يبحث مختبرنا في التغيرات الأيضية في شبكية العين وفي جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي التي تحدث مع تقدم العمر وكذلك في الأمراض التنكسية العصبية. هدفنا الأسمى هو الاستفادة من هذه النتائج لتحديد أهداف علاجية جديدة لعلاج الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر. غالبا ما يكون الكشف عن امتصاص الجلوكوز في أنسجة الشبكية مكلفا ويستغرق وقتا طويلا ، ويتطلب طرق تصوير معقدة أو حتى مواد مشعة.
أنشأنا هذا البروتوكول لتوفير تقنية جديدة خارج الجسم الحي لقياس امتصاص جلوكوز الفلورسنت التناظري في عينات الشبكية. يوفر البروتوكول الذي طورناه استراتيجية مباشرة وفعالة من حيث التكلفة لقياس امتصاص نظائر الجلوكوز الفلوري خارج الجسم الحي في شبكية العين السليمة بالكامل. هذه الطريقة مفيدة أيضا لأنها تسمح للباحثين بقياس عينات متعددة في وقت واحد.
سيمكن هذا البروتوكول الباحثين من تقييم التغيرات في امتصاص الشبكية لنظائر الجلوكوز الفلورية ، مما سيساعدنا على فهم أفضل لكيفية استخدام شبكية العين للجلوكوز كركيزة نشطة مع تقدم العمر وفي الحالات الصحية والمرضية. للبدء ، قم بإعداد محلول مخزون من خمسة مللي مولار 6-NBDG في خليط من 50٪ DMSO و PBS. قم بتخزين 500 ميكرولتر من المحلول عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.
ضع أنبوبا مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على Neurobasal-A Medium بدون جلوكوز على الثلج. تسمية 1.5 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على أنها تجويع الجلوكوز ، وحضانة 6-NBDG ، والصوتنة ، وجمع العينات لمقايسة الثقب. أضف 100 ميكرولتر من Neurobasal-A Medium المبردة إلى أنابيب الصوتنة المسماة مسبقا على الجليد.
قم بتشغيل قارئ اللوحة. قم بإعداد معلمات اللوحة في برنامج قارئ اللوحة باستخدام ميزة مقايسة نقطة النهاية الفلورية مع ضبط الإثارة على 483 نانومتر، وضبط الانبعاث على 550 نانومتر، وضبط القطع على 530 نانومتر. قم بتخفيف محلول المخزون المكون من خمسة مللي مولار لستة NBDG في Neurobasal-A Media لتحضير محلول عمل 500 ميكرومولار وتغطيته بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء.
ماصة 200 ميكرولتر من محلول العمل في أنابيب حضانة 6-NBDG المسماة مسبقا وتغطيتها كما هو موضح. بعد عزل شبكية العين عن الفأر القتل الرحيم باستخدام ماصة نقل أو ملاقط مشذبة ، انقل شبكية العين إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من وسيط Neurobasal-A لتجويع الجلوكوز. احتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
انقل شبكية العين إلى أنبوب مسمى مسبقا يحتوي على 200 ميكرولتر من 500 ميكرومولار 6-NBDG في وسط Neurobasal-A. احتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. لإعداد معايير 6-NBDG ، قم بتسمية ثمانية أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مليلتر كمعايير من الأول إلى ثمانية.
بالنسبة للجهاز القياسي ، قم بتعبئة 32 ميكرولتر من محلول مخزون 500 ميكرومولار 6-NBDG في الأنبوب المسمى. ثم أضف 368 ميكرولترا من Neurobasal-A Medium إلى الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. قم بتغطية جميع الأنابيب بورق الألمنيوم.
بعد 60 دقيقة من حضانة 6-NBDG ، قم بإزالة الأنابيب من الحمام المائي 37 درجة مئوية. لغسل شبكية العين ، قم بإزالة محلول 6-NBDG باستخدام ماصة دون إزعاج أنسجة الشبكية وأضف 500 ميكرولتر من Neurobasal-A Medium المثلج الطازج على الثلج. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، انقل شبكية العين بعناية إلى أنابيب الصوتنة التي تحتوي على Neurobasal-A Medium على الجليد.
باستخدام مقص تشريح صغير ، قم بتقطيع شبكية العين إلى قطع صغيرة. قم بإجراء صوتنة لكل شبكية العين لمدة خمس إلى 10 ثوان بسعة 10 ، ثم ضع الأنبوب على الفور مرة أخرى على الجليد. الطرد المركزي للعينات عند 21 ، 130 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية إلى طبق سعة 96 بئرا. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة. حدد مقايسة نقطة نهاية التألق بأطوال موجية محددة.
قم بتشغيل الفحص واحفظ النتائج. بعد التشغيل ، قم بتقطيع العينات من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى أنابيب مسبقة التصنيف لمقايسة الثقب. باستخدام معايير بروتين فحص الثقب المخففة مسبقا ، أضف 10 ميكرولتر من كل معيار في نسختين في صفيحة سفلية شفافة 96 بئر.
ثم انقل 10 ميكرولتر من العينة إلى اللوحة. أضف 150 ميكرولترا من كاشف الثقب إلى جميع الآبار التي تحتوي على معايير أو عينات. غطي الطبق واخلطيه على شاكر طبق بسرعة متوسطة لمدة دقيقة واحدة.
احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة وحدد مقايسة نقطة نهاية الامتصاص بطول موجي مضبوطة على 660 نانومتر. قم بقياس امتصاص المعايير والعينات ، واحفظ النتائج وارسم منحنى قياسي لتحديد إجمالي بروتين ميكروغرام في كل عينة.
أظهرت قياسات مضان الجلوكوز زيادة في امتصاص 6-NBDG في شبكية الفأر من النوع البري بعد 30 دقيقة من الحضانة ، وبلغت ذروتها عند 60 دقيقة ، تليها انخفاض في الوحدات التعسفية بعد 90 دقيقة. أدت إضافة مثبط GLUT1 ، الخليج 876 ، إلى تقليل امتصاص 6-NBDG بنسبة 24٪ مما يشير إلى تورط آليات GLUT1 المستقلة في شبكية الفأر من النوع البري.
