赛的UE特定掺入可实现，使用此所有大肠杆菌大肠杆菌无细胞系统^32。此外，提出进一步的措施，准备通过HPLC-ESI质谱恰当的评价表达的蛋白质。为了扩大这种无细胞系统的特性，这项工作并不仅仅指灿^31日公布的合并，但也提出相关的非经典的L-赖氨酸模拟L-羟基赖氨酸新的数据。

为NCAA锦标赛的特定残基掺入下列协议是最近发表在朱庇特³⁴的协议的适应。后者协议描述如何执行与标准氨基酸高效无细胞表达。此外，它提出了粗无细胞提取物的制备中，氨基酸溶液，能量储备溶液，并在该方法中使用的能量缓冲器。以下方案相比集中在改性步骤将前面Protocol为了使NCAA锦标赛的特定残基掺入。校准的移液管，低结合枪头和微离心管建议的准备。在下面，使用IUPAC缩写为氨基酸。

注意！请咨询使用前的所有相关材料安全数据表（MSDS）。几个使用的化学品有剧毒。个人防护用品是必需的（光速蒙面侠，防尘口罩，手套，实验室外套，全长裤，封闭趾鞋），以及在通风橱工作。

1.氨基酸溶液制备方法

1. 在NCAA的原液制剂（168毫米）
   注:原液制备NCAA为精氨酸模拟描述可以用作示例。其他NCAA锦标赛因此适应值。
   1. 将1.5 ml的反应管到微。称取46.1毫克制罐的反应管内的1毫升168毫溶液的制备。使用无菌microspatula。为在NCAA的外消旋混合物，两倍的原液的浓度。
   2. 加入977微升无菌DDH ₂ O的彻底旋涡，直到灿是我ñ完全溶解。
      注:1毫升的整体解决方案体积，溶解氨基酸的物理卷进行补偿。为任何的氨基酸，以mg固体物质如微升相应的体积增加的估计一半（100毫克固体将在溶液中加入50μl体积^）35。大多数氨基酸可在该浓度中溶解。如果没有，降低的浓度，直到完全溶解。
   3. 直接使用NCAA原液1.2节或闪光制备的氨基酸溶液的冻结它在液氮中，并储存在-20℃。 小心！为安全起见，佩戴预防少儿近视和低温的手套，以从液体保护氮飞溅。
2. 氨基酸溶液的制备
   注:对于氨基酸溶液的制备，使用氨基酸采样提供20 CAAS的L异构体在不同的股票溶液在168毫的浓度，每（1.5毫升，用HEPES / KOH，<0.1％NaN ₃的，pH为7.5的缓冲），除了L-亮氨酸（140毫摩尔）。对于这些股票的解决方案的自制制剂（用KOH缓冲），按照此协议^35。
   1. 解冻的20 CAAS的储备液（氨基酸采样或根据³⁵准备）和NCAA在RT（第1.1节准备）。
   2. 解冻后，经常涡旋股票方案再次溶解任何沉淀的氨基酸。因为一些氨基酸更难溶解，在37℃下孵育它们在加热块，直到完全溶解。半胱氨酸可能无法完全溶解。将所有氨基酸冰，除了天冬酰胺，苯丙氨酸和半胱氨酸 - 这保持在室温下，避免沉淀。
   3. 使用下面的值使用完整的工具包的七分之一。
      注:按比例缩小适当地较小体积来工作，并保存该试剂盒用于进一步实验的部分。规模为incorporatNCAA锦标赛的离子为模型的蛋白质大规模。为了防止频繁的解冻，这很可能降低氨基酸的稳定性，分装的个别氨基酸原液成200μl的体积。这200微升等分体积和步骤1.2.4.1帐户用于因移液损失等分卷。
   4. 首先，准备将在步骤1.2.4.3拆分敲定3组成不同的氨基酸溶液（1.2.5节 - 1.2.7）的规定编制氨基酸母液的解决方案。在这些解决方案，集中所有的氨基酸在6毫米，除列伊（5毫米）。
      1. 无菌DDH ₂ O的传输1.4毫升到15毫升离心管中。把它放在冰上。加入175微升每种氨基酸原液。添加了一个又一个，除了CAA的原液 （ 如精氨酸）由NCAA所取代（例如 CAN）。每次加入后彻底涡，把解决回冰上。
         注意:亮氨酸是在5毫米的3不同组成的氨基酸溶液相比，6毫为其他氨基酸。浓度的降低不降低表达效率。扩展到6毫米合适的。
      2. 按以下顺序，以避免沉淀转移氨基酸原液:丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，HIS，异亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，亲，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，酪氨酸，亮氨酸，和Cys。请记住，不能添加 CAA（ 如精氨酸），它是类似于NCAA的原液（ 如 CAN）。最后，彻底的旋涡。孵育在37℃，以使溶液尽可能明确。
      3. 拆分这种氨基酸母液溶液倒入135毫升的三等量。每个转移的拆分卷成1.5毫升反应管。让他们在冰上。
   5. 准备由所有20中国农业科学院在每6毫米的浓度，除了亮氨酸是5mM的氨基酸溶液。先容Ø˚F1.35毫升，如在步骤1.2.4.3分裂，结果添加50微升CAA的168毫米原液（ 例如精氨酸），其类似于在NCAA的（ 例如 ，可）。彻底旋涡。
      1. 放回到冰上。分装在16微升体积的此1.4毫升溶液到反应管中。请注意，此溶液体积约导致85等分。这些标签等分"+ CAA"（ 例如，+精氨酸）。
      2. 闪光灯冷冻在液氮中并保存等分试样在-80℃。 小心！为安全起见，佩戴预防少儿近视和低温的手套，以从液氮飞溅保护。
   6. 准备一个由19 CAAS除了CAA（ 例如精氨酸），其类似于在NCAA（ 例如 ，罐）的氨基酸溶液。每个氨基酸添加到6毫米的浓度，除了亮氨酸（5毫米）。
      1. 加入50微升无菌DDH ₂ O至1.35毫升第二卷，作为分割的结果在步骤1.2.4.3。彻底涡放回冰上。分装在16微升体积的此1.4毫升溶液到反应管中。请注意，此溶液体积约导致85等分。这些标签等分" -民航局"（如 -精氨酸）。
      2. 闪光灯冷冻在液氮中并保存等分试样在-80℃。 小心！为安全起见，佩戴预防少儿近视和低温的手套，以从氮气飞溅保护。
   7. 准备一个包含19 CAAS氨基酸混合物的替代规范的一个NCAA（ 例如，CAN）（ 如精氨酸）。每个氨基酸添加到6毫米的浓度，除了亮氨酸（5毫米）。到最 ​​后1.35毫升体积，如在步骤1.2.4.3分裂，结果增加了NCAA的168毫米原液的50微升（ 例如 ，罐）。标记为"+ NCAA"（ 例如 ，+ CAN）。彻底涡放回冰上。
      1. 分装在16＃的卷本1.4毫升解决方案181，L为反应管。请注意，此溶液体积约导致85等分。这些标签等分"+ NCAA"（ 例如，+ CAN）。
      2. 闪光灯冷冻在液氮中并保存等分试样在-80℃。 小心！为安全起见，佩戴预防少儿近视和低温的手套，以从氮气飞溅保护。
         注:在步骤1.2.5.1，1.2.6.1和1.2.7.1使用的16微升等分卷是考虑到由于移液损耗比要求略高。

