仿生的微流体模型肺呼吸腺泡航空公司

Soft-lithography was utilized to produce a representative true-scale model of pulmonary alveolated airways that expand and contract periodically, mimicking physiological breathing motion. This platform recreates respiratory acinar flows on a chip, and is anticipated to facilitate experimental investigation of inhaled aerosol dynamics and deposition in the pulmonary acinus.

在肺腺泡深度量化呼吸流动特性，以及它们如何影响吸入烟雾传输是针对优化药物吸入技术以及预测肺泡潜在有毒大气颗粒的沉积图案的关键。在这里，软光刻技术用于在在光学系统访问重现生理腺泡流动现象的真实解剖长尺度制造复杂腺泡样气道结构。微流体器件具有5代与周期性扩张和收缩的墙壁分岔蜂窝状的管道。壁的致动是通过改变内部周围都从侧面和该装置的顶部的薄的PDMS腺泡通道壁充满水的腔室中的压力来实现的。在对比普通多层微流体装置，其中需要的几个的PDMS模具堆叠，提出以制造顶部的简单方法通过嵌入注射器的筒段成PDMS模具腔。这种新颖的微流控的设置提供了生理呼吸运动而这又引起特点腺泡空气流动。在目前的研究中，微粒子图像测速（μPIV）与液体悬浮颗粒来定量这种空气流根据流体力学相似性匹配。 μPIV结果和预期腺泡流现象之间的良好的一致性表明微流体平台可能在不久的将来作为体外工具一个有吸引力的，调查在肺部的腺泡区域直接空降代表粒子输运和沉积。

在末节呼吸流量动态的细致的量化，肺部蜂窝状的区域是朝着在肺腺泡理解气流混合，并预测在最深的气道吸入^1-3气溶胶的命运至关重要。在寻 ​​求改进和靶向给药吸入治疗剂的局部肺站点^4,5以及用于全身递送新策略一方面寻址吸入颗粒污染物的危害或相反时，这后一方面是特别关注的。

迄今为止，在深肺腺泡区域呼吸流量已经典型地使用计算流体动力学（CFD），或者与按比例增加的实验模型中体外以下液力相似性匹配调查在硅片 。在过去的几十年中，CFD方法已经被越来越多地应用于研究腺泡流动现象，从SINGLË肺泡模型^6,7和蜂窝状的管道^8-12更详细的在硅片模型捕捉解剖学逼真腺泡树形结构与蜂窝状的管道多代，最多几百个人肺泡^13-15。

总之，数字的努力已经在上随后腺泡气流模式的呼吸运动过程中的作用和室壁运动的影响力脱落光的关键。在没有呼吸运动，静态肺泡功能循环的腔表现出腺泡管和肺泡^6,7之间的空气对流不交流中流动;换句话说，肺泡流将被完全从流动腺泡树木内分离空气的交换将来自扩散机制唯一结果。与肺泡域的环状扩张的存在，然而，肺泡流拓扑大幅度修改和地区环境部门一道内部肺泡lting流动模式紧密并列沿着腺泡树的肺泡的位置（ 例如 ，近端与远端世代）。

特别是，已经假设在肺泡流动模式强烈肺泡的比率的影响的模拟到乳腺导管的流速，使得肺腺泡树中，其中，该比值是比较大的以下跨越树结构，特征质量守恒近端世代复杂的循环不可逆的流体迹线肺泡腔内流动。随着每更深腺泡产生，肺泡到导管流量的比例逐渐降低，使得远端腺泡几代表现出更多的径向流线一样是让人联想到通货膨胀简单和气球通缩的。随着现代影像学检查，肺部影像学资料^16，啮齿类动物，包括大鼠和小鼠的^17，进步已经引起了一些第一CFD SIMUL的在重建肺泡解剖，重建腺泡流动ations。尽管有这样的希望的进展，这些最近的研究仍局限于终端肺泡囊只有^18，19或周围的单一管道²⁰几个肺泡解决气流的现象。其结果是，在腺泡呼吸流动现象的国家的最先进的调查仍然受到研究侧重于腺泡环境²的通用解剖风格的几何形状为主。

在实验方面，不同的设置，设有带一个或几个肺泡气道已经发展了很多年^21-24。然而，存在分叉蜂窝状航空公司是能够通过在呼吸样的方式扩张和收缩模仿生理呼吸没有实验模型。由于缺乏手头有吸引力的实验平台，腺泡运输现象的研究仍然是有限的问候valida婷计算的研究和批判，仍然实验数据可用的缺乏。 近年来 ，Ma 等人 （2009）构建了由三个腺泡世代的腺泡的按比例增大的刚性壁模型;然而，在这个模型中缺乏壁运动的限制了其能力来捕获呼吸的条件下实际的肺泡流动模式。

