وأيد هذا العمل من خلال منحة في والمعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكرة &quot;جرحشاعثزرحشرتاد Neurocircuitry&quot; (رقم 22115002)، و &quot;شبكة علوم الدماغ الشامل&quot; (رقم 221S0003) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم، والتكنولوجيا، اليابان إلى والمنح التي تقدم للمساعدة للعلماء الشباب (B) (رقم 21700344) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى هونج كونج

1. إعداد يرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خطوط الطيران من OK6-GAL4، UAS-ChR2 أو OK6-GAL4، UAS-NpHR2 في قارورة بلاستيكية تحتوي على المواد الغذائية ذبابة القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخميرة انتشار لصق تحتوي على جميع العابر الشبكية (ATR) بتركيزات المناسب (1 ملم لChR2، 10 مم للNpHR2 (&quot;NpHR&quot; قصيرة) على عصير التفاح لوحة آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلتقط الثانية 2 أو 3 يرقات العمر الثالث من قوارير ووضعها على لوحة تحتوي ATR-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفي لهم عند 25 درجة مئوية في الظلام لفترة مناسبة من الوقت (1 اليوم لChR2، 2 أيام عن NpHR.) </li></ol> 2. الإعداد المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق كاميرا CCD (XCD-V60، سوني) إلى المجهر متحد البؤر التقليدية (في حالتنا، FV1000، أوليمبوس) مع مرفق C-جبل (0.35x التكبير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هناك مصراع على طول مسار الضوء من العدسة الشيئية إلى كاميرا CCD، الذي يغلق خلال المسح الضوئي ليزر، إزالته بعناية. وهذه الخطوة يعتمد على صغار جداالتعامل الإعداد، اتصل بالشركة المصنعة المجهر للدعم التقني، إذا لزم الأمر. </li></ol> 3. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف اليرقات ATR التي تغذيها بالماء لإزالة بقايا الطعام من الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقة على طبق المغلفة sylgard، حتى الجانب الظهري (الجانب الظهري لديه اثنين من أنابيب القصبة الهوائية تشغيل طوليا، واحد من جانبي خط الوسط الظهرية). سمك من sylgard حوالي 5MM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج دبوس الحشرات (دبابيس الحشرات أوسترليتز، Φ0.10mm، غير القابل للصدأ) في ذيل بين أنابيب القصبة الهوائية مع ملقط (# 5 اينوكس، FST بواسطة دومون، سويسرا). دبابيس، حوالي طويل 10MM، وينبغي أن تكون عازمة أو خفض إلى أن تكون قصيرة بما فيه الكفاية (~ 2mm في طويل) لتجنب ضرب والإضرار سطح العدسة الهدف. ثم وضع دبوس الحشرات الثانية في رأس يرقة بالقرب من ربط الفم، أسود مخلب مثل هيكل في نهاية الأمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كا 2 + خالية المالحة العادي (كلوريد الصوديوم 140 ملم، بوكل 2 مم، MgCl 2 6 ملم، HEPES-هيدروكسيد الصوديوم 5 ملي،السكروز 36 ملم (pH7.1)) للحفاظ على اليرقة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير بالقرب من الذيل مع مقص الدقيقة (MB-50-7، Napox، اليابان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من شق، وجعل قطع طولية على طول خط الوسط الظهرية نحو الرأس. يجب الحرص على عدم تلف الحبل البطني العصب (VNC) ومحاور عصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير في الرأس جانبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 4 دبابيس في كل ركن من أركان bodywall تشريح. يجب أن تكون الضغوط على جدار الجسم بما يكفي لتصور وجود نمط قطعي من جدار الجسم، ولكن الكثير لم يفت لعرقلة حركة تحوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأعضاء الداخلية باستثناء الدماغ وفنك وشطف العينة مع كا 2 + المالحة طبيعية خالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط اتجاه من الحبل البطني العصب أن يكون متماثل ثنائيا من خلال تغيير الموقف والتوجه من دبابيس الحشرات على جدار الجسم. لتحديد موقف من الحبل البطني العصب، اضافة الى وجود دبوس من خلال الأنسجة بين الدماغ والفم هوك أسفل إلى sylgard. </li> &lt;لى&gt; استبدال المخزن المؤقت مع 2 ملي كا 2 + حل قارع الأجراس (كلوريد الصوديوم 130 ملم، بوكل 5mm، و MgCl 2 2mm في، و CaCl 2 2 مم، HEPES-هيدروكسيد الصوديوم 5 ملم، 36 ملم السكروز (pH7.3)). </li></ol> 4. التصوير مع ليزر الإضاءة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق عدسة شيئية جافة 4X (UPlanSApo 4X، NA 0.16، أوليمبوس، اليابان) في المجهر متحد البؤر وتعيين إعداد يرقة على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة انتقال من إعداد تشريح مع ليزر أحمر (633nm) لتحديد موقع الحبل البطني العصب بواسطة المجهر متحد البؤر. لهذا المسح، تأكد من عدم استخدام الليزر 488nm 559nm أو، الذي يدفع التحفيز غير المرغوب فيها من ChR2 أو NpHR، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) على صورة انتقال. يمكن أن يكون وضع التكبير مفيدة لتقرير مفصل من العائد على الاستثمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير مجموعة من مرشح المجهر لتضيء مع ضوء 488nm 559nm أو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء الضوء على إعداد مع مصباح الهالوجين لتصور جدار الجسم. اليمكن رصدها إعداد البريد مع كاميرا CCD تعلق على المجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الحركة من جدار الجسم والتبديل شعاع الليزر على نحو متقطع في حين رصد الحركة. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+control+of+genetically+designated+neurons+in+functioning+circuits.">Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae.">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).</li><li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+teaching+laboratory:+using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+Drosophila.">Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila.</a> Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).</li><li>Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+neural+circuits+responsible+for+Drosophila+larval+locomotion+with+halorhodopsin.">Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin.</a> PLoS One. 6, e29019 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).</li><li>Hildebrand, E., Dencher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photosystems+controlling+behavioural+responses+of+Halobacterium+halobium.">Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium.</a> Nature. 257, 46-48 (1975).</li><li>Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+long-lifetime+photointermediate+of+s-rhodopsin+is+a+receptor+for+negative+phototaxis+in+Halobacterium+halobium.">Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