2.能源缓冲液配制

注:每个批次粗提物是独特的，需要优化的MG-的浓度和^K-34的谷氨酸。粗提取物等分试样量取决于蛋白质浓度^34。使用不同的值的计算提供的模板（参考文献1）。查找补充材料1图例，expla进一步的说明进不去如何利用这个模板。

1. 根据协议未修改³⁴准备并在-80℃保存14倍的能源解决方案和粗提物等分。取决于MG-和K-谷氨酸浓度为优化表达效率³⁴校准粗提取物。
   注:14倍能量溶液的最终组成是:700毫米的HEPES（pH8）中，21毫摩尔ATP，21毫GTP，12.6毫CTP，12.6毫UTP，2.8毫克/毫升的tRNA，3.64毫辅酶，4.62毫NAD，10.5毫营，0.95mm的亚叶酸，14毫米亚精胺，420毫米3-PGA。
2. 在冰上解冻的100毫米镁谷氨酸原液，3M K-谷氨酸原液，14倍的能源解决方案和40％PEG-8000准备的主结构。让他们在冰上。
3. 混合9.18微升100mM的镁谷氨酸原液，3.06微升的3M K -谷氨酸原液，21.86微升14倍能量溶液，15.3微升40％PEG-8000和1.6微升无菌DDH ₂ O中_的一个反应管中。彻底涡这个肥大呃每次加入后搅拌，并保持在冰上。
4. 分装主结构（51微升）到16微升（3等分）进入反应管的体积。常涡分装在主结构。闪冻在液氮中等分试样。
   注:16微升等分体积以及主音量组合是考虑到由于移液损耗比要求略高。
5. 使用过滤器，以收集能量缓冲管。在-80存储管℃。 注意！佩戴光速蒙面侠和低温手套以氮飞溅的保护。