其他规模扩大的实验，包括基于从投副本解剖数据移动壁模型，最近推出的^25;然而，由于该模型仅捕获的最后两个腺泡世代（ 即 ，终端囊），它未能捕获表征更近侧腺泡世代复杂再循环流动。的规模扩大的实验后面的这些例子进一步强调这种做法的持续限制。具体而言，没有现成的试验迄今已证实从循环的假设过渡到沿径向流腺泡从而确认假设流拓扑结构的数值预测在现实肺腺泡树木^7，15最关键的存在。也许，规模扩大的实验调查可吸入颗粒搬运和沉积动力学²⁶极其有限的，由于匹配所有相关的非困难维参数（ 例如 ，粒子扩散，临界传输机制亚微米颗粒，是完全可以忽略不计）。

与正在进行的实验挑战，允许在复杂移动壁的呼吸气流和粒子动力学研究新的实验平台腺泡网络追捧。在这里， 体外模型腺泡解剖学风格的介绍。该微流体平台模拟肺腺泡直接代表腺泡规模流动，拓宽和范围日益扩大肺微流体模型^27，包括支气管液塞-FLOWS ^28-30和肺泡-毛细血管屏障^31。

即，本设计采用了简化的五代蜂窝状气道树周期性膨胀和收缩壁，其中，环状运动是通过控制压力围绕薄的PDMS侧壁并且其中所述顶壁是由一个额外的水而变形的水室内部实现的室直接坐在腺泡结构之上。不像普通的多层微流体装置，该室被简单地通过嵌入的PDMS装置内的注射器的筒部形成的，并且不需要制备额外的PDMS模具。

这里介绍的小型化方法提供了一种用于再现复杂腺泡结构与相比，规模扩大的模式，同时捕捉腺泡流环境的基本特征移动壁的简单和灵活的手段。此平台可用于FLOW¯¯可视化使用航空（见下文代表性的成果）内的流体悬浮颗粒。在不久的将来，该模型将与空气中的颗粒可用于研究吸入腺泡粒子动力学。

1.主制造

1. 使用绝缘体（SOI）晶片上的硅的深反应离子蚀刻（DRIE），为在原作品^32，33中所述来制造一个主硅晶片。
   注:DRIE优选标准的SU-8的微加工，由于高宽比特征（40微米，宽90微米的深沟槽）。

2.铸造和微流体装置的密封

1. 在一个10混合的PDMS和固化剂:内部的清洁的小容器1的重量比如塑料称量皿。
2. 脱气混合物在真空下干燥器直至所有气泡被除去。
   注:所有的后续步骤准备足够的PDMS。这里的下方，首字母缩写"PDMS"总是指脱气的10:1 PDMS:这是在步骤2.1和2.2编写的固化剂的混合物。
3. 的脱气混合物倾到的主晶片上方约1mm的高度。脱气再次用于至少40分钟以除去所有的气泡的晶片上方，并尽量减少在晶片下方的气泡。
   注:确保晶片是尽可能靠近到板的底部。如果有必要按晶圆轻轻用搅拌2棍棒和德加再次底部。
4. 烘烤在65℃下在自然对流烘箱20分钟。
   注:20分钟后，将PDMS硬化和几乎完全固化。而较长焙烧时间是可能的烘烤20分钟节省了时间，提高了第二PDMS层的粘附（参见下文），以第一个。
5. 文件用细砂纸以改善粘附至PDMS的塑料2毫升注射器的筒部。此外，使用砂纸通过放置在平坦表面上的沙纸和滑动在它上面的注射器筒的基部弄平注射筒的底部。清洁使用压缩空气注射器。
6. 放置在注射器的筒段与所述拉第一PDMS层的顶部RGE开口朝向PDMS的表面上，并倾的PDMS上的第一个的顶部上的第二层到约5毫米的高度，并在干燥器中再次脱气的PDMS。
   注:第二PDMS层应该从筒体周围小容器倾倒，并且不应当在它进入。
7. 烤整个设置在65℃下，在自然对流炉中在至少2小时。
   注意:没有必要在固化过程以保持桶中发生的，因为PDMS按压筒的广基的重量中牢固地保持桶。
8. 通过使用手术刀主晶片的图案化区域周围的PDMS模具切割。切割时，手术刀应弱触摸晶片的表面上。然后，轻轻插入薄的工具，如用手术刀产生的缺口晶圆镊子，并剥离从主晶片投的PDMS。
9. 放置上铸造用铝箔覆盖与图案化侧的软表面朝上（ 即 ，桶应该从表中的边缘挂起），并使用1毫米活检穿孔在腔室入口和通道入口冲床在PDMS中的孔。
10. 外套干净的载玻片上用（脱气）10:1的PDMS:使用以3000rpm进行30秒编程的旋涂机的固化剂混合物中，并在65℃下烘烤> 1小时。然后，清洁幻灯片和PDMS使用透明胶带蒙上。
11. 用O ₂等离子体处理的PDMS模具和PDMS涂覆载玻片的表面上（ 例如，使用手持式电晕）中1分钟，然后轻轻地表面压在一起并且在65℃过夜（O / N）烘。