اضطراب الزمنية والمحلية من النشاط العصبي هو أسلوب لا تقدر بثمن لتحليل ديناميات شبكة من الدوائر العصبية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة للتلاعب النشاط العصبي بواسطة optogenetics باستخدام الليزر. الاتجاهية العالية ليزر يسمح التحفيز optogenetic أكثر محلية من التحفيز حقل واسع باستخدام الزئبق أو مصباح زينون. على الرغم من إضاءات الليزر وقد تم بالفعل تطبيقها على optogenetics في الدراسات السابقة، ويلزم الاجهزة الخاصة مثل الألياف الزجاجية، مياداة مجهرية، ومصدر ليزر، في معظم الدراسات السابقة. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام الفحص المجهري متحد البؤر التقليدية للإضاءة المحلية. منذ يتم استخدام نظام المجهر متحد البؤر على نطاق واسع، وهذا أسلوب فتح الفرصة لتطبيق optogenetics دقة أعلى في العديد من المختبرات. بروتوكول اثنين من النقاط الحرجة: تشريح اليرقات وقوة الليزر. أولا، إذا كان الدماغ، والحبل البطني العصب أو الأعصاب الحركية تلف الدوريتشريح نانوغرام، فإن اليرقات تظهر أقل أو لا شيء الحركة تحوي عفوية. وبالتالي الدقة أمر ضروري، خاصة عند إجراء شق على الجانب الظهري مع مقص الربيع وإزالة الأعضاء الداخلية مع ملقط. وقد تم الإبلاغ عن تفاصيل حول تشريح سابقا 21. ثانيا، إذا التحفيز يكفي أن يتحقق، طاقة الليزر من حوالي 0.1 ~ 1 ميغاواط / مم 2 للChR2 أو 1 مطلوب ~ 10 ميغاواط / مم 2 للNpHR. قمنا بتقييم قوة الليزر على أساس إجمالي قوة الضوء أدناه عدسة الهدف مقسوما على مساحة تقدر ب إضاءة. قمنا بقياس إجمالي قوة الضوء باستخدام السلطة متر (mobiken، سانوا MI Technos، اليابان). قدرنا مجال الإضاءة لأوقات ثابتة دائري مربع من طول موجة الليزر، والذي يعطي ما يقرب من المنطقة المضاءة في الحد الحيود. قوة الإضاءة فعالة على عينة يمكن تعديل ليس فقط من قبل السلطة من انتاج الليزر، ولكن أيضا عن طريق تغيير سرعة المسح الضوئي وخدرإيه من التكرار. نحن فحص الليزر مع 20-100 μsec / بكسل ل 63 مرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستوى التعبير عن optogenetics البروتين وكمية ATR بالغة الأهمية بالنسبة لكفاءة التحفيز أيضا. وبناء عليه، إذا أظهرت يرقات أي رد optogenetic، يجب فحص النقاط التالية وتصحيحها: 1) قوة الليزر (عن طريق تحسين نظام المجهر)، 2) مستوى التعبير عن optogenetics البروتين (عن طريق فحص الوراثي ودرجة الحرارة تربية)، و 3) كمية من ATR (عن طريق ضبط تركيز ATR وتغذية الفترة). يتطلب NpHR تركيز أعلى من ATR من ChR2 يفعل لأسباب غير معروفة 13. ChR2 يعمل بشكل جيد في يرقات المرباة في الأغذية التي تحتوي على أقل ATR (مثل 0.1 ملم) من وصفها هنا (1 ملم). كما تتغذى اليرقات إلى 1 ملي ATR يكفي لصنع ChR2 الصورة التفاعلي، ونحن نوصي هذا التركيز للمحاكمة لأول مرة في ChR2 التجارب. تركيز ATR يمكن بعد ذلك أن معاير أسفل من 1 ملم. كما أن مدة التعرض لATR، ونحن نوصيمدة صفها هنا من أجل السيطرة optogenetic قوية. ونحن غالبا ما فشلت في مراقبة استجابة optogenetic عند تغذية اليرقات إلى ATR لأقصر مدة. في هذا البروتوكول، ويتم تشغيل إضاءة الليزر والحصول على الصور عن طريق جهاز كمبيوتر منفصلة. لذلك، كشف واضح لنمط الزمانية المكانية من إضاءة الليزر بواسطة كاميرا CCD أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات. إذا بقعة الليزر أو خط قاتمة على الصورة CCD، يجب تحسين قوة مصابيح الهالوجين، وقيمة الربح للكاميرا CCD لتصور إضاءة الليزر مع الحفاظ على جدار الجسم المرئي. إضاءة الزمانية المكانية هو مبين في هذا البروتوكول يوفر معلومات عن الدوائر موتور اليرقات، إلا أن الأسلوب له بعض القيود. كما أن الجانب &quot;المكانية&quot;، والموقع من الإضاءة يتم تسجيلها من قبل منخفضة التكبير CCD الصورة المستخدمة للتصوير بالفيديو الحركات جدار الجسم. وفقا لذلك، يمكن تعيين منطقة الإضاءة في الجزء الرفيع المستوى، ولكن ليس على المستوى الخلوي. وفيما يتعلق &quot;تيemporal &quot;الجانب، تأخر الوقت بين التبديل على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر من قبل والإضاءة بواسطة الليزر يعتمد على نظام المجهر متحد البؤر وحالة المسح، وبالتالي مطلوب بعض التجارب عن طريق التجربة والخطأ لضبط توقيت الإضاءة. منذ توقيت إضاءة يمكن يتحدد في الأفلام صورة CCD باستخدام البرمجيات المناسبة مثل يماغيج، وعاملا حاسما في القرار الزماني هو معدل الإطار من CCD كاميرا التصوير. نحن عادة تعيين معدل الإطار ل7،5 حتي 15 لقطة في الثانية. التقدم في أدوات optogenetic توفر لنا فرصة لتعديل هذا البروتوكول. كنا 3 طريق يرقات العمر حيازة OK6-GAL4 وUAS-ChR2 [H134R] أو UAS-NpHR2. أدوات optogenetic أخرى بدلا من ChR2 [H134R] أو NpHR2 مثل ChR2 [T159C/E123T]، NpHR3 أو قوس يمكن أن تعزز كفاءة الرقابة على النشاط 22. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام GAL4 خطوط أخرى أو تحليل في مراحل النمو الأخرى تقديم مزيد من المعلومات حول محرك داءره<html> TS. في هذا البروتوكول، تم رصد النشاط الحركي من خلال الصور انتقال من الانكماش bodywall مع كاميرا CCD. ويمكن أيضا نشاط الخلايا العصبية الحركية مع جزيئات مضان الكالسيوم الحساسة (مثل GCaMP) يتم رصدها مباشرة في حين التلاعب النشاط العصبي مع ChR2 أو NpHR. في هذه الحالة، يتم استخدام إضاءة الضوء الأزرق في منطقة واسعة وكاميرا CCD حساسة للغاية (على سبيل المثال كاميرا EMCCD) بدلا من مصابيح الهالوجين، والكاميرا CCD طبيعي سابقا الموصوفة هنا. لتحسين القرار المكانية من التحفيز في حين رصد حركة bodywall، وذلك باستخدام عدسة الهدف إضافية قد تكون وسيلة أكثر تقدما: إضاءة من الحبل البطني العصب بواسطة عدسة الهدف التكبير عالية (على سبيل المثال 40X) من فوق العينة ورصد bodywall بواسطة عدسة التكبير منخفضة (على سبيل المثال 4X) أدناه العينة. هذا نظام عدسة مزدوجة قد تسمح لنا لتحفيز الجهاز العصبي في أعلى المكاني القرار. &quot;jove_content&quot;&gt; بروتوكول المعروضة هنا يمكن تطبيقها على الدوائر العصبية الأخرى، وأدوات optogenetic المقدمة يمكن التعبير عنها في الجهاز العصبي ويمكن أن تنشأ في إعداد التي يمكن تسليمها في ضوء كاف في الأنسجة العصبية.

