نحن نحاول تحديد أفضل طريقة لاستخدامها للتنبؤ بأهمية الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء. يبدو أن مقايسة الخلية الأحادية والبلاعم أكثر حساسية من مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية. لذا فإن الأسئلة التي نحاول الإجابة عليها هي ما إذا كان اختبار الخلية الأحادية والبلاعم هو اختبار أفضل للتنبؤ بأهمية الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء ، أفضل من مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية.
تعمل التحديات التجريبية مع كل من مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية ومقايسة الخلية الأحادية والبلاعم على تحسين كفاءتها لتمكين الإكمال بشكل أسرع ، مع التخلص من الحاجة إلى التقييم اليدوي للبلعمة. بمعنى آخر ، يكمن التحدي في محاولة شبه أتمتة هذه الفحوصات. تم استخدام مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية ، التي كنت رائدة فيها في الواقع ، في عام 1980 ، بشكل روتيني من قبل المختبر المرجعي لأمراض الدم المناعية منذ عام 1983 للمساعدة في تحديد الأجسام التلقائية أو المضادة لخلايا الدم الحمراء التي لديها القدرة على التسبب في انحلال الدم عند نقل دم المتبرع إلى المرضى الذين لديهم هذه الأجسام المضادة.
لذلك يستخدم MMA الخلايا الوحيدة في الفحص ، ولكن انحلال الدم بوساطة الأجسام المضادة يحدث عادة بسبب البلاعم في الطحال أو الكبد. لذلك نحن هنا نستكشف ما إذا كان استخدام البلاعم الأولية في هذا الاختبار سيكون أفضل من الخلايا الوحيدة كمتنبئ بالأهمية السريرية المحتملة للأجسام المضادة. محاولة جعل مقايسة الخلية الأحادية والبلاعم أكثر سهولة في الاستخدام وأسرع ولا تتطلب مجهريا ضوئيا ، ولكن ربما يكون من المرغوب فيه وجود آلية آلية لقراءة البلعمة.
للبدء ، قم بتخفيف الدم بالكامل باستخدام RPMI-1640 Complete Medium ، وقم بوضعه على وسط تدرج الكثافة للطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، استرجع الطبقة المصفرة التي تحتوي على خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو PMBCs. بعد تكوير PBMCs التي تم الحصول عليها ، أعد تعليقها في 10 ملليلتر من RPMI-1640 الوسط الكامل الدافئ مسبقا.
حدد رقم الخلية باستخدام المعدات المناسبة قبل البدء في عملية عزل الخلايا الأحادية. اتبع تعليمات مجموعة عزل الخلايا الأحادية وانقل العينة إلى أنبوب البروبيلين بالحجم المناسب. أضف كوكتيل التخصيب إلى العينة بتركيز 50 ميكرولتر لكل مليلتر من العينة.
بعد سحب العينة لأعلى ولأسفل ، قم بدوارها لخلطها جيدا واحتضان العينة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة 10 دقائق في دلو ثلج. الآن ، قم بدوامة الجسيمات المغناطيسية لمدة 30 ثانية خلال فترة الحضانة هذه. بعد الحضانة ، أضف جزيئات مغناطيسية إلى العينة بتركيز 100 ميكرولتر لكل مليلتر من العينة.
قم بتدوير العينة واحتضانها عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف وسيط العزل لزيادة الحجم إلى 2.5 مل أو 10 مل حسب الحاجة ، باستخدام ماصة متدرجة ، واخلطها. بعد ذلك ، ضع أنبوب البروبيلين بدون غطاءه في المغناطيس واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 دقيقة تقريبا.
بعد ذلك ، التقط المغناطيس ومقلوب بحركة واحدة مستمرة لصب تعليق الخلية في أنبوب جديد سعة 5 أو 14 مل. أعد تعليق الخلايا المعزولة في RPMI-1640 Medium. للبدء ، أضف خمسة ملليلتر من محلول poly-D-lycine إلى قارورة سعة 25 مليلتر لكل مجموعة من البلاعم ، M1 و M2 ، واترك القوارير في غطاء المحرك لمدة ساعة واحدة على الأقل.
بعد تحديد عدد الخلايا ، أضف خمسة ملليلتر من RPMI-1640 Medium ، ثم قم بالبذور ما بين مرة إلى خمس مرات ، 10 إلى قوة ستة خلايا وحيدة في كل قارورة مشفرة مسبقا سعة 25 مل. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين على الأقل. بعد فترة الحضانة ، اغسل القارورة مرة واحدة باستخدام PBS ، ومرتين باستخدام RPMI-1640 Medium الكامل.
أضف 10 مل من وسط التمايز M1 أو M2 إلى القارورة حسب نوع الخلية المطلوب ، واترك الخلايا تتمايز في الحاضنة لمدة ستة أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم السادس ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الاستقطاب M1 أو M2 إلى كل قارورة حسب الحاجة. دع البلاعم تستقطب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين على الأقل.