3.设备灌装和开动

1. 混合与水和甘油水中的悬浮的荧光聚苯乙烯粒子在玻璃小瓶以获得具有0.25％64/36（体积/体积）甘油/水混合物（重量/重量）的颗粒..
2. 放置在通道入口上方的甘油溶液一滴和DI笏一滴器上的腔室入口，然后将干燥器和真空〜5分钟内的装置。
   注:释放真空等待在甘油溶液和去离子水的液滴，以弹出形成气泡之前。在真空释放的液体被吸入装置内部的空隙。如果残留空气保持在通道内，通过施加外部压力的流体（ 例如 ，使用注射器）和使空气扩散到PDMS消除它。
3. 注入约2ml DI水进入前腔室（ 即，针筒筒体， 图2b），直到其完全充满水。再涂用19号钝注射器尖端顶室，切另一个钝19号注射器尖端的前端与插入此尖端到侧室入口。两个注射器提示连接到经由薄聚四氟乙烯管和一T形连接器的1ml注射器。
   注意:确保1 ml注射器，聚四氟乙烯管，T形连接器和顶部室（2毫升注射器巴尔EL）都装满水，无气泡。这可以通过打开的连接点，通过管道的空部分推动水和重新连接的连接点来实现。
4. 的1ml注射器连接到注射器泵预编程在1秒以模仿例如一个安静的潮气呼吸周期（与周期T = 4秒）线性斜坡， 即构成，从零至1.8毫升/分钟，从1.8毫升/分钟至-1.8毫升/分钟在2秒和从-1.8毫升/分钟回零在1秒。

4.流量可视化实验:微型粒子图像测速（μPIV）

1. 当设备被致动，获得一系列9 - 12锁相，双帧使用微粒子图像测速（μPIV）系统，包括例如一个双帧多重曝光的CCD的颗粒种子流的图像相机（ 例如 ，1600×1200个像素以获得足够的分辨率），一个双脉冲Nd-YAG激光器（波长:532纳米，输出能量:400毫焦，脉冲持续时间:4纳秒），并在倒置显微镜。
   注:这种系统是能够获得具有时间滞后帧对的向下到第一和第二帧之间的几微秒。实现锁相双帧图像，这是获得在例如一个双帧系列有用的。，10赫兹（帧对由0.1秒从彼此分开）。然后，数据可以被重新安排，是由一个全周期的时间（这里T = 4秒）分隔的所有帧对形成一个新的时间序列。图像采集应而修改每个帧中对第一和第二帧之间的延迟时间被重复若干次（ 即 ，100微秒到0.1秒）肺泡腔内解决不同的流动区域。
   注:关于图像采集系统的最佳组合替代设置（ 即摄像机）和照明光源（ 如激光）图像等微流也可用^34，35。
2. 使用求和的相关一个算法计算得到的流场的锁相速度矢量地图从图像系列为每个使用的时间滞后。重复此过程数次，在每一帧中一对肺泡腔内解决不同的流动区域的第一和第二帧之间的变化的滞后时间。接下来，使用一个数据分析程序通过平均重叠的数据点³³缝合的各个流程映射到的流动模式的完整和高详细地图在一起。