تحرك إلى الأمام تحوي في يرقات ذبابة الفاكهة يحدث من قبل انتشار تقلص العضلات من الخلفي لشرائح الأمامي. ويتحقق هذا الاقتراح من قبل التنشيط متسلسلة من الخلايا العصبية الحركية في الحبل البطني العصب على طول محور الجسم الطولي. لفحص الدوائر وراء هذا النشاط الإكثار منقوشة، يمكن أن اضطراب المحلية من النشاط العصبي يكون نهجا بالمعلومات. على الرغم من أن الفحص الدوائية يمكن السيطرة على مادة معينة، مثل الناقلات العصبية، في الأنسجة العصبية، ويمكن للتأثير المخدرات الدوائية تكون مشابهة بين القطاعات كلها تقريبا لأن اليرقات الحبل البطني العصب هو بنية متكررة تتألف من neuromeres مماثلة على طول المحور الطولي. بدلا من ذلك، يمكن للمرء التعبير عن optogenetic أو جزيئات التحقيق حساسة للحرارة في عدد قليل من القطاعات. ومع ذلك، مثل GAL4 خطوط محددة هي صعبة للغاية لتوليد. ونحن هنا نقدم وسيلة لمعالجة الخلايا العصبية في بضع ثوانىالإدلاء بالبيانات باستخدام إضاءة الليزر. الاستفادة من الإضاءة تقتصر مكانيا في الفحص المجهري متحد البؤر، يمكن للمرء أن التشويش على نشاط الخلايا العصبية في منطقة محلية. جنبا إلى جنب مع نمط التعبير من لجنة التحقيق من قبل مجموعات فرعية من الخلايا العصبية GAL4 خطوط محددة، وهذه الطريقة إضاءة الليزر يحسن إلى حد كبير القرار المكانية للاضطراب. ولأن هذا الأسلوب يتطلب سوى المجهر متحد البؤر التقليدية، وشراء المعدات المختبرية إضافية هو عادة ليس ضروريا. باستخدام هذه التقنية، درسنا دور نشاط الخلايا العصبية الحركية خلال نشر الانتاج موتور 13. من خلال منع أنشطة الخلايا العصبية الحركية في غضون بضعة شرائح أثناء الحركة تحوي، كنا قادرين على اختبار ما إذا كان نشاط الخلايا العصبية الحركية أنفسهم مطلوب لنشر إشارة خرج المحرك. الحصار المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية القبض على انتشار الحركة تحوي. بعد أن تم رفع الحصار، بروظهرت pagation في هذا الجزء حيث أنه تم القبض على الموجة. وتشير هذه الظاهرة التي بدون محرك تنشيط الخلايا العصبية، وموجة توالدي لا يمكن أن تقدم على طول الحبل البطني العصب إلى أبعد من ذلك، وبالتالي تفعيل الخلايا العصبية الحركية ضروري لحركة تحوي. لقد ذكرت سابقا بيانات تفصيلية ومناقشات حول هذه الظاهرة في Inada وآخرون (2011) 13. هنا، نحن تصف طريقة التشويش على النشاط العصبي بشكل تفاعلي حين رصد حركة اليرقات تشريح. باستخدام مختلف GAL4 خطوط وسلسلة من أنماط الزمانية المكانية للتلاعب النشاط، يمكن للمرء أن التحقيق في منطق الدوائر من خلال خصائص استجابة اضطراب من الدائرة الحركية.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