3.准备工作和无细胞反应的执行对NCAA锦标赛中残留特异性掺入

1. 首先，准备在DDH ₂ O的DNA载体的解决方案
   1. 对于高效的蛋白表达，用表达载体的pbest-OR 2-OR 1-PR-UTR1-deGFP-T500 ^32。克隆该基因的编码模型蛋白质进入这个载体^{36,37 <}/ SUP>。
      注意:可替换地，使用由^σ70识别以及其它启动子，但请注意，表达效率可能会降低。
   2. 变换^37,38在大肠杆菌中的矢量大肠杆菌菌株KL 740 ^32（耶鲁CGCS＃:4382），净化扩增载体DNA ^37,39和量化的DNA溶液^40-42的浓度。储存在-20℃下将DNA溶液，或直接将其用于细胞 - 费反应制备（步骤3.4.1，3.4.2和3.4.3）。
2. 取决于根据未修改协议³⁴所使用的载体构建浓度校准无细胞表达效率。使用的最佳浓度，导致了无细胞反应制备最高蛋白质产率（步骤3.4.1，3.4.2和3.4.3）。
   注:无细胞反应的制备是使用90纳米载体DNA原液，导致10nM的最终载体浓度在无细胞例举反应，并遵循MG-和K-谷氨酸的上述最佳值以及该提取物等分试样的体积。使用不同的值的计算模板。
3. 在冰上3粗提取物的等分试样解冻各30微升体积的（按照未修改协议^34），1个氨基酸溶液等分部分标有"+ CAA"（ 例如 ，+精氨酸），1个氨基酸溶液等分部分标有" - CAA"（ 例如 -精氨酸）和1个氨基酸溶液等分标有"+ NCAA"（ 例如 ，+可）（节1.2.5准备- 1.2.7），3个能量缓冲等分（在第2制备）和载体DNA溶液（如3.1）。
   注:将粗提取物是微粘性和它可以含有气泡。通过在4℃以10,000 xg离心离心30秒除去气泡。把粗提物等分回到冰上。
4. 通过混合粗提取物（33.33％），能制备3不同组成的无细胞反应（各90微升最终体积）缓冲液（16.67％），在3不同组成氨基酸溶液的等分试样（16.67％）和载体DNA溶液1。任选地，进一步增加生物分子（DNA，蛋白质的tRNA 等 ），但适当地减少的DDH ₂ O的体积
   1. 制备参考无细胞反应（90微升）表达未修饰模型蛋白。
      1. 15微升能量缓冲液，15微升标记为"+ CAA"（ 例如 ，+精氨酸），10微升的90纳米载体DNA溶液和20μl无菌DDH的氨基酸溶液等分试样的添加₂ O到粗的30微升提取。通过加入各成分后，上下吹打，轻轻涡旋混合。
      2. 分装90微升无细胞反应中的6微升15相等体积。传送每个15卷到一个单独的反应管中。关闭管，并把它们放回冰上。标签的所有反应管为"CFR（+ CAA）"（ 例如 ，CFR（+精氨酸））。
   2. 准备阴性对照无细胞反应（90微升），其中无论是CAA（如精氨酸），也非经典的模拟（如 CAN）加入。
      1. 添加15微升能量缓冲液，氨基酸溶液等分试样的15微升标记为" - CAA"（ 例如， -精氨酸），90纳米载体DNA溶液10微升和20微升无菌DDH ₂ O中，以粗的30微升提取。通过加入各成分后，上下吹打，轻轻涡旋混合。
      2. 分装90微升无细胞反应中的6微升15相等体积。传送每个15卷到一个单独的反应管中。关闭管，并把它们放回冰上。标签的所有反应管为"CFR（-cAA）"（ 例如，CFR（精氨酸））。
   3. 制备是应该残基特异性纳入NCAA（ 例如，罐）插入表达模型蛋白的无细胞反应（90微升）。
      1. 添加15能量缓冲器的微升，15微升标记为"+ NCAA"的氨基酸溶液等分试样（ 例如，+ CAN），10微升的90纳米的DNA溶液和20μl无菌DDH ₂ O操作粗提取物的30微升。通过加入各成分后，上下吹打，轻轻涡旋混合。
         注:表达效率可相比于与标准氨基酸的表达被降低。如果需要的话，只需扩大无细胞反应体积。
      2. 分装90微升无细胞反应中的6微升15相等体积。传送每个15卷到一个单独的反应管中。关闭管，并把它们放回冰上。为了提高反应体积，因此在分装6微升进一步卷。标签的所有反应管为"CFR（+ NCAA）"（ 例如，CFR（+ CAN））。
5. 孵育所有试管在29°CO / N。
   注:只有小的反应体积让充足的氧气差异延髓成为高效蛋白表达的关键反应。反应体积大于10微升更大需要通过搅拌³⁴活跃充氧。对于大容量，分裂成的反应比15微升小卷。
6. 无细胞表达后，池中所有相同的由6个分微升无细胞的反应。首先，池6微升标记为"CFR（+ CAA）"的全部15分无细胞反应（ 例如，CFR（+精氨酸））。接着，池标记的6微升所有15个分无细胞反应"CFR（-cAA）"（ 例如 ，CFR（精氨酸））。最后，池6微升标明了所有15分无细胞反应"CFR（+ NCAA）"（ 例如，CFR（+ CAN））。为了提高反应体积，因此池6微升进一步卷。
7. 检查模型蛋白的表达水平在所有三个汇集，通过进行变性SDS-PAGE ^43,44（4.1节）不同组成无细胞反应。
   注:使用此方法具 D代表纳入实验的初步评估。
8. 准备无细胞表达蛋白的模型通过HPLC-ESI质谱（4.4节）适当的分析。首先，净化他们^45（4.2节）。最后，交换缓冲液（4.3节），以避免质谱在高背景噪音。
   注:部分3.4.1，3.4.2和3.4.3导致典型的无细胞的反应条件^34:8.9 - 9.9毫克/毫升蛋白（从粗提取物），4.5 - 10.5毫米镁谷氨酸，40 - 160毫米K-谷氨酸，除白氨酸每个氨基酸为1mM，0.83毫亮氨酸，50mM的HEPES，1.5毫摩尔ATP和GTP，0.9毫CTP和UTP，0.2毫克/毫升的tRNA，0.26毫辅酶，0.33毫NAD，0.75毫cAMP的，0.068毫亚叶酸，1mM的亚精胺，30mM的3-PGA，2％PEG-8000和10nM的pbest-OR 2-OR 1-PR-UTR1-gene_of_model_protein-T500。如果需要的话，无细胞反应制备的不同的程序可以进行，导致上述反应条件。