在体外腺泡平台的计算机辅助设计（CAD）和显微镜图像示于图。 1，仿生腺泡模式的特点分支肺泡状圆柱形腔内衬长方形通道（ 图1）的五代。在这里，几代机型的编号，从1代（大部分近端代）代5（为最远端代）。请注意，只有通道入口通向代1是通过在PDMS中的开口的装置开放到外部环境。 16管道从第5代客场领先留给封闭的空气（ 图1a）。通过周期性地调节所述腔室中的水的压力，构成肺泡腔和管道薄壁周期性变形。同时，气道的天花板由位于导管之上的额外的水室的装置垂直变形;建立在此之上室简单的方式没有准备额外的微流体层的注射器的针筒被淹没在里面PDMS交联之前。这导致约1mm分离蜂窝状导管和顶部水室的PDMS层（参照图2）。

该水腔被连接到编程以重复一系列直线倾斜的流速以模仿的法线的平均人类成人的重潮式呼吸方案用4秒的循环时间（T）的注射泵。这将导致一个周期性下降与气道体积的增加;因为出口被密封，仅在入口是开放的环境中，管道内的流体被吸入并通过入口从设备呼出，类似于一个自然呼吸过程。这里，气道导管充满了用荧光颗粒（见协议）和微粒子图像测速（μPIV）接种甘油溶液用于映射resulti整个气道树³³纳克流场。

归一化的速度大小（U _X /ù _{的x，max）存储}在流向（ 即 ，轴向）穿过通道的宽度方向示于图。 3。结果在每个5器件世代的峰吸入速度呈现，并且邻近所述管道中平面的薄板坯内代表的流动的二维投影。为了比较，稳态层流为无限长的通道³⁶的解析解也出现在图3。

图4示出在气道中的峰吸入中平面精简肺泡腔内模式和速度幅度。 图4a，b和c描绘腺泡世代分别为1，3和5。

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图1: 腺泡树网络的微流控模型 （一）全部设备的CAD图纸。 （二）腺泡树结构的特写快照显示的渠道，商会，以及薄壁隔开。紫色箭头表示图中呈现的流程配置文件的相应位置，并正Y -directions。 3，适应与裁判的许可。 33。

图 2: 微流器件的CAD设计 （一个）虚线表示从横向和顶部腔室经由T形连接器将注射器泵主导管。通过示出了PDMS铸内针筒的位置的设备的中央切（B）侧。一个dapted与REF许可。 33。

图3: 腺泡流速从PIV沿世代1信道的宽度到5在图中所示的位置中提取归一导管速度分布（U _X /ù _{的x，最大值} ）。 1，Y = 0恰逢整个通道的中点位置和u _X，最大 =0.0104米/秒相当于这里的设备代1 PIV测试测得的峰值流向速度都在这里显示在高峰吸入（T = 0.6秒）而黑色线对应的分析速度曲线用W _D = 345微米，匍匐矩形通道内流动 H = 92微米。改编与裁判的许可。 33。

图4: 速度的大小和相应的简化模式 。数据从微PIV在位于装置世代的肺泡的平面提取的流的突起1，3和5流场示在约峰吸入（T = 0.6秒）获得。速度大小显示在对数尺度。改编与裁判的许可。 33。

这里介绍的微流体平台腺泡的一个重要特点是它重现生理逼真的呼吸运动是引起生理流动分布和速度腺泡内管和肺泡内的能力。因为微流体通道具有相对低的长宽比产生（ 即 ， 宽 _深 / 小时 ≈3.9，其中_，w，d是所述管道的宽度，h是所述管道高度），所测量的流量显示更多柱塞样流动特性相比预期的抛物线流量分布，将存在于循环通道。尽管如此，所测量的速度是公生理范围内;它被发现的特征量纲雷诺数，比较惯性粘滞力，产生一个最大的约0.01对应于中到远端腺泡区域，下面的半经验估算^2。

附近（ 图4）肺泡腔内的流动分布显示，乳腺导管速度是逐步走向更深腺泡代递减。此外，流动量值沿肺泡导致流速是相对于导管大小较慢内肺泡两到三个数量级的开口急剧下降;这种流拓扑在若干数值研究^1,9，15以前报道此外，流动型态显著改变从一个腺泡代到另一个，如在模拟⁷预测^，15:而生成1设有其大致与一致的再循环区肺泡的中心（图4左），第3代的特征在于它是朝向的近侧移位的再循环区肺泡与更开放的流线模式（图4，中间）。最后，没有回流区径向流线在装置世代5（图4，右侧）观察到。以最好的作者的知识，这是第一次广泛的肺泡流动模式的存在是实验抓获。

