Method Article
在这里,我们展示了我们的协议,用于隔离的基础和粘膜下腺体导管细胞从小鼠气管。我们还表明,该方法的干细胞注射到背鼠标脂肪垫,以创建一个模式,粘膜下腺体的再生。
大航空公司直接与环境接触,因此容易受到伤害的毒素和传染性我们呼吸的1。大航空公司,因此需要一个有效的修复机制来保护我们的身体。这种修复过程发生在呼吸道的干细胞,这些干细胞气道隔离理解的修复和再生的机制是非常重要的。同样重要的是理解异常修复,可导致气道疾病的2。该方法的目标是从小鼠气管粘膜下腺导管分离出一种新的干细胞群体,将这些细胞在体外和体内模型系统,以确定的修复和再生机制的粘膜下腺体3。生产表明,可用于分离和检测从大的气道3中的管道和基底的干细胞的方法,这将允许我们研究疾病,如囊性纤维化,哮喘和慢性阻塞性肺疾病的气道。目前,有没有隔离的粘膜下腺体导管细胞的方法,也没有在体内模型研究粘膜下腺体的再生。
纲要的步骤
1。解剖气管
2。清洁气管和切割
3。酶消化,加工成单细胞悬液
4。染色流式细胞仪和分选
5。排序细胞在体内和体外模型处理
1。解剖气管
2。清洁气管和切割
3。酶消化和加工成单细胞悬液(SCS)
4。染色流式细胞仪和排序
5。加工分选细胞, 在体外培养和体内模型
5.1 在体外球体形成5-9文化
5.2 体内模型
6。代表性的成果
S饰鼠标气管的pping将导致在剥蚀气管内,如在图1A中所示,是通过光学显微镜可见, 图1B示出后的气管上皮剥离从组织和类似葡萄串被释放的粘膜下腺体的明视野图。
链霉蛋白酶删除的ITGA6的抗原表位,这是为什么的的TROP2管细胞可以不被分成ITGA6 +和 - 人口。然而,分散酶,其中保存着ITGA6表位,消化所有的表面上皮细胞即使有很短的孵育时间和管道,并因此不能被用于分离管从基底细胞3。流式细胞术的单细胞悬浮液应显示正散射和侧散点图,在图2A中表示的。的,如果气管细胞TROP2抗体可以看出,在流式细胞仪荧光激活细胞sorti的导管细胞的其余部分良好的分离纳克(FACS),如在图2B中看到。球体应该是可见的,在的基底膜在培养约1周后,在外观上是致密的,如在图3中示出。这个过程的顺序是1-2%,单细胞的效率将仍然存在于基底膜,可能代表细胞的粘膜下腺导管不具备自我更新的能力。导管干细胞注射到小鼠脂肪垫的查询结果粘膜下腺状结构, 如图4所示形成。这些块中,即使没有H&E染色。这些是球形和具有中央管腔。为了不要错过这些上皮的结构,需要做许多的横截面,通过脂肪垫。
图1。气道上皮细胞的酶消化。去除表面上皮细胞示出与黑单肩休闲包K表箭头,切除粘膜下腺导管细胞显示绿色箭头。示出30分钟的分散酶消化后,链霉蛋白酶消化4小时后,用光学显微镜可见的剥蚀气管。
图2(A)。流式细胞仪代表前向散射和侧向散射光图从小鼠气管表面上皮剥离后的单细胞悬液。 (二)代表FACS图TROP2从小鼠气管导管细胞表达的。
图2B。流式细胞仪的单细胞悬液从精简的表面上皮的低三分之二的小鼠气管代表前向散射和侧向散射光图。 (二)典型的FACS情节ITGA6表达的苏rface上皮细胞。 III。另一位代表的的FACS情节的正向和侧向散射光从表面上皮门的绿色基底细胞人口。 (四)典型ITGA6 TROP2表达细胞亚群的绿色。
图3。发展领域的时间过程。 A.管道领域。球在基底膜约1周后的文化应该是可见的,几乎全是密集的外观。单细胞不形成球体也看到了。 (比例尺= 50微米)。 B.基底球是在外观上和管腔。单细胞不形成球体也看到了。 (比例尺= 50微米)。
图4。导管干细胞注射到小鼠脂肪垫的查询结果粘膜下腺状结构的形成中。代表结构显示中的脂肪垫和一些人产生粘蛋白(淡蓝色),阿尔辛蓝碘酸雪夫染色。