1. 无细胞反应的SDS-PAGE
   注:执行变性SDS-PAGE的蛋白质表达的快速和初步分析没有任何进一步的纯化或提取，并执行下面的步骤。
   1. 在冰上解冻的蛋白质标准。确保它是由具有类似于其在凝胶上的定位（步骤4.1.13）表达模型蛋白分子量的蛋白质。
      注意:在此，使用标准提供的蛋白质在宽范围的分子量（肌球蛋白:212 kDa的，麦芽糖结合蛋白β半乳糖苷酶:158 kDa的，β半乳糖苷酶:116 kDa的，磷酸化酶A:97 kDa的，血清白蛋白66 kDa的，谷氨酸脱氢酶:56 kDa的，麦芽糖结合蛋白:43 kDa的，硫氧还蛋白还原酶:35 kDa的，磷酸丙糖异构酶:27 kDa的胰蛋白酶抑制剂:20 kDa的，LYsozyme:14 kDa的，抑肽酶:7 kDa的，胰岛素答:3 kDa的，B链:2 kDa的）。
   2. 由于无细胞反应是轻微粘性的由于高蛋白质浓度，稀释它们与无菌DDH ₂ O 5 - - 10倍的SDS-PAGE之前，以确保适当的凝胶迁移，并避免染色后饱和。为了不浪费太多样品，稀释1μl的无细胞反应在4微升无菌DDH ₂ O的准备稀释反应管，彻底涡和自旋不久液体下来2迷你离心机 - 3秒2,000×g的。
   3. 添加5微升2×上样缓冲液的5微升稀释的无细胞反应。彻底涡和自旋向下一个迷你离心机2 - 在2000 3秒×g的。
      注意:在此，加入后，将生物分子溶解在62.5毫摩尔Tris / Cl ^-的，10％甘油，2％SDS和0.0025％溴酚蓝在pH 6.8，典型的组合物。使用其它装载染料，导致稍有不同的稀释合作nditions可以是合适的。
   4. 彻底涡蛋白质标准和转移15微升它到反应管中。
      注意:根据凝胶大小和其他蛋白质的标准，推荐的体积可以从上面的不同。
   5. 反应管放入加热块。检查管的盖正确关闭。热，在95 - 100℃，3 - 5分钟。这样做是为了蛋白变性，并使周围的蛋白质骨架SDS-包装。
      注:某些蛋白质标准不能被加热，见供应商的说明。
   6. 同时，转移缓冲液进入凝胶电泳室。 1个运行缓冲液的含量为25毫摩尔Tris，192毫甘氨酸，在pH 8.3（用HCl）0.1％SDS中。
   7. 修复预制4 - 20％梯度Tris-甘氨酸-SDS凝胶（10厘米×10厘米×1毫米）的电泳室。取出梳子和装载有运行缓冲液的注射器冲洗孔中。
      注:凝胶浓度STROngly取决于所表达的模型蛋白质的大小和性质。上述浓度分隔E.大肠杆菌粗提物的蛋白质以及低分子量蛋白质模型。自投凝胶也是合适的。
   8. 从加热器中取出管子。自旋液体下来2迷你离心机 - 3秒2,000×g的。在2000×g的3秒 - 不久旋涡，重复停转2。
   9. 转移15微升的蛋白质标准（24 - 48微克蛋白）和10微升（11 - 22微克蛋白）每个样品入井，并开始电泳。 40毫安大约90分钟，典型的协议 - 这里，SDS-PAGE在125 V和20执行。
   10. 轻轻取出从盒的凝胶。转移入30分钟的固定溶液（50％甲醇，10％乙酸，40％的DDH ₂ O）。 小心！甲醇是通过吸入和皮肤接触有毒。穿在通风橱内防护手套和防护工作。
   11. 转移凝胶成染色溶液（0.025％考马斯亮蓝G-250，10％乙酸，90％的DDH ₂ O）。染色60分钟。
   12. 转移凝胶成脱色溶液（10％乙酸，90％的DDH ₂ O）60 - 120分钟。
       注:固定，染色并强烈脱色取决于所表达的蛋白质的大小和性质。该协议适用范围广，而小分子量⁴⁶蛋白。
   13. 置换凝胶上在白色背景上产生用于染色蛋白带的适当对比度的无光泽的透明度。
2. 从无细胞反应的His-标记⁴⁵模型蛋白的纯化
   注:对于蛋白质纯化，有几种方法能够提供类似的结果。这个协议净化具有C末端多组氨酸标签（His标签）无细胞表达模型的蛋白质。它采用合适的纯化试剂盒，对于那些实验值蛋白ressed在无细胞蛋白质表达的小的反应体积。它是天然的或修改后的模型的蛋白质的纯化相同的。因此，通常一个单一的无细胞反应的基础上描述。
   1. 一个适当的HPLC-ESI质谱分析，提取和从无细胞反应净化模型蛋白质，并执行以下步骤。
      1. 搭配90体积相等的 - 他结合缓冲液150微升90 - 150微升无细胞的反应。吸管上下，接着温和涡旋。
         注:使用他结合缓冲建议。然而，无细胞反应介质可以是起始原料只要模型蛋白是可溶的，pH值是7.5之间 - 8，咪唑/他的浓度为<10毫米，强还原剂的浓度为<15毫和没有含金属螯合剂是本。如果您的混合量超过300微升，将其分割成相同体积和分装载文卷成不同的R反应的影响管为下列纯化步骤。
      2. 制备塔系统。彻底涡他亲和性凝胶的原液直至凝胶树脂完全溶解。转移250μl的凝胶树脂的入列。用1毫升的吸头粘性凝胶树脂。将列到一个收集管。
      3. 离心柱/收集管5 - 15,000×摹 - 13000 10秒。确保凝胶树脂完全耗尽。如果不是这样，通过另外的5延长离心时间 - 10秒，但要注意，该亲和凝胶未过度干燥。因此延长步骤4.2.1.5，4.2.1.7和4.2.1.9离心时间。
         注意:如果它变得僵硬，没有上清液保留在顶部的凝胶树脂已完全耗尽。
      4. 转移150 - 300微升无细胞反应/他的结合缓冲液到柱上。如果混合量超过推荐量，拆分成几个离心柱。通过重悬的FR凝胶树脂equent攻丝过程中至少2分钟的培养时间温和的震荡。对于容量大于200微升更大，孵化额外的1 - 2分钟。
         注:足够的孵育时间为在凝胶树脂的模型蛋白的结合是至关重要的。
      5. 离心柱/收集管5 - 15,000×摹 - 13000 10秒。丢弃流过与柱放回收集管。
      6. 加入250微升他洗缓冲区。重悬通过点击和温和的震荡凝胶树脂。
      7. 离心柱/收集管5 - 15,000×摹 - 13000 10秒。丢弃流过与柱放回收集管。重复步骤4.2.1.6和离心再为5 - 15,000×摹 - 13000 10秒。