该方法的成功依赖于微细加工协议的几个关键步骤。首先，为了防止从主晶片在释放撕裂晶片的表面应具有直壁的刻蚀图形的薄的PDMS壁并且不能坚持固化的PDMS。因此，强烈建议以产生使用SOI晶片的DRIE如Fishler 等人描述的晶片。 （2013年）。这样的主晶片是耐用，可以通过很容易地涂有防粘层如Fishler 等人所述硅烷化的表面上。（2013）或通过确保吨帽在DRIE过程的最后一步是用CF ₄钝化。另一个关键步骤是提交（步骤2.5）和嵌入（步骤2.6）注射器筒打造顶级室。气泡注射器基座和第一PDMS层可大大降低制造装置的完整性和耐久性之间。为了防止气泡的形成，这是至关重要的注射器筒的底部是平的，均匀地提起。

虽然目前的设计允许只使用一个主晶片的两层器件的制造中，修饰方法可以包括创建包含一个圆形凹槽，以形成顶室的附加的PDMS层。对于第二个PDMS层的附加主芯片设有圆形脊可以使用标准的SU-8光刻制造。该协议的额外修饰可以包括用于PDMS键合不同的方法，该方法不要求一个电晕。附着的PDMS模具到玻璃滑动，第一涂层如在协议的步骤2.10中描述，但使用5载玻片:1，而不是10:1的PDMS:固化剂的重量比。烘烤涂覆的玻璃15分钟在65℃下在一个自然的对流烘箱，按PDMS模具涂覆玻璃的PDMS，并且在自然对流烘箱中在65℃烘烤过夜。

液体泄漏的从PDMS模具和玻璃可以采取下列措施之间的接合面的场合:（1）确保电晕是在处理过程中产生电火花，如果没有，提高输出电压，（2）延长与电晕和（3）使用的PDMS模具接合到玻璃替代方法，处理时间（见上文第）。通常水可以通过薄聚四氟乙烯管向腔室入口的连接泄漏。为了规避这样的泄漏，确保19号钝尖的注射器是用来聚四氟乙烯管连接到进气口。如果PDMS模具和日之间的水泄漏È顶部室（2毫升注射器筒）确保注射器筒体的基部被正确地提交（参见步骤2.5中协议），并且PDMS的第二层倾足够高（约5毫米第一PDMS层上方）。

需要注意的是壁变形的程度高度依赖于PDMS的机械性能。器件的制备过程中的微小变化可能导致不同的设备之间的所测量速度的相当大的可变性。为了确保最大的可重复性使用恒定的制备条件（湿度，烘烤时间等 ）。此外，设备致动期间的体积变化的微调可以通过使用相差显微镜可视化通道的顶表面和调节注射泵的速度斜坡使得信道的顶表面被偏转到所需的距离来实现如由显微镜载物台的Z运动测量。

一个重要的limita当前技术的灰是肺的精确形态特征（ 例如，解剖学，形态学）不能被精确地再现。的确，腺泡模型的平面设计不捕获例如外的平面腺泡分岔和肺泡到导管容积的比大于在体内测量值³⁷低得多。此外，简化的微流体几何仅捕获完整腺泡的一小部分。尽管有这些限制，本模型能够直接在真解剖长度尺度以再现预期的流动模式和速度，并因此表示为腺泡传输现象一个有价值的测试平台。

最后，肺腺泡的功能微流体模型显示巨大潜力，作为呼吸腺泡定量调查流动模仿的呼吸方式体外工具。在这里，简单腺泡模型包括5克膨胀和收缩蜂窝状管道，从而再现一些预期的重要的基本流的属性的enerations到肺部的腺泡区域之内。流动可视化，采用微PIV，肺泡内的腔体为复杂的循环，并沿腺泡树辐射状肺泡流量范围的第一次实验证据。此微流控方法允许下一个相对简单的程序与移动壁复杂腺泡结构的制造，并提供一个有吸引力的替代按比例增加腺泡车型。特别是，在一对一的比例递送模型的主要优点，真正吸入腺泡粒子动力学可以不进行动态相似性匹配进一步需要调查。

The authors have nothing to disclose.

This work was supported in part by the European Commission (FP7 Program) through a Career Integration Grant (PCIG09-GA-2011-293604), the Israel Science Foundation (Grant nr. 990/12) and the Technion Center of Excellence in Environmental Health and Exposure Science (TCEEH). Microfabrication of microfluidic chips was conducted at the Micro-Nano Fabrication Unit (MNFU) of the Technion and supported by a seed grant from the Russel Berrie Institute of Nanotechnology (RBNI) at Technion. The authors thank Avshalom Shai for assistance during deep reactive ion etching (DRIE) and Molly Mulligan and Philipp Hofemeier for helpful discussions.