这种技术来隔离气道管和基底细胞重要的是,提高我们对气道的修复和再生,气道疾病。这里描述的技术包括几个关键的步骤。第一是优化酶消化期间。第二个是创造的单细胞悬液通过串行逐步提高计针,以防止传代细胞剪切,但分手的细胞团块。第三个是FACS分析,并适当的抗体的细胞的门控。
由于一些酶带钢表面抗原表位,像ITGA6和NGFR,一个可能的修改是改变内切酶酶切协议,以腾出的抗原表位。通过改变类型的细胞上的表面标记的特异性抗体,此协议也可以被用来隔离气管的内皮细胞或其他间充质细胞。
管道和基底细胞的分离的局限性我们目前缺乏的表面标记来区分胆管细胞从基底细胞和表面上皮剥离和后面留下一些基底细胞的可能性需要有关。未来专门为胆管细胞的表面标志识别将使这个过程变得更容易,并避免表面上皮剥离的需要。它也将否定纯基底细胞制剂需要使用的气管的下三分之二。
没有利益冲突的声明。
我们要感谢宽广的干细胞研究中心FACS,尤其要感谢他们的帮助杰西卡·斯科尔斯和Felicia科德雷亚与细胞分选。这项工作是由CIRM RN2-00904-1,K08 HL074229,美国胸科学会/慢性阻塞性肺病基金会ATS-06-065,值得关注的基金会,加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心胸腔肿瘤计画/肺癌SPORE大学,加州癌症研究协调委员会和格温哈森樱桃纪念实验室(BG)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
的试剂的名称 | 公司 | 目录号 | |
完成媒体10: DMEM-F-12,50/50,1X) | 敏达 | 15-090-CV | |
HEPES(15毫米) | Invitrogen公司 | 15630 | |
碳酸氢钠(3.6毫米或0.03%) | Invitrogen公司 | 25080 | |
(4毫摩尔)L-谷氨酰胺 | 敏达 | 25-005-CL | |
青霉素(100 U / ml的) | 敏达 | 30-001-CI | |
链霉素(100微克/立方米) | 敏达 | 30-001-CI | |
两性霉素B(0.25微克/毫升) | 龙沙 | 17-836R | |
在胰岛素(10微克/毫升) | 西格玛 | I6634 | |
转铁蛋白(5微克/毫升) | 西格玛 | T1147 | |
霍乱毒素(0.1微克/毫升) | 西格玛 | C8052 | |
表皮生长因子(25毫微克/毫升) | BD | 354001 | |
牛垂体提取物(30微克/毫升) | Invitrogen公司 | 13028-014 | |
胎牛血清(5%) | 费舍尔 | SH3008803HI | |
视黄酸(0.05微米) | 西格玛 | R2625 | |
生长因子减少基底膜 | BD | 354230 |
表1。完整的媒体组件。
的试剂的名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
链霉蛋白酶 | 罗氏公司 | 10165921001 | 用于在0.15%: O / N在4°C消化,到提取总的气管细胞(ALI文化) -4小时消化4°C隔离SMG |
中性蛋白酶 | BD Biosciences公司 | 354235 | 16单位:30分钟RT |
DNA酶I | 西格玛 | DN25 | 适用于0.5毫克/毫升: 20-30分钟,在室温下 |
表2。用于气管酶消化酶类。
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