      8. 将列到标准的1.5毫升反应管中。加入150微升洗脱缓冲液，并通过点击和温和的震荡悬浮凝胶树脂。减少体积至100μl对更高纯化的模型蛋白CON在下一步骤4.2.1.9洗脱后centrations。
         注:纯化的模型蛋白的总丰度可以降低由于所有凝胶树脂结合的蛋白质可能不完全溶出，如果洗脱缓冲液体积减小。
      9. 离心柱/反应管5 - 13,000 10秒 - 15000 XG稀释纯化蛋白在洗脱缓冲液中。如果说之前拆分，集中所有的解决方案在一个原液。
      10. 在执行缓冲液交换前，使用标准的方法，例如，测定蛋白浓度，Bradford试验^47,48。
          注:对于一个合适的HPLC-ESI质谱（4.4节），用最佳的蛋白浓度，通常是约0.5毫克/毫升的20卷要求 - 50微升。如果该浓度低于0.2毫克/毫升，浓缩用纺丝真空浓缩缓冲液交换后的蛋白质溶液。在这种情况下，首先阅读节4.3.8适当调整交流的buff呃。
3. 对于HPLC-ESI质谱缓冲交换
   注意:Exchange His标签洗脱缓冲液，以避免在质谱分析高背景噪声，由于高浓度咪唑（> 150毫米）和其他盐如NaH ₂ PO _4（> 300毫米）或氯化钠（> 50毫摩尔） ^49。以下缓冲交换协议使用预水解凝胶过滤离心柱系统。它是为相同天然或修饰的蛋白质模式执行。因此，通常一个单一的无细胞反应的基础上描述。请注意，还有其他易于进行缓冲液交换的方法， 例如 ，微型透析盒。
   1. 制备100 ml蛋白质储存缓冲液（50mM三Cl pH值为8，100mM的NaCl和10％甘油）中的。称取成高温高压灭菌100毫升瓶装605.7毫克三基地，584.4毫克NaCl和加入10 mL甘油。填充至约80 ml和通过调节pH值至8dding氢氧化钠。稳步检查pH值用pH计。最后，填充至100毫升标记。
      注意:使用此缓冲器，以稳定的广泛模型蛋白质和不打扰质谱分析，只要型HPLC之前的质谱测量进行。但是，根据所表达的模型蛋白质的性质，可以使用这可能是更好的合适的其它缓冲剂。如果你的目标蛋白不在pH值为8的稳定，相应地调整pH值， 不要使用高浓度甘油。
   2. 预热凝胶过滤离心柱为至少15分钟至室温。
   3. 通过重悬轻轻拍打或涡旋的预水解凝胶和消除气泡。
   4. 首先拆下底盖，然后拿顶帽了。放置柱到清洗管（至少2毫升）中。传输列/洗管进入离心机。每列都有一个方向标志。离心在1000 xg离心2分钟以除去凝胶储存缓冲器。圆盘ARD流通。
      注意:注意按此顺序进行。确保该列中的所有进一步离心步骤相同的方向。
   5. 最多可添加400微升蛋白质存储器缓冲区。离心机在1000×g下2分钟。重复此步骤，蛋白质存储缓冲区完全加载到凝胶。小心添加多达100微升纯化的模型蛋白的溶液。吸管直接在凝胶床的中心。
      注:纯化蛋白的溶液体积，特别是修饰的蛋白质，可能会更高。拆分成几个缓冲区交换柱这样的解决方案。蛋白必须具有分子量大于5 kDa的这类缓冲液交换的更高。
   6. 放置柱到一个集合管和离心机在1000×g下2分钟。
      注:该步骤导致了蛋白质的存储缓冲器中的纯化的模型蛋白质的稀释度。如果说之前拆分，集中所有的解决方案在一个原液。
   7. 闪存冻结日在液氮中，并储存于-80°C或直接发蛋白质溶液通过HPLC-ESI质谱^50（4.4节）。 注意分析一下！佩戴光速蒙面侠和低温手套以氮飞溅的保护。
   8. 执行协议的以下步骤来集中使用的纺丝真空浓缩该仔细蒸发溶剂⁵¹的蛋白质溶液。
      注意:如果蛋白质浓度过低用于HPLC-ESI质谱分析（<0.2毫克/毫升）是必需的，这些步骤。溶液体积和模型蛋白质浓度大致是前和缓冲液交换后的相同。浓缩过程是通过下面的例子来描述:His标签纯化后，模型蛋白质溶于100微升他洗脱缓冲液（步骤4.2.1.9），并具有0.07毫克/毫升（步骤4.2.1.10）的浓度。
      1. 以确保该蛋白质浓度和溶液体积是在蒸发后至少0.2毫克/毫升和20微升，分别稀释，缓冲液交换，在步骤4.3.1制备至少三倍，但至多五倍蛋白质储存缓冲器之前。同样蒸发在以下的至少两个第三（66.67微升）或至多四个第五（80微升）。
         注:蛋白质存储缓冲器的稀释前的缓冲液交换是非常重要的考虑到这个缓冲液（步骤4.3.1）的浓度值，尽管蒸发仍然实现。蛋白质存储器缓冲区稀释后，首先进行缓冲液交换（步骤4.3.2 - 4.3.6）执行以下步骤之前4.3.8.2 - 4.3.8.4。
      2. 缓冲液交换后，将完成100微升模型蛋白质溶液在一个开放的管进入纺纱真空浓缩。
         注:该模型蛋白溶解在稀释的蛋白质储存缓冲器。倾斜它朝向旋转中心，以避免旋转过程中的液体损失。确保相同体积的的开口为空_的 H ₂ O被对称地放置以平衡纺丝系统。
      3. 关闭浓缩器的盖子，并开始转动。为了保证蛋白的稳定性，浓缩在RT或在低温下高达30℃。
         注:采用集中自动加速到170 XG并建立真空。在下面它加速到其的240×g的最大速度。
      4. 经常中断浓缩过程调查的液体体积。停止的浓度，当剩余溶液体积是20微升和33微升之间。
         注:相应地调整步骤4.3.8.1 - 4.3.8.4其他解决方案体积（步骤4.2.1.9）和其他蛋白浓度（步骤4.2.1.10）。闪冻在液氮中，并存储该浓缩的蛋白质溶液在-80℃下，或直接通过HPLC-ESI质谱⁵⁰进行分析。警告！佩戴光速蒙面侠和低温的手套，以免受氮飞溅。
4. 模型蛋白质的HPLC-ESI质谱分析⁵⁰
   1. 为20％的梯度上的C5反相柱15微升的蛋白质溶液（4.3节中制得）（3微米，100×2.1毫米） - - 90％乙腈并用25甲酸0.1％执行的5 HPLC分离分钟和随后的ESI质谱，检出在300的范围内的时间飞行质谱analysator - 3,000 M / Z。
      注意:根据所表达的模型蛋白质的性质，可以使用其他溶剂或列，可能是更适合。
   2. 解卷积使用适当的软件⁵²计算零电荷群众测定质谱。