ذبابة الفاكهة اليرقات تحرك هو نظام نموذج رائع في علم الأعصاب التنموية والفسيولوجية، بحكم سهولة الجينية لمكونات الخلايا العصبية الكامنة في الدوائر 1-6. تطبيق optogenetics 7،8 في الدائرة العصبية اليرقات يتيح لنا التعامل مع نشاط الخلايا العصبية في طرق منقوشة مكانيا وزمانيا 9-13. عادة، تضاء العينات على نطاق واسع مع مصباح الزئبق أو الصمام، ويتم التحكم في خصوصية جدا من الخلايا العصبية المستهدفة من قبل ثنائي نظم التعبير الجيني مثل نظام GAL4-UAS 14،15. في هذا العمل، لتحسين القرار المكانية إلى &quot;قرار شبه الوراثية&quot;، ونحن مضيئة محليا مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الحبل البطني العصب باستخدام الليزر تنفيذها في المجهر متحد البؤر التقليدية. في حين رصد حركة جدار الجسم من اليرقات شبه سليمة، ونحن تفعيلها بشكل تفاعلي أو تثبيط النشاط العصبي مع channelrhodopsin 16،17 سR halorhodopsin 18-20، على التوالي. بواسطة مكانيا وزمانيا إضاءة محدودة من الأنسجة العصبية، يمكننا التلاعب في نشاط الخلايا العصبية المحددة في الدائرة في مرحلة معينة من السلوك. وهذه الطريقة مفيدة لدراسة العلاقة بين أنشطة جمعية العصبية المحلية في الحبل البطني العصب ونمط الزمانية المكانية من الناتج المحرك.