قبل حصاد البلاعم M1 أو M2 في اليوم الثامن ، اجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 15 مليلتر لاستخدامها مرة أخرى ، إذا لزم الأمر. أضف ملليلترا واحدا من محلول انفصال الخلية إلى القارورة ، واحتضنها. لإيقاف التفاعل ، أضف ثلاثة ملليلتر من RPMI-1640 Medium الكامل إلى القارورة واجمع الوسائط في أنبوب سعة 15 مل.
بعد إضافة ثلاثة ملليلتر أخرى من الوسط إلى القارورة ، استخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا عن القاع. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب جديد سعة 15 مل. لتحديد جودة البلاعم M1 و M2 ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وأعد تعليقها في وسط RPMI-1640 الكامل عند 0.5 مرة ، 10 إلى قوة ست خلايا لكل أنبوب.
بعد ذلك ، قم بتحليل مجموعتين من الخلايا باستخدام مقايسة قياس التدفق الخلوي. عد الضامة M1 و M2 التي تم الحصول عليها باستخدام مقياس كثافة الدم بنسبة تلطيخ واحد إلى واحد مع التريبان الأزرق. أعد تكوين البلاعم بتركيز 1 في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر في RPMI-1640 الوسط الكامل.
باستخدام ماصة دقيقة ، قم بزرع 400 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من شريحة غرفة الآبار الثماني واحتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 1.5 ساعة على الأقل في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة بالكامل. لغسل كرات الدم الحمراء R2R2 الموجبة RhD ، أضف PBS عند درجة الحموضة 7.4 إلى الخلايا وقم بالطرد المركزي للعينة عند 350 جم لمدة خمس دقائق. بعد غسلتين أخريين من هذا القبيل ، قم بإجراء عينة اختبار كرات الدم الحمراء بالأجسام المضادة ذات الأهمية.
احتضان كرات الدم الحمراء المضادة المضادة وغير المضادة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. الدوامة بشكل متقطع كل 15 دقيقة لمنع كرات الدم الحمراء من الاستقرار. ثم اغسل كرات الدم الحمراء المرجعية ثلاث مرات باستخدام PBS عند درجة الحموضة 7.4 كما هو موضح سابقا.
للتحقق من وجود مثيل كرات الدم الحمراء ، قم بإجراء اختبار مضاد للجلوبولين غير المباشر مع جسم مضاد مضاد للإنسان مضاد ثانوي للجسم المضاد المضاد الأولي. بعد قراءة اختبار مضادات الغلوبولين غير المباشر ، أعد تكوين RHD المغسول بالإضافة إلى كرات الدم الحمراء R2R2 في حجم 1.25٪ من حيث الحجم مع RPMI-1640 Complete Medium. بعد حضانة 1.5 ساعة من الضامة M1 و M2 ، قم بشفط والتخلص من الوسط الطافي برفق على طول زاوية البئر.
ثم أضف 400 ميكرولتر من خليط كرات الدم الحمراء المضاد بنسبة 1.25٪ إلى كل بئر من الإعداد الثلاثي. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين دون إزعاج. الآن صب 100 مل من PBS عند درجة الحموضة 7.4 في كوبين.
اغمر الشريحة في الدورق الأول وحركها ذهابا وإيابا ببطء لمدة 20 إلى 30 ضربة. ثم انقل الشريحة إلى الدورق الثاني واغسلها لمدة 20 إلى 30 ضربة. قم بإزالة الشريحة من PBS وامسح السائل الزائد على منشفة ورقية.
اغمر الشريحة في 100٪ ميثانول لمدة 45 ثانية لإصلاح الخلايا. جفف الشريحة بالهواء وقم بتثبيتها باستخدام وسيط تركيب معد داخليا. أضف زلة الغطاء واترك الشريحة تجف طوال الليل قبل تحديد كمية البلعمة.
تم استقطاب البلاعم M1 و M2 بنجاح واستزراعها لمدة ثمانية أيام مع سمات مورفولوجية مميزة لوحظت في صور الفحص المجهري. في قياس التدفق الخلوي ، أظهرت البلاعم M1 حوالي 86.1٪ تعبير عن CD80 و 0.17٪ تعبير عن CD209. عرضت البلاعم M2 97.3٪ من تعبير CD209 و 0.003٪ من تعبير CD80.
أكدت الرسوم البيانية لكثافة التألق تعبيرا أعلى عن CD80 في البلاعم M1 مقارنة بالضامة M2. بينما أظهرت البلاعم M2 تعبيرا أعلى بكثير عن CD209 مقارنة بالضامة M1. أظهرت البلاعم M2 مؤشر البلعمة أعلى بكثير مقارنة بالضامة M1.
أظهرت صور الفحص المجهري دليلا واضحا على زيادة البلعمة في البلاعم M2 مقارنة بالضامة M1. تهدف هذه الدراسة إلى تقييم إمكانية استخدام البلاعم بدلا من الخلايا الوحيدة للتنبؤ بأهمية الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء. يوضح هذا الجدول أن البلاعم M2 البلعمة أفضل من البلاعم M1 أو الخلايا الوحيدة التي تعتبر ذات أهمية سريريا.
وبالتالي ، مع مزيد من الدراسة ، يمكن استخدام اختبار باستخدام البلاعم M2 للتنبؤ بشكل أفضل بالأهمية السريرية للأجسام المضادة.