此协议通过NCAA锦标赛的无细胞特异性残基掺入模型蛋白质指导。它提出了纳入实验，并进一步步骤准备模型蛋白质的适当HPLC-ESI质谱分析的初步评估SDS-PAGE。

这里，精氨酸类似物可以的无细胞特异性残基掺入，以及赖氨酸模拟L - 羟基赖氨酸（HYL）的代表性结果。不同的氨基酸溶液，能量缓冲器，如上所述制备的模型蛋白和无细胞反应的载体DNA编码。参考无细胞反应被提供有由所述20中国农业科学院的氨基酸溶液。对于每一个实验中，阴性对照无细胞反应用缺乏在NCAA的问题的典型的模拟的氨基酸溶液供给。对于每个APPRoach一无细胞反应表达在氨基酸溶液，其中该CAA是由非规范模拟取代的存在下模型蛋白。 His标签纯化，缓冲液交换和HPLC-ESI质谱分析是按照上述的协议执行。

该模型蛋白是C-末端His标签的deGFP ^{32，EGFP 53}的截短形式。其单字母氨基酸序列可以在（补充材料2）中找到。该模型蛋白含有6 Arg和18赖氨酸的位置， 分别表达载体是的pbest-OR 2-OR 1-PR-UTR1-deGFP-T500。

在NCAA的完全结合的情况下，可以假设的阴性对照反应不表达deGFP，由于20 CAAS缺失中的一个。相反，deGFP必须在其它两个反应检测:在refe天然1伦斯无细胞反应，并在被提供与NCAA无细胞反应修饰蛋白。

图1A示出了制罐掺入实验的初步的SDS-PAGE评估。参考无细胞反应具有最高deGFP表达水平。在被设置有可在无细胞反应，deGFP在稍低浓度表示。没有deGFP表达所用的阴性对照来检测。此的SDS-PAGE的结果是对罐的一个成功的掺入靶蛋白deGFP的良好指示。

为了证明制罐的假设完整纳入deGFP，既纯化模型蛋白质，在图1B可见，通过HPLC-ESI质谱进行分析。 图1C示出了纯化的deGFP分子的解卷积质谱。 deGF的解卷积质量即在参考无细胞反应表示P是26,192.8道尔顿。对于deGFP在含有无细胞反应出现26202.5大的质量的制罐表达。对于本地deGFP6Arg和精氨酸修饰deGFP6Can预期由群众在被全面取代是26193 Da和26204大分别。 1.5大的为deGFP6Can的质量差是光谱去卷积的误差范围内。因此，能充分纳入deGFP在所有6精氨酸位置被确认。