<html> تفعيل المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية مع ChR2. عبرنا عن ChR2 في الخلايا العصبية الحركية. محاور عصبية من الخلايا العصبية الحركية الخارجة من كل مشروع الجزء VNC لشريحة المقابلة من جدار الجسم. عندما كنا حفز واحد أو اثنين من قطاعات VNC مع الليزر الأزرق، والعضلات في قطاعات المقابلة أظهرت انكماش (الشكل 1). تثبيط المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية مع NpHR. عبرنا عن NpHR في الخلايا العصبية الحركية. عندما كنا حفز بضعة (1 ~ 2) شرائح من VNC مع ليزر الصفراء في تقلصات العضلات تحوي، ألقي القبض على موجة التكاثر في قطاعات المقابلة من جدار الجسم (الشكل 2). ثم إعادة تشغيل موجة من قطاعات اعتقلت عندما كنا أطفأ إضاءة ليزر 13. 50513fig1.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 1 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 5.5in &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. التنشيط المحلي من الخلايا العصبية الحركية مع ChR2. A. مخطط التنشيط المحلي من إعداد شرائح. بواسطة إضاءة زرقاء ضوء بضعة شرائح من الحبل البطني العصب معربا عن ChR2 في الخلايا العصبية الحركية، ويتم التعاقد مع العضلات في قطاعات المقابلة (رأس السهم). B. الصور انتقال اليرقة تشريح. إضاءة المحلية من الحبل البطني العصب (السهم رؤساء) يدفع انكماش قطعي من عضلات جدار الجسم (السهام). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> الشكل 2. تثبيط المحلية من الخلايا العصبية الحركية مع NpHR. A. مخطط تثبيط المحلية من إعداد شرائح. بواسطة الأصفر-Lإضاءة آيت من بضع شرائح من الحبل البطني العصب معربا عن NpHR في الخلايا العصبية الحركية والعضلات الانكماش خلال عفويا-قعت تحوي الحركة (رأس السهم في الجزء العلوي) وخففت (رأس السهم في القاع.) B. الصور انتقال اليرقة تشريح . إضاءة المحلية من الحبل البطني العصب (رؤساء السهم) خففت بشكل عفوي المتعاقدة مع شرائح جدار الجسم (السهام).