减少强度的两个峰值对应于天然deGFP6Arg和改性deGFP6Can未达到其成熟荧光团。荧光团是自催化通过消除一个_水分子的产生，接着氧化。这导致了质量提高了20大，如果这个过程无法继续。

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图 1. 无细胞表达和纯化deGFP分子可以掺入实验和HPLC-ESI质谱的SDS-PAGE评估。（A）中使用SDS-PAGE的能掺入实验的初步评价。从左至右依次为:蛋白质标准，标准无细胞反应，阴性对照和无细胞反应提供可替代精氨酸。 His标签纯化后（B）的SDS-PAGE和缓冲表示deGFP分子交换。从左至右依次为:蛋白质标准，从参考反应提纯deGFP，由含灿反应纯化deGFP。 （C）采用HPLC-ESI质谱灿全部并入的确认。本地deGFP和精氨酸修饰deGFP的预期由群众完全可以取代是26193 Da和26204大分别。每个光谱被归一化到其最高强度（计数）。峰值位置指示在大。为可视化的目的，将凝胶泳道被从凝胶图片提取的，连接在一起，被转换成灰度格式，大小被优化和对比度以及亮度增强。原厂胶道在补充材料3介绍请点击此处查看该图的放大版本。

图2A示出了HYL掺入实验的初步的SDS-PAGE评估。在于设置有HYL无细胞反应，deGFP表示。相反于第一实验中，将弱deGFP带所用的阴性对照反应中观察到。这可能是由于在无细胞反应赖氨酸残基。这使得在阴性对照反应，其中加入既不赖氨酸也不HYL微弱deGFP表达。

用于h PLC-ESI质谱，设置有HYL无细胞反应的deGFP分子是纯化的和交换缓冲液（ 图2B）。

图2. SDS-PAGE中掺入HYL实验的评价 （A）从左至右依次为:阴性对照无细胞反应，含HYL和蛋白质的标准无细胞的反应。 His标签纯化后（B）的SDS-PAGE和缓冲表示deGFP分子交换。从左至右依次为:含反应和蛋白质纯化标准从deGFP的HYL。为可视化的目的，将凝胶泳道被从凝胶图片提取的，连接在一起，被转换成灰度格式，大小被优化和对比度以及亮度增强。原厂胶道在补充材料3中。F ="htt​​ps://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图3示出纯化deGFP分子的解卷积质谱。 图3A证实在无细胞的反应已经存在赖氨酸残基的假说。频谱的主要峰对应于天然deGFP（预期质量:26193道尔顿）。再次，一个20达较高的质量未开发其荧光团deGFP分子可以被检测出来。的赖氨酸残基被优先加载到tRNA的^赖氨酸由赖氨酰tRNA合成酶，导致天然deGFP18Lys的高表达水平。

HYL和Lys之间的质量差是16达。由于HYL的存在是在竞争的赖氨酸残基被生成的所有可能的deGFP物种（deGFP18Hyl，deGFP17Hly + 1Lys，...，deGFP16Hyl + 2Lys）（ 图3B）。诚然，deGFP1Hyl + 17Lys的峰值与没有产生其荧光（ 图3A）和一些峰的质谱与预期质量相差超过2达天然deGFP的峰值重叠。这些质量的差异可以归因于高噪音由于低量的deGFP物种。然而，HYL一般是由无细胞系统并入。进一步改进必须完成取消在无细胞反应赖氨酸残基。

图 3. HPLC-ESI质谱含有HYL无细胞反应的纯化deGFP分子光谱 （A）中本机deGFP18Lys主要是检测到（预期群众:用荧光团26193道尔顿，而不成熟荧光团26213道尔顿）。 （B）放大倍数显示所有可能deGFP种（deGFP18Hyl，deGFP17Hly + 1Lys，deGFP16Hyl + 2Lys，...，deGFP1Hyl + 17Lys）的存在。其预期群众26193大+ N×16大（N = 1，...，18）。频谱归一化到其最高强度（计数）。峰的位置以达表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料1.计算模板。在部分2中，能量缓冲器主混合物的制备是用最佳MG-30微升和粗提物的等分试样，并分别为3毫米的K-谷氨酸浓度和30mM的举例说明。这个例子导致了产生3个能量缓冲等分预混量。在秒化3，无细胞反应的制备采用90纳米DNA原液导致无细胞反应的10纳米的最佳载体DNA浓度例证。 请点击此处下载此文件。

粗提取物体积:28微升，最佳的Mg谷氨酸:2毫米，最佳的K-谷氨酸:40毫米，编号为适当的可追溯性，使用计算模板是由从上面的例子不同，这些典型值的插入例举的所需的缓冲区等份:100，在无细胞反应最佳矢量浓度:8纳米，DNA载体原液:150纳米。