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion at JoVE.com

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

نحن هنا وصف بروتوكول للoptogenetic التلاعب النشاط motoneuronal في حين رصد التغيرات في الناتج المحرك (تقلص العضلات) في شبه سليمة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات باستخدام الليزر في المجهر متحد البؤر التقليدية. هذه التقنية تمكن الباحثون لتحقيق اضطراب المحلية من النشاط العصبي في عدد قليل من neuromeres لتوضيح ديناميات الدوائر الحركية.

Optogenetic اضطراب النشاط العصبي مع إضاءة الليزر في شبه سليمة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات في الحركة

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K Views.  The University of Tokyo. نحن هنا وصف بروتوكول للoptogenetic التلاعب النشاط motoneuronal في حين رصد التغيرات في الناتج المحرك (تقلص العضلات) في شبه سليمة ذبابة الفاكهة اليرقات باستخدام الليزر في المجهر متحد البؤر التقليدية. هذه التقنية تمكن الباحثون لتحقيق اضطراب المحلية من النشاط العصبي ?...

Video: Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

الجمع بين السلوكية الغدد الصماء والاقتصاد التجريبي : التيستوستيرون والاجتماعي اتخاذ القرار

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

مشهي التعلم النقابي في الشم<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

طرق تسجيل متعددة الوحدات لوصف النشاط العصبي في الجراد (<em&gt; الجراد الصحراوي أمريكانا</em&gt;) الدوائر الشم

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

العصبية آخر نشر في إعداد الحصين تكشفت مع اختراق الصغرى، والقطب صفيف

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

خارج الخلية تسجيل النشاط العصبية جنبا إلى جنب مع Microiontophoretic تطبيق المواد Neuroactive في الفئران مستيقظا

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

رواية الفحص لالباردة حس الألم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...