首先进入28微升的粗提取物量进入第一次模板部分的橙色领域。然后，进入到第二模板部2mm的D 40毫米为最佳MG-和K-谷氨酸浓度为橙色领域。考虑到最佳MG-和K-浓度，15微升能量缓冲液的组成，以及一个相应的，按比例增加16微升等分试样被计算。下面，相应输入100作为能量缓冲器等分的期望数目（16微升）。模板适应为1,700微升主结构不同的缓冲部件的体积为:204微升100毫米镁谷氨酸原液，136微升3M的K-谷氨酸原液，728.73微升14倍的能源解决方案，510微升的40％PEG-8000和121.27微升无菌DDH ₂ O最后，在第三模板部分，输入8 50nm和150nm作为无细胞反应最佳矢量浓度分别载体DNA原液浓度。模板适应必须被添加到28微升粗提取物的不同组分的量以完成一个90微升的制备无细胞反应如下:15微升能量缓冲液，15微升3不同组成的氨基酸溶液之一，4.80微升的载体DNA溶液（150纳米），和27.20微升无菌DDH ₂ O的

补充材料2.一个字母的模型蛋白deGFP的氨基酸序列。这个模型蛋白含有6精氨酸和赖氨酸18立场。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料3，全长度和对应于该凝胶图片未修改凝胶泳道呈现图1和2中的凝胶泳道中的每个的各个S呈现 ubfigure由相同的SDS聚丙烯酰胺凝胶中提取。在图1和2 中这些泳道进行演示接合在一起。蛋白质标准带的分子量的数字旁边指出。 （A.1） 图1A的未裁剪胶道。从左至右依次为:蛋白质标准，标准无细胞反应，阴性对照和无细胞反应提供可替代精氨酸。 （A.2） 图1B的未裁剪胶道。从左至右依次为:蛋白质标准，从参考反应提纯deGFP，由含灿反应纯化deGFP。 （B.1） 图2A的未裁剪胶道。从左至右依次为:阴性对照无细胞反应，含HYL和蛋白质的标准无细胞的反应。 （B.2） 图2B的未裁剪胶道。从左至右依次为:含反应和蛋白质纯化标准从deGFP的HYL。D / 54273 / 54273supfig3large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

安易于使用的无细胞表达系统作为一个可行的策略，去渣特异性结合NCAA锦标赛成蛋白质，提出。为此，将粗提取物补充有载体DNA编码所关注的相应氨基酸的蛋白质，能量缓冲器和。需要注意的是粗提取物等分试样体积取决于粗提取物的蛋白质浓度^34。无细胞表达效率取决于载体DNA构建浓度优化。能量缓冲器组件的体积为优化MG-和K-谷氨酸浓度的函数，以使所述无细胞表达模型蛋白的高产率而有所不同。

掺入实验的初步评估可以通过执行未纯化无细胞反应介质的SDS-PAGE来获得。有关更详尽的分析，HPLC-ESI质谱分析，提出为手段，以检查是否有完整的，具体的残留INCOR在NCAA的穿孔。至于后者的制备，旋转柱系统用于使His标签纯化和缓冲与我们在这个协议中使用小体积交换。

包括HPLC-ESI质谱，整个协议可在2天内进行。它不包括任何特别关键的步骤。然而，MG-和K-谷氨酸浓度的优化以及载体的DNA是为了表达的模型蛋白的高产率是至关重要的。使用高效表达载体的个体极值-OR 2-OR 1-PR-UTR1-gene_of_model_protein-T500强烈推荐。 His-标记的蛋白的洗脱通常是由于高浓度的咪唑（> 150毫米）和其他盐如NaH ₂ PO _4（> 300毫米）或氯化钠（> 50毫米）产生在质谱分析⁴⁹高背景噪声。用合适的蛋白存储缓冲器这样的洗脱缓冲液的交换稳定模型prote在和大幅降低质谱分析中的背景噪声。

其结果是，可在模型蛋白质内的所有六个位置替换精氨酸。在表达系统中，没有精氨酸残基可以被检测出来。这简化相比，需要进一步消耗策略^29,30其他表达系统精氨酸类似物的特定残基掺入。所提出的无细胞的方法规避那些因灿毒性在体内的方法存在固有局限性，或在单一蛋白生产策略^24,31 mRNA序列的强烈依赖。相反， 在体外系统中采用，体内灿裂解丝氨酸和羟基胍确实发生^31。

但是，无细胞系统保留足够量的Lys与类似物如HYL竞争。液相色谱 - ESI质谱分析表明，该模型蛋白含有两者，的Canonical以及不同比例的非规范类似物。赖氨酸的特定残基掺入是在一般可能的，但对于完全取代，进一步消耗策略，或特别设计的aaRS和tRNA的识别NCAA锦标赛的优化需要开发。

我们在相同的浓度为规范那些加入NCAA获得的无细胞表达，修饰的模型蛋白的优良的产率。掺入效率取决于NCAA的性质被并入。甚至更高的收益率可能仍然是通过优化NCAA的浓度实现的。

只要它们是由典型的内源性翻译系统接受所呈现的结果证明了NCAA锦标赛的特定残基掺入所采用的系统的适用性。对于特定NCAA锦标赛的特定残基掺入，一个另外的需求，以检查是否类似CAA distur的残B中的表达系统。

无细胞转录-翻译系统可以从不同的生物体进行工程化，以不同的需求⁵⁴作出响应。所有E.在这里提出的无细胞系统的大肠杆菌转录-翻译机器使噬菌体和大肠杆菌的使用大肠杆菌的启动子，它们可以并行地或连续地在级联⁵⁵采取行动。的普遍适用性和可用性使该方法在氨基酸毒性和治疗应用的进一步研究的有力工具。

The authors have nothing to disclose.

